閆百玲，閆德明

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)建設(shè)項(xiàng)目管理站，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

葡萄是世界第二大水果，有著悠久的栽培歷史[1]。我國(guó)西北地區(qū)具有栽培葡萄得天獨(dú)厚的自然條件[2]，為解決傳統(tǒng)育苗周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，利用植物組織培養(yǎng)進(jìn)行外植體系的建立迫在眉睫。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄組織培養(yǎng)的研究越來(lái)越多，其中利用“組培法”提高苗木繁殖系數(shù)的研究備受重視[3-4]。葡萄扦插技術(shù)不能獲得大量的脫毒苗，傳統(tǒng)的育種技術(shù)很難獲得抗病葡萄品種，組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)葡萄無(wú)病毒株系建立、轉(zhuǎn)基因葡萄育種研究提供了技術(shù)支持[5]。僅僅依靠扦插繁殖和莖尖培養(yǎng)難以滿足生產(chǎn)需要，單芽莖段繁殖為葡萄苗木的大量繁殖提供了一個(gè)新的有效的方法和途徑[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料預(yù)處理和消毒

選取4 年生葡萄植株，剪取春季萌發(fā)的新梢，選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的紅地球和陽(yáng)光玫瑰枝條，所剪取的枝條長(zhǎng)勢(shì)旺盛，枝條芽點(diǎn)飽滿，用2 封報(bào)紙包好，注明品種后迅速拿回實(shí)驗(yàn)室，用滅過菌的剪刀將新梢剪成5～6 cm 帶腋芽的單芽莖段，在剪的過程中剪除葉片留下葉柄，然后將紅地球和陽(yáng)光玫瑰2 個(gè)品種單芽莖段放在已消毒的燒杯內(nèi)，并用紗布包扎好，注明品種名，流水沖洗3 h，倒完積水后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用火焰滅菌的剪刀剪去病蟲枝、傷殘枝、小葉片后，將其剪成短于廣口瓶的枝條，放入經(jīng)干燥滅菌的廣口瓶中。

倒入無(wú)菌水沖洗和浸泡1 次，倒出無(wú)菌水加入70%酒精，浸泡并搖動(dòng)10 s；迅速倒出酒精加2%次氯酸鈉溶液浸泡8 min，并搖動(dòng)；倒出次氯酸鈉并用0.1%升汞浸泡，3 個(gè)處理各搖動(dòng)3 min、5 min、7 min倒出，用無(wú)菌水沖洗5 次。最后將消毒的枝條取出，放入滅過菌鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中吸干水，每個(gè)處理只用1 個(gè)培養(yǎng)皿，并再用無(wú)菌剪刀剪除受傷斷面，最后留2 cm 左右，注意枝條的滅菌消毒過程必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作。

1.2 消毒處理方法

處理A：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞3 min；處理B：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞5 min；處理C：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞7 min。

1.3 外植體轉(zhuǎn)接

消毒完畢后，在無(wú)菌條件下用剪刀將枝條剪成2.0 cm 左右的單芽莖段，下段梢長(zhǎng)、上段較短，但剪口距芽至少0.5 cm。再用鑷子將其豎直插入改良B5培養(yǎng)基中。插完后在火焰上旋轉(zhuǎn)數(shù)秒，立即塞嚴(yán)棉塞和包頭紙，并在瓶體外寫明品種名稱、編號(hào)，然后將其放置于環(huán)境溫度25±3 ℃、相對(duì)濕度70%左右、每日光照2 000 lx 以上、12～18 h 的培養(yǎng)室中進(jìn)行初代培養(yǎng)。

1.4 測(cè)定

1.4.1 測(cè)定時(shí)間 接種4 d 后開始觀測(cè)污染、萌芽、生根以及株高情況，污染率每天觀測(cè)1 次，共4 次。接種5 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、生根率、株高，并每隔3 天觀測(cè)1 次，共4 次。

1.4.2 污染率測(cè)定 統(tǒng)計(jì)污染瓶數(shù)。

1.4.3 發(fā)芽率測(cè)定 記錄發(fā)芽個(gè)數(shù)。

1.4.4 生根率測(cè)定 統(tǒng)計(jì)生根數(shù)量。

1.4.5 累計(jì)根長(zhǎng)測(cè)定 對(duì)接種10 d 后的12 d 內(nèi)累計(jì)根長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定（每隔3 天觀測(cè)1 次，共4 次）

統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)并計(jì)算累計(jì)根長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)消毒處理中，處理B、處理C 消毒的外植體，在無(wú)菌水清洗過程中有較多的幼嫩組織和殘?jiān)S無(wú)菌水流出，顏色發(fā)黃；而處理A 的沖洗水較澄清，初步說(shuō)明高濃度的、長(zhǎng)時(shí)間的消毒處理已殺死部分幼嫩組織；2 個(gè)品種的處理C 外植體幼嫩莖處略發(fā)黑。

根據(jù)日常的觀察和測(cè)量所知，剛剛接種后的前幾天內(nèi)植株生長(zhǎng)很弱，尤其是7 min 升汞處理下的外植體，葉片發(fā)育不全、畸形生長(zhǎng)，葉緣發(fā)黑，明顯受到升汞等消毒試劑的毒害。試管苗的大量生根從接種10 d 后開始，并且主根如果沿順時(shí)針方向延伸，則須根沿逆時(shí)針方向延伸，根系以最大限度的利用空間，當(dāng)根系長(zhǎng)到大概1.5 mm時(shí)，開始長(zhǎng)須根，并且須根成對(duì)排列。供試試管苗的根系到接種后25 d 左右，根粗達(dá)到最大值，此后基本上不再增粗，以大量長(zhǎng)須根為主，并且根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，最粗主根達(dá)到3 mm，是紅地球品種的處理B。

試管苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)也不一致。有些試管苗已發(fā)芽，但始終沒有生根，此類不生根的試管苗隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)葉片發(fā)黃失綠，株高生長(zhǎng)到一定程度就不再生長(zhǎng)，玻璃化現(xiàn)象多發(fā)生在不生根的試管苗內(nèi)。不生根的試管苗生長(zhǎng)與外植體的大小、粗細(xì)有關(guān)。越粗、越長(zhǎng)的外植體株高越高。由此可以判斷，外植體在未生根以前是利用外植體內(nèi)儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)供芽生長(zhǎng)，等到材料內(nèi)儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡，植株停止生長(zhǎng)，并漸漸出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

已發(fā)芽的生根試管苗和不生根試管苗，葉片從葉緣葉尖處發(fā)黃，表現(xiàn)出缺少微量Mn 等元素癥狀，但是此后的培養(yǎng)使已生根的試管苗逐步恢復(fù)綠色，葉片逐漸變?yōu)檎Ｈ~片，而未生根的試管苗，葉片葉緣葉尖黃化越來(lái)越嚴(yán)重。由此可知，所采集的外植體材料本身就缺少M(fèi)n 等微量元素，而已生根的植株可以通過根系吸收培養(yǎng)基中的微量元素以緩解葉片葉緣葉尖黃化。

外植體材料的粗細(xì)和大小對(duì)本試驗(yàn)影響也較大。瘦弱的外植體基本不發(fā)芽、不生根、剪切口處局部發(fā)黑，酒精等試劑對(duì)材料的傷害嚴(yán)重。不生根的試管苗主要是外植體基部發(fā)黑，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織也逐漸發(fā)黑，說(shuō)明材料的粗細(xì)和大小對(duì)不同的消毒處理方式很敏感。

外植體先長(zhǎng)出愈傷組織，然后從愈傷組織中分化出根，并且愈傷組織越多，愈傷組織越白、越干凈，生根越多、越粗、越長(zhǎng)，根系越發(fā)達(dá)。

2.1 不同消毒方式對(duì)污染率的影響

紅地球品種的處理中，處理C 的效果最好，污染率為0，處理A 效果最差，污染率為33.3%，平均污染率為13.3%；陽(yáng)光玫瑰的處理中，處理B 的效果最好，污染率為10%，處理A 效果最差，污染率為54.5%，平均污染率為34.8%。說(shuō)明紅地球葡萄品種外植體材料容易消毒，隨著消毒時(shí)間的增加，消毒效果越好，污染率逐漸降低（圖1、圖2）。

圖1 紅地球綜合指標(biāo)統(tǒng)計(jì)

圖2 陽(yáng)光玫瑰綜合指標(biāo)統(tǒng)計(jì)

2.2 不同消毒方式對(duì)發(fā)芽率的影響

紅地球品種的3 個(gè)處理中，處理B 的效果最好，發(fā)芽率達(dá)到92.3%；陽(yáng)光玫瑰的3 個(gè)處理中，也是處理B 效果最好，發(fā)芽率達(dá)到80%。紅地球品種的平均發(fā)芽率為91.3%，陽(yáng)光玫瑰的平均發(fā)芽率為64.5%。說(shuō)明5 min 0.1%升汞處理下，對(duì)外植體芽的生長(zhǎng)最利。處理時(shí)間過長(zhǎng)，材料容易受升汞毒害，芽的萌發(fā)推遲，甚至不發(fā)芽；處理時(shí)間過短，消毒不徹底，材料帶菌，仍不發(fā)芽（圖1、圖2）。

2.3 不同消毒方式對(duì)生根率的影響

紅地球品種的處理中，處理C 的效果最好，生根率為80%，處理B 的效果最差，生根率為30.8%，平均生根率為48%；陽(yáng)光玫瑰的處理中，處理C 的效果最好，生根率為30%，效果最差的為處理A，生根率為0%，平均生根率為16.7%。說(shuō)明7 min 升汞處理下的外植體材料，生根效果最好（圖1、圖2）。

2.4 不同消毒方式對(duì)累計(jì)根長(zhǎng)的影響

紅地球處理C 的效果最好，12 d 的累計(jì)根長(zhǎng)為21.8 cm，效果最差的為處理B，累計(jì)根長(zhǎng)為12.5 cm，紅地球品種的平均累計(jì)根長(zhǎng)為16.4 cm；陽(yáng)光玫瑰品種的處理中，效果最好的也是處理C,累計(jì)根長(zhǎng)為17.4 cm，效果最差的為處理A，累計(jì)根長(zhǎng)為0 cm，平均累計(jì)根長(zhǎng)為8.2 cm（圖3、圖4）。

圖3 紅地球立即根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)

圖4 陽(yáng)光玫瑰累計(jì)根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)

2.5 綜合分析

綜合觀測(cè)指標(biāo)顯示：在70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min 消毒的基礎(chǔ)上，7 min 升汞處理對(duì)紅地球和陽(yáng)光玫瑰品種處理效果最佳。7 min 升汞處理下，2 個(gè)品種的污染率、發(fā)芽率、生根率、累計(jì)根長(zhǎng)等綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良，植株長(zhǎng)勢(shì)迅速，生根量多。其中，紅地球品種的污染率低于陽(yáng)光玫瑰，發(fā)芽率高于陽(yáng)光玫瑰，平均累計(jì)根長(zhǎng)長(zhǎng)于陽(yáng)光玫瑰。在3 min、5 min、7 min 0.1%升汞處理下，隨著消毒時(shí)間的增加，外植體的污染率明顯降低，并且污染率低的成活率高。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

影響外植體污染的因素：一是消毒不徹底；二是外植體的大小和取材季節(jié)的影響，越靠近基部較低部位的外植體，污染率越低，莖尖最好，莖段最廣泛；三是器官的生理狀態(tài)和生理年齡，生理年齡越小，越易誘導(dǎo)根和芽的發(fā)生[4]；四是幼嫩的枝條越容易消毒，污染率越低；五是修剪過程中機(jī)械損傷越少，污染率越低；六是多年生木本植物和大田作物帶菌多，污染率較高。

影響外植體發(fā)芽的因素：一是莖芽和根的分化取決于生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素的比例[8]；二是培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素濃度過高會(huì)抑制芽的形成[9]；三是供試材料的生理狀態(tài)和芽的飽滿程度，外植體中儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)越多，越容易發(fā)壯芽。

影響試管苗生根的因素：一是外植體材料；二是基本培養(yǎng)基[10]；三是植物激素，一般生長(zhǎng)素類能促進(jìn)生根；四是繼代培養(yǎng)代數(shù)；五是黑暗中培養(yǎng)比光照培養(yǎng)下更容易產(chǎn)生不定根[11]。

本試驗(yàn)在統(tǒng)計(jì)過程中存在一些誤差，主要受外植體材料的大小、粗細(xì)的影響。以后的研究中應(yīng)將各外植體按粗細(xì)、大小平均分級(jí)，按不同粗細(xì)程度確定最佳消毒時(shí)間。

此次消毒只是針對(duì)外植體材料表面滅菌，未能消滅材料內(nèi)部細(xì)菌，未降低污染率，可在培養(yǎng)基中加入抗生素以降低污染。

為證實(shí)試管苗的污染是由材料帶菌還是培養(yǎng)環(huán)境本身有菌，應(yīng)在培養(yǎng)架上放置一個(gè)空培養(yǎng)基，其內(nèi)不接任何外植體，最后觀察該空培養(yǎng)基的污染狀況。為降低污染，應(yīng)在培養(yǎng)前用70%酒精在空氣中噴霧，殺死空氣中的部分細(xì)菌。

消毒后，用剪刀剪除一部分受傷斷面后，接種后仍有一部分莖段斷面發(fā)黑，說(shuō)明材料的粗細(xì)程度和消毒液的滲透速度有關(guān)，如果能夠把握住材料粗細(xì)和消毒液在組織內(nèi)的滲透速度以及滲透速度的關(guān)系后，材料基部發(fā)黑和只發(fā)芽不生根的現(xiàn)象也許會(huì)扭轉(zhuǎn)。

3.2 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明：70%酒精10 s+2%次氯酸鈉8 min+0.1%升汞7 min 處理下污染率低，生根率、發(fā)芽率、成活率高；外植體材料粗，芽眼越飽滿，污染率越低，成活率越高。