符舒琦，涂蓉，劉夢嬋，洪雅敏，李韓建，尤曉光

癌癥已成為當(dāng)前世界威脅人類健康和生命的嚴(yán)重疾病之一[1]。如何早期診斷并治療腫瘤是分子影像學(xué)研究熱點(diǎn)之一。磁性氧化鐵納米粒子(iron oxide nanoparticles，IONP)是一種多功能磁性納米材料，當(dāng)其粒徑在5～100 nm時(shí)具有超順磁性，可作為磁共振成像(MRI)、生物催化活性(納米酶)以及藥物遞送等多功能的診療工具，IONP合成相對(duì)簡單、生物相容性好，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的表面修飾，增加水溶性并偶連靶向分子，因此可用于腫瘤磁共振顯像及治療[2-3]。C60(fullerene，富勒烯)有著獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，是近年來被廣泛用作腫瘤光動(dòng)力治療(photodynamic therapy，PDT)的光敏劑[4-5]。GE11(氨基酸序列YHWYGYTPQNVI)是首個(gè)對(duì)表面生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)具有高親和力的人工合成小分子多肽[6]。EGFR受體高表達(dá)于上皮源性腫瘤細(xì)胞，與人類多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。PDT是指通過特定波長的激光照射靶組織使其產(chǎn)生單線態(tài)氧、羥基自由基、過氧化氫等活性氧(reactive oxygen species，ROS)物質(zhì)[8]。本研究化學(xué)合成C60-IONP-GE11靶向多功能MRI對(duì)比劑(圖1)，觀察其體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR靶點(diǎn)靶向成像及PDT治療作用，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料和設(shè)備

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231來源于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)；靶向小肽GE11(QKYHWYGYTPQNVIQK)和隨機(jī)小肽(random peptide，RP)(TQRKGKTHRKPHKTKT)由上海吉爾多肽有限公司合成。相關(guān)試劑和試劑盒：FBS、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、0.25%胰酶、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、增強(qiáng)型CCK-8試劑盒、ROS檢測試劑盒(Beyotime Biotechnology)；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合液(索萊寶)；Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物)。設(shè)備采用激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000，日本)，3.0T MRI和膝關(guān)節(jié)線圈(Siemens，德國)，多功能酶標(biāo)儀(SynergyHTX，美國)，532 nm激光器(Oxlasers，上海)。

2.方法

①驗(yàn)證EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞株：免疫熒光染色：取人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)接種于共聚焦培養(yǎng)皿中(1×105個(gè)/培養(yǎng)皿)，37℃，5% CO2孵育24 h。4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗；加入500 μL染色封閉液封閉30 min；吸掉封閉液后培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足量1:200稀釋的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜后加入比例為1：500稀釋的熒光二抗，室溫孵育1 h后用PBS浸洗，加200 μL DAPI熒光染料孵育5 min進(jìn)行核復(fù)染，最后吸水紙吸干皿內(nèi)液體在激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

②體外MRI成像實(shí)驗(yàn)及普魯氏藍(lán)染色實(shí)驗(yàn):體外MRI掃描：取MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，將其隨機(jī)分為兩組：C60-IONP-GE11(實(shí)驗(yàn)組)和C60-IONP-RP(非靶向隨機(jī)小肽對(duì)照組)，分別配備200 μL濃度為25、50、100、200、400 μg/mL的溶液與MDA-MB-231共孵育2 h，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗三次，細(xì)胞鏟收集孔內(nèi)細(xì)胞，加入2 mL PBS 吹打重懸后加入等體積的1%瓊脂糖溶液進(jìn)行MR 掃描并測量T2值。采用3.0T MR掃描儀，并選用膝關(guān)節(jié)線圈，T2加權(quán)自旋回波成像序列，參數(shù)：TR 1000 ms，TE 140 ms，視野(FOV)22 cm×22 cm，層厚0.6 mm，矩陣384×384。

普魯士藍(lán)染色法(鐵染色)：取MDA-MB-231細(xì)胞接種于爬片中，隨機(jī)將其分為兩組：C60-IONP-GE11靶向?qū)Ρ葎?實(shí)驗(yàn)組)和C60-IONP-RP非靶向?qū)Ρ葎?對(duì)照組)，加入1.5 mL濃度為200 μg/mL的C60-IONP-GE11或C60-IONP-RP對(duì)比劑溶液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下孵育12 h。加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS潤洗3次。普魯氏藍(lán)染色試劑盒，1:1體積比例混合鹽酸與亞鐵氰化鉀溶液細(xì)胞染色30 min后，PBS充分洗滌3次，再加伊紅染色液淡染細(xì)胞核15 min，PBS潤洗5 s后脫水透明、樹膠封固。

表1 C60-IONP-GE11實(shí)驗(yàn)組和C60-IONP-RP對(duì)照組處理后的MDA-MB-231細(xì)胞的T2值

③細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231以5×103個(gè)/孔(100 μL/孔)接種到96孔板中，待細(xì)胞充分貼壁分別加入100 μL不同濃度梯度的C60-IONP-GE11，并按照濃度梯度分為以下7組：0 μg/mL(完全培養(yǎng)基空白對(duì)照組)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL，每個(gè)濃度梯度設(shè)置無細(xì)胞的C60-IONP-GE11對(duì)比劑對(duì)照孔作為背景值，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下孵育24 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm處的吸光度(optical density，OD)，按照計(jì)算公式：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-實(shí)驗(yàn)組背景孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-對(duì)照組背景孔OD值)計(jì)算細(xì)胞存活率。

④體外光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)：CCK8(Cell Counting Kit-8，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑)檢測：將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231以5×103個(gè)/孔(100 μL/孔)接種到96孔板中，每孔需間隔1個(gè)空白孔以便進(jìn)行光照，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下孵育使其充分貼壁。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)分組：①空白激光組(完全培養(yǎng)基)；②C60-IONP-GE11無激光組；③C60-IONP-RP+激光組；④C60-IONP-GE11+激光組。②③④組加入10 μL濃度為200 μg/mL的C60-IONP-GE11或C60-IONP-RP對(duì)比劑溶液，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，37℃，5% CO2環(huán)境孵育24 h。光照：吸出培養(yǎng)基，PBS輕柔潤洗2次洗去未結(jié)合對(duì)比劑，①③④組暴露于532 nm，100 mW/cm2激光下照射20 min，再孵育12 h；隨后每孔加入10 μLCCK8，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制曲線。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測：將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231以每皿1×104個(gè)接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)分組：①空白激光組(完全培養(yǎng)基)；②C60-IONP-GE11無激光組；③C60-IONP-RP+激光組；④200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；⑤400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；⑥800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組。按照分組加入對(duì)應(yīng)溶液，每組加入50 μL比例為1:1000稀釋后的DCFH-DA探針，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，PBS洗滌3次以洗去未結(jié)合探針；①③④⑤⑥組暴露于532 nm，100 mW/cm2激光照射20 min，共聚焦顯微鏡下觀察活性氧產(chǎn)生情況，并使用Image J軟件對(duì)熒光結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

3.統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，體外細(xì)胞光動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)使用Dunnett-t檢驗(yàn)比較各組間差異，體外毒性實(shí)驗(yàn)和Image J半定量分析熒光強(qiáng)度，使用Tamhane’s T2檢驗(yàn)比較各組間差異。

結(jié) 果

1.C60-IONP-GE11表征

透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)可見C60-IONP-GE11形態(tài)呈類球形，大小基本一致(圖1a)，動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)測得IONP的水化直徑為(29.4±2.1)nm，C60-IONP-GE11的水化直徑為(37.7±3.2)nm(圖1b、d)，Zeta電位顯示IONP電位為(38.8±0.4)mV，C60-IONP-GE11電位為(-35.9±0.7)mV(圖1c、d)；傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)顯示，羧基富勒烯在3000 cm-1左右形成大而寬的峰，且以3000 cm-1為中心對(duì)稱，是締合羧基的吸收，1433 cm-1、1191 cm-1、525 cm-1是C60的特征峰，578 cm-1是Fe-O特征振動(dòng)峰，多巴胺修飾的Fe3O4在3400 cm-1、1597 cm-1、1265 cm-1出現(xiàn)氨基的吸收峰，C60-IONP-GE11在3419 cm-1的吸收峰是v(-NH2)和v(-OH)的疊加，在1733 cm-1、1672 cm-1、0～1200 cm-1等出現(xiàn)多個(gè)酰胺鍵中強(qiáng)特征峰(圖2a)，綜上可以看出C60和GE11被偶聯(lián)在磁性顆粒的表面；磁滯曲線顯示C60-IONP-GE11與IONP有相似的磁飽和強(qiáng)度(圖2b)。

2.EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞株的篩選

免疫熒光結(jié)果顯示，DAPI染液將細(xì)胞核染成藍(lán)色，MDA-MB-231細(xì)胞膜上有大量Cy3熒光(圖3)。

圖1 C60-IONP-GE11的A)TEM;B)DLS;C)Zeta電位;D)Zeta電位統(tǒng)計(jì)表。 圖2 a)C60-IONP-GE11合成FTIR圖；b)IONP和C60-IONP-GE11磁化曲線。

3.體外MRI成像實(shí)驗(yàn)及普魯氏藍(lán)染色實(shí)

為了評(píng)價(jià)多功能對(duì)比劑C60-IONP-GE11的靶向性和成像能力，對(duì)EGFR高表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行體外MR成像。C60-IONP-GE11濃度為100 μg/mL時(shí)，T2WI開始出現(xiàn)負(fù)性強(qiáng)化，隨著濃度增加，T2WI信號(hào)降低，非靶向隨機(jī)小肽C60-IONP-RP對(duì)照組未見明顯負(fù)性強(qiáng)化(圖4)。表1示，分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組濃度與T2值的相關(guān)性，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的濃度與T2值均呈負(fù)相關(guān)(R值為-0.928、-0.540，表1)，其中實(shí)驗(yàn)組的相關(guān)性較對(duì)照組更強(qiáng)，并可得實(shí)驗(yàn)組線性回歸方程為Y=145.898-30.269×X，R2=0.862。

表2 各組與實(shí)驗(yàn)組對(duì)比統(tǒng)計(jì)表

普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，C60-IONP-GE11實(shí)驗(yàn)組可見細(xì)胞明顯藍(lán)染，非靶向隨機(jī)小肽C60-IONP-RP對(duì)照組未見明顯染色(圖5)。

圖3 MDA-MB-231細(xì)胞EGFR表達(dá)免疫熒光圖(激光共聚焦掃描顯微鏡下×1000，標(biāo)尺為5 μm)。a)DAPI染核；b)Cy3染膜；c)明場細(xì)胞輪廓；d)核膜融合圖。 圖4 a)C60-IONP-GE11處理后的MDA-MB-231細(xì)胞的T2WI圖；b)C60-IONP-RP處理后的MDA-MB-231細(xì)胞的T2WI圖。 圖5 MDA-MB-231細(xì)胞的普魯士藍(lán)染色圖(熒光倒置顯微鏡，×1000，標(biāo)尺為20μm)。a)C60-IONP-GE11處理后；b)C60-IONP-RP處理后。

4.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估對(duì)比劑C60-IONP-GE11的細(xì)胞毒性，筆者測定了不同濃度C60-IONP-GE11處理后MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞存活率。與空白組相比，C60-IONP-GE11濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL時(shí)，存活率分別為(98.86±3.65)%、(96.08±4.09)%、(92.76 ±3.03)%、(90.71±3.21)%、(88.19%±1.79)%、(84.44%±2.64)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.988，P<0.001，圖6)。

5.體外光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)

為了研究C60-IONP-GE11對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的光動(dòng)力學(xué)治療效果，測定了不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞存活率。單純激光組細(xì)胞存活率為(92.45±4.99)%，C60-IONP-GE11無激光組細(xì)胞存活率為(95.86±4.05)%、非靶向隨機(jī)小肽C60-IONP-RP對(duì)照組激光處理后細(xì)胞存活率為(83.39±3.95)%，而C60-IONP-GE11實(shí)驗(yàn)組激光處理后的細(xì)胞存活率僅為(22.79±4.84)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖7，表2)。

ROS檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組靶向?qū)Ρ葎〤60-IONP-GE11+激光組處理細(xì)胞后可見細(xì)胞內(nèi)有大量綠色熒光，而單純激光組、C60-IONP-GE11無激光組未見明顯綠色熒光，非靶向?qū)Ρ葎〤60-IONP-RP+激光處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)見少量綠色熒光，并且隨對(duì)比劑濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光增多(圖8)。對(duì)熒光染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析(圖9)，實(shí)驗(yàn)組靶向?qū)Ρ葎〤60-IONP-GE11+激光組與單純激光組、C60-IONP-GE11無激光組、非靶向?qū)Ρ葎〤60-IONP-RP+激光組的ROS熒光強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2288.539，P<0.001)。

圖6 不同濃度的C60-IONP-GE11細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 圖7 各激光組處理后MDA-MB-231的細(xì)胞存活率及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。A為單純激光組，B為C60-IONP-GE11無激光組，C為C60-IONP-RP激光組，D為C60-IONP-GE11激光組。 圖8 a)單純激光組；b)C60-IONP-GE11無激光組；c)C60-IONP-RP激光組；d)200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；e)400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；f)800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組處理后MDA-MB-231細(xì)胞的活性氧檢測圖(激光共聚焦掃描顯微鏡下×2000，標(biāo)尺為20 μm)。

圖9 A)單純激光組；B)C60-IONP-GE11無激光組；C)C60-IONP-RP激光組；D)200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；E)400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；F)800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組處理后MDA-MB-231細(xì)胞的ROS熒光半定量折線圖。

討 論

近年來，納米材料技術(shù)的興起為癌癥的診治開辟了新前景，其中以多功能磁性納米粒子為基礎(chǔ)的多模式成像和癌癥協(xié)同治療已成為分子影像領(lǐng)域發(fā)展的新研究方向之一[9-11]。

GE11是特異性靶向上皮源性腫瘤細(xì)胞膜EGFR受體的小分子多肽，序列為YHWYGYTPQNVI[12-13]，本研究為保護(hù)小肽功能區(qū)活性，在首尾各加上兩個(gè)氨基酸，構(gòu)成QKYHWYGYTPQNVIQK；GE11內(nèi)化但不激活EGFR，猶如天然的表皮生長因子配體，從而避免促進(jìn)腫瘤生長[6]。EGFR是位于細(xì)胞膜表面的跨膜糖蛋白[14]，過表達(dá)于各種上皮來源的腫瘤，包括非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌等[15]。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MD-MBA-231細(xì)胞膜表面產(chǎn)生大量紅色熒光，表明MD-MBA-231細(xì)胞的EGFR表達(dá)量多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，這是我們選擇MD-MBA-231細(xì)胞株進(jìn)行體外MRI成像及PDT治療原因。

C60-IONP-GE11的TEM圖示制備的納米顆粒尺寸均一，水合粒徑約29.4 nm，當(dāng)納米顆粒粒徑在10～100 nm區(qū)間時(shí)，肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)其的吞噬減少[17]，體內(nèi)血液循環(huán)的時(shí)間延長，進(jìn)一步增加了腫瘤病灶對(duì)USPIO的有效結(jié)合時(shí)間和攝入時(shí)間[18]。FTIR各峰可見C60特征峰，F(xiàn)e-O峰，酰胺鍵特征峰，GE11共振峰，表明C60和GE11被偶聯(lián)在磁性顆粒的表面。飽和磁化強(qiáng)度隨外加磁場的變化而變化，磁飽和度約為53.4 emu/g，幾乎無磁滯現(xiàn)象，呈現(xiàn)超順磁性，可用于MRI成像。

超順磁性氧化鐵納米粒可作為磁共振成像的陰性造影劑，即在T2加權(quán)像中顯示為低信號(hào)[19]。MD-MBA-231與C60-IONP-GE11孵育后，PBS洗去未結(jié)合的對(duì)比劑，當(dāng)C60-IONP-GE11在濃度為100 μg/mL時(shí)，MD-MBA-231細(xì)胞開始出現(xiàn)T2信號(hào)的負(fù)性強(qiáng)化，當(dāng)濃度升至200 μg/ml時(shí)T2信號(hào)已接近背景值，隨濃度增高T2信號(hào)負(fù)性強(qiáng)化增強(qiáng)，表明C60-IONP-GE11可體對(duì)乳腺癌細(xì)胞靶向成像；普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)顯示靶向組細(xì)胞明顯藍(lán)染，而對(duì)照組未見染色。YANG等[20]用GE11肽修飾USPIO，與EGFR高表達(dá)H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞孵育后普魯士藍(lán)染色可見細(xì)胞明顯藍(lán)染，腋下荷瘤裸鼠MR成像結(jié)果顯示，尾靜脈注射1 h后腫瘤區(qū)域T2信號(hào)明顯下降；MA等[21]開發(fā)AFP和GPC3雙抗原靶向的USPIO探針，體外對(duì)Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞MR成像，顯示實(shí)驗(yàn)組T2WI信號(hào)下降幅度明顯，普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞明顯藍(lán)染；ZHAO等[22]合成適配體(aptamer，Apt)介導(dǎo)的超小超順磁性鐵納米粒子(Ultrasmall superparamagnetic iron ox-ide，USPIO)探針，MR體外T2WI成像顯示Apt-USPIO孵育的Huh-7人肝癌細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度隨對(duì)比劑濃度升高，T2信號(hào)逐漸降低，普魯士藍(lán)染色試驗(yàn)觀察到Huh-7肝癌細(xì)胞對(duì)Apt-USPIO有特異性攝??；本研究與前人結(jié)果基本一致。

CCK-8試劑可被活細(xì)胞氧化還原生成可溶性的橙黃色甲瓚，因此培養(yǎng)液顏色的深淺與活細(xì)胞成正比，與細(xì)胞毒性成反比，通過測定反應(yīng)產(chǎn)物的OD值即可簡便且準(zhǔn)確的反映存活細(xì)胞的數(shù)量。本課題選用CCK8試劑盒檢測不同濃度C60-IONP-GE11對(duì)MD-MBA-231細(xì)胞存活情況的影響，結(jié)果顯示不同濃度C60-IONP-GE11處理后，隨著濃度的增加，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率稍降低，但均在80%以上，根據(jù)細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)細(xì)胞存活率>75%時(shí)可視為無細(xì)胞毒性[23]，故C60-IONP-GE11幾乎無毒，可用于后續(xù)光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)。LI[24]等合成水溶性C60衍生物，在無光照條件下，80 μg/ml、150 μg/ml、300 μg/ml的水溶性C60對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞抑制率均在10%以下；FU[25]等發(fā)現(xiàn)當(dāng)IONP濃度為30 μg/ml時(shí)，4T1人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率僅下降不到10%。

光動(dòng)力學(xué)治療是指用特定波長的激光照射吸收了光敏劑的靶組織，產(chǎn)生單線氧、活性氧殺傷病變細(xì)胞而正常細(xì)胞不受影響[26]，其發(fā)生條件有三個(gè)：適宜波長激光、光敏劑、氧氣[27]。ROS產(chǎn)生過多，細(xì)胞則進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而激發(fā)腫瘤細(xì)胞損傷、腫瘤血管破壞等殺傷效應(yīng)[28-30]。PDT治療腫瘤的機(jī)制主要包括Ⅰ型反應(yīng)(產(chǎn)生活性氧)和Ⅱ型反應(yīng)(產(chǎn)生單線態(tài)氧1O2)[31]。C60作為一種新興的光敏劑，被廣泛應(yīng)用于光動(dòng)力治療，C60光動(dòng)力治療更傾向于發(fā)生Ⅰ型反應(yīng)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)[32,33]，因此細(xì)胞內(nèi)活性氧水平是評(píng)價(jià)C60用于PDT治療效果的重要指標(biāo)。

活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光染料DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒，無熒光的DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后可被活性氧氧化成有熒光的DCF，通過觀察DCF的熒光強(qiáng)度可檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成水平，本課題通過觀察細(xì)胞活性氧生成水平來檢驗(yàn)PDT治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果。單純給予光照組和單獨(dú)給與C60-IONP-GE11孵育的MD-MBA-231 細(xì)胞活性氧檢測陰性，說明這兩組無光動(dòng)力學(xué)治療反應(yīng)發(fā)生；而C60-IONP-RP激光組細(xì)胞活力稍下降，可能是C60-IONP-RP與MD-MBA-231 細(xì)胞發(fā)生少量非特異性結(jié)合，C60在激光作用下產(chǎn)生少量活性氧使細(xì)胞存活率稍降低，活性氧檢測證實(shí)了少量綠色熒光存在。與對(duì)照組相比，C60-IONP-GE11激光組細(xì)胞存活率僅為(22.79±4.11)%，細(xì)胞活力明顯下降 ，殺傷腫瘤細(xì)胞效果最顯著(P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，且活性氧檢測實(shí)驗(yàn)顯示大量綠色熒光存在，而且C60-IONP-GE11濃度增加，活性氧產(chǎn)生增多，光動(dòng)力治療效果增強(qiáng)，進(jìn)一步證明了C60-IONP-GE11用于光動(dòng)力治療腫瘤的可行性。SHI等[34]開發(fā)了C60-IONP-PEG-FA，體外光動(dòng)力治療可使(73.7±1.3)%的乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生凋亡。SHI等[35]發(fā)現(xiàn)15 μg/ml的C60@Au-PEG光動(dòng)力治療MCF-7細(xì)胞時(shí)，可使其細(xì)胞存活率下降至(42.8±5.2)%。Yang等[20]開發(fā)Ge11-PDA-Pt@USPIOs納米粒子，GE11特異性靶向EGFR陽性細(xì)胞，激光照射后可使H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS熒光，均與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，C60-IONP-GE11多功能MR對(duì)比劑兼具磁共振成像與光動(dòng)力靶向治療作用，有望同時(shí)解決腫瘤靶向MR成像和治療的問題，具有良好應(yīng)用前景。