李鵬，王萍，張以剛，胡琨，袁明俊，張磊磊

1.德州市公安局物證鑒定研究中心，山東 德州 253000；2.中國人民公安大學(xué)，北京 100038；3.公安部物證鑒定中心，北京 100038；4.山東省公安廳物證鑒定研究中心，山東 濟(jì)南 250001

硅藻檢驗(yàn)是判斷水中尸體入水時(shí)間和入水地點(diǎn)的基礎(chǔ)，在尋找尸源和判斷案件性質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用，但是目前各地硅藻數(shù)據(jù)庫建設(shè)還處在初始階段，數(shù)據(jù)庫建設(shè)受到多種因素的影響，如沒有標(biāo)準(zhǔn)的建庫方法、缺少硅藻識別專家、缺少硅藻檢驗(yàn)儀器設(shè)備、硅藻變化復(fù)雜等。在上述因素的影響下，數(shù)據(jù)庫建設(shè)覆蓋面少且質(zhì)量不一，直接影響尸體入水時(shí)間、地點(diǎn)判斷的參考價(jià)值和準(zhǔn)確性。

漳衛(wèi)新河為海河支流漳衛(wèi)南運(yùn)河山東境內(nèi)的分洪河道，前身為古黃河河道，1971 年改稱漳衛(wèi)新河。該河從山東省德州市四女寺村四女寺樞紐起，上接衛(wèi)運(yùn)河，沿冀、魯邊界，途徑山東省武城縣、德州市、寧津縣、樂陵市、慶云縣、無棣縣，河北省吳橋縣、東光縣、南皮縣、鹽山縣、海興縣，在無棣縣大口河入渤海。河道全長257 km，流域面積3 144 km2。漳衛(wèi)新河穿過德州市主城區(qū)，河流沿岸風(fēng)景點(diǎn)多，為發(fā)生溺水高風(fēng)險(xiǎn)水域[1]。

本研究對山東省德州市漳衛(wèi)新河德城區(qū)段4 處采樣點(diǎn)進(jìn)行逐月采樣，分析該水域1 年內(nèi)硅藻的動態(tài)變化。同時(shí)，與之前數(shù)據(jù)庫建設(shè)時(shí)本河流遠(yuǎn)點(diǎn)采樣點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，研究硅藻變化的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Leica EM ACE200 低真空鍍膜機(jī)（德國Leica 公司），HL-6 多聯(lián)真空抽濾儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），Quanta650 掃描電鏡（美國FEI 公司），X-MaxN能譜儀、INCA v5.04 軟件（英國Oxford 公司），0.45 μm一次性有機(jī)膜抽濾杯（珠海市祥臻生物科技有限公司）。

無水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），濃硝酸（濃度65%～68%，天津福晨化學(xué)試劑廠），甲醛（濃度37%～40%，萊陽市康德化工有限公司）。

1.2 水樣采集

2020年1月—12月，于每月15日和30日（2月28日）對漳衛(wèi)新河德城區(qū)段天衢路橋、三八路橋（距離天衢路橋0.5 km）、東方紅路橋（距離天衢路橋1.0 km）和東風(fēng)路橋（距離天衢路橋1.7 km）4 處采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣（圖1），每處采樣點(diǎn)共取樣24 份，合計(jì)96 份樣品。

圖1 采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling sites

采樣方法：每個采樣點(diǎn)在距離岸邊1 m、水面下1 m處共取500 mL 水樣，加2 mL 甲醛水溶液后常溫避光保存。盛裝水樣的容器為一次性塑料瓶。取樣前用取樣處河水對采樣器涮洗3 次，取樣后用純凈水涮洗3 次。

1.3 樣品處理

采用強(qiáng)酸消解-真空抽濾-掃描電子顯微鏡法[2]檢測水樣中的硅藻，具體步驟如下。

強(qiáng)酸消解：將水樣搖勻，取60 mL 水樣，置于燒杯內(nèi)，加入12 mL 濃硝酸，90 ℃加熱30 min。

真空抽濾：按消解水樣與純水按體積比1∶5 加純水至燒杯，將稀釋后的消解液倒入醋酸纖維膜濾杯中抽濾，完成后加50 mL 純水繼續(xù)抽濾，使濾膜表面接近中性，然后加10 mL 無水乙醇抽濾，去除膜內(nèi)水分，在電熱板上烘干后粘在掃描電子顯微鏡樣品臺上。

樣品鍍膜：將樣品置于Leica EM ACE200 低真空鍍膜機(jī)中鍍金膜，樣品距離噴金口4 cm，噴金時(shí)間180 s。

掃描電子顯微鏡檢測：利用X-MaxN能譜儀和Quanta650 掃描電鏡對濾膜有效抽濾范圍進(jìn)行分區(qū)并自動拍照。在INCA v5.04 軟件上設(shè)置參數(shù)：加速電壓20 kV，工作距離10 mm，束斑大小4.5 nm，放大倍數(shù)800 倍。通過硅藻細(xì)胞壁的花紋分辨硅藻種屬[3-6]，利用INCA v5.04 軟件以10 個不同視場作為起始視場，采取等距法挑選出10組（每組20個視場），人工對10組200 個視場進(jìn)行硅藻含量和種屬分類統(tǒng)計(jì)[4-7]，對樣品進(jìn)行多次統(tǒng)計(jì)，通過方差分析驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

收集以往樂陵采樣點(diǎn)（距離天衢路采樣點(diǎn)40 km）和寧津采樣點(diǎn)（距離天衢路采樣點(diǎn)80 km）的硅藻數(shù)據(jù)[2]，采用PAST 4.03 軟件（Oyvind Hammer 開發(fā)）對物種數(shù)據(jù)進(jìn)行非度量型多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析、Sprensen 相似系數(shù)分析，研究漳衛(wèi)新河各采樣點(diǎn)及各季節(jié)硅藻種群組成的相似性[8-13]。

2 結(jié)果

2.1 硅藻檢出情況

漳衛(wèi)新河德城區(qū)段共檢出硅藻2 綱24 屬（表1），該河流的硅藻種類豐富、硅藻含量較高，平均硅藻含量為3 336 個/10 mL。水域中常見優(yōu)勢種屬為針桿藻屬、舟形藻屬、小環(huán)藻屬、菱形藻屬，在4 處采樣點(diǎn)每次采樣中均檢出，4 種硅藻的平均含量占硅藻總含量的比例為89.4%。冠盤藻屬、波緣藻屬、直鏈藻屬、等片藻屬、角毛藻屬、棒桿藻屬6 個種屬的硅藻檢出率及檢出含量很低。以2 月28 日采樣為例，各類硅藻在種屬中的百分比見表2，各類硅藻在種屬中的占比不同，最高達(dá)47.7%，最低小于0.1%。

表1 硅藻種屬組成Tab.1 The list of diatom species

表2 2020 年2 月28 日各采樣點(diǎn)硅藻種屬百分比Tab.2 Percentage of diatom species at each sampling site on February 28，2020 （%）

2.2 硅藻含量的變化

漳衛(wèi)新河每個月4 處采樣點(diǎn)兩次采樣的平均含量和種屬變化（表3）顯示，不同月份硅藻的平均含量在1 054～13 041 個/10 mL，種屬構(gòu)成為8～16 個，全年硅藻含量為（3 879±3 551）個/10 mL，硅藻種屬為（11.9±2.1）種。2～12 月的硅藻含量和種屬與1 月之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對平均含量進(jìn)行描述性分析，最大值為8 月硅藻含量，最小值為12 月含量。表4為2月各采樣點(diǎn)的具體含量，2月15日和2月28日東風(fēng)路橋采樣點(diǎn)硅藻含量均高于其他采樣點(diǎn)。

表3 每個月硅藻含量和種屬的變化Tab.3 Monthly change of average diatom content and species （n=8，）

表3 每個月硅藻含量和種屬的變化Tab.3 Monthly change of average diatom content and species （n=8，）

注：1）與1 月份相比，P＜0.05。

表4 2 月份各采樣點(diǎn)硅藻含量Tab.4 Diatom content at each sampling site in February（個）

硅藻的種屬個數(shù)也因月份的變化而不同，硅藻平均種屬個數(shù)在2 月達(dá)15 種以上，在12 月不到9 種。

2.3 硅藻種屬檢出個數(shù)與硅藻含量的關(guān)系

將硅藻含量作為自變量（x）、種屬個數(shù)作為因變量（y）進(jìn)行線性回歸分析，模型公式為y=11.206+0.000 2x，模型R2為0.078。模型通過F檢驗(yàn)（F=7.917，P=0.006＜0.05），硅藻含量的回歸系數(shù)值為0.000 2（t=2.814，P=0.006＜0.05）。

2.4 漳衛(wèi)新河不同地點(diǎn)硅藻群落對比

計(jì)算漳衛(wèi)新河天衢路采樣點(diǎn)與三八路采樣點(diǎn)、東方紅路采樣點(diǎn)、東風(fēng)路采樣點(diǎn)、樂陵采樣點(diǎn)、寧津采樣點(diǎn)5 處采樣點(diǎn)的Sprensen 相似系數(shù)（表5）顯示，距離2 km以內(nèi)的3處采樣點(diǎn)相似系數(shù)很高，不能進(jìn)行有效區(qū)分；天衢路采樣點(diǎn)與距離40 km和80 km的2處采樣點(diǎn)有明顯的差別，能對距離較遠(yuǎn)處水樣進(jìn)行有效區(qū)分。

表5 各采樣點(diǎn)Sprensen 相似系數(shù)Tab.5 The Sprensen similarity of each sampling site

2.5 漳衛(wèi)新河德城區(qū)段硅藻種群組成相似性

由圖2A 可見，漳衛(wèi)新河德城區(qū)段各采樣點(diǎn)間硅藻種群結(jié)構(gòu)的差異很小。由圖2B 可見，漳衛(wèi)新河德城區(qū)段各季節(jié)硅藻種群結(jié)構(gòu)不同，水域中硅藻的群落組成因季節(jié)不同而變化。

圖2 NMDS 分析漳衛(wèi)新河硅藻種群組成的相似性結(jié)果Fig.2 NMDS results for diatom community similarity in Zhangweixin River

3 討論

河流浮尸案件的尸體溯源一直是公安工作中的重點(diǎn)，隨著DNA 技術(shù)的發(fā)展，溯源工作有了很大的提高。但水中尸體的入水位置推測仍然是阻礙案件偵破和定性的難點(diǎn)。硅藻檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，為解決水中尸體入水位置提供了新的思路。通過硅藻檢驗(yàn)比對分析具有理論基礎(chǔ)和可行性，李崢等[14]已將此方法成功應(yīng)用于實(shí)際案例。

3.1 漳衛(wèi)新河德城區(qū)段硅藻種群組成特點(diǎn)

本研究發(fā)現(xiàn)，漳衛(wèi)新河生態(tài)系統(tǒng)較為穩(wěn)定，各采樣點(diǎn)的距離較近，生態(tài)環(huán)境相似，各種影響硅藻變化的因素相近，因此硅藻群落結(jié)構(gòu)的相似度較大。不同季節(jié)的環(huán)境條件（如溫度）不同，影響硅藻變化的因素不同，水域中硅藻的群落組成因季節(jié)變化而改變。漳衛(wèi)新河的硅藻種群變化主要為硅藻種屬相對豐度的變化。各硅藻種屬含量隨時(shí)間的變化發(fā)生改變，除主要優(yōu)勢種屬外的其他硅藻種屬，在部分月份未檢出，如棒桿藻屬在2 月未檢出。4 個采樣點(diǎn)有一定的距離因而有環(huán)境差異，部分采樣點(diǎn)會有變化趨勢不同步的情況。部分時(shí)間采樣點(diǎn)受外部環(huán)境干擾較大，如2月的平均硅藻含量普遍較低（1 000 個/10 mL 左右），但2 月15 日東風(fēng)東路采樣點(diǎn)硅藻含量達(dá)7 276 個/10 mL。硅藻受環(huán)境因素影響，其分布具有明顯的區(qū)域性特征，不同流域硅藻種屬構(gòu)成是根據(jù)硅藻檢驗(yàn)推測尸體入水地點(diǎn)的前提[14-16]。Sprensen 相似系數(shù)是用于比較兩樣本種屬構(gòu)成相似程度的常用指標(biāo)[14]，相似系數(shù)越高兩樣本構(gòu)成相似度越高。在確定溺死案例中，可以計(jì)算肺組織與尸體中及上下游硅藻種屬構(gòu)成之間的Sprensen 相似系數(shù)。相似系數(shù)越高的水域是入水地點(diǎn)的可能性更大，通過分析比較Sprensen 相似系數(shù)，可為推測落水溺亡位置提供方向。

3.2 硅藻數(shù)據(jù)庫建設(shè)的價(jià)值及注意事項(xiàng)

在水中尸體檢驗(yàn)實(shí)踐中，取水樣時(shí)水域的時(shí)空環(huán)境可能已經(jīng)發(fā)生變化，若去取上下游流域的水樣比較耗時(shí)耗力，且取到當(dāng)時(shí)的水樣無法代表水域的全部硅藻組成，因此一般只對尸體器官中檢出的硅藻與發(fā)現(xiàn)尸體處當(dāng)時(shí)的水樣中硅藻進(jìn)行比對。硅藻數(shù)據(jù)庫建立后，器官硅藻檢驗(yàn)結(jié)果可以與庫中該河流硅藻數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。與同一河流不同流域硅藻數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，可以為判斷死者的落水位置提供參考；與同一河流不同季節(jié)的硅藻數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，可以對水中尸體的死亡時(shí)間判斷提供依據(jù)[5]。在鑒定實(shí)踐中，肺組織中檢出硅藻與水樣硅藻優(yōu)勢種屬組成是判斷入水地點(diǎn)的重要依據(jù)，案件中會遇到硅藻組成相似性很高但肺中檢出的個別硅藻在水樣中未檢出的情況。

在建庫中應(yīng)注意：（1）選擇采樣水域，調(diào)研建庫地區(qū)水域概況和水中尸體多發(fā)水域，覆蓋當(dāng)?shù)刂饕恿?、湖泊、水庫和溺水高發(fā)水域。（2）科學(xué)設(shè)置河流兩采樣點(diǎn)距離，可以通過硅藻相似系數(shù)區(qū)分合適距離。（3）建庫樣品量大，購置可以批量處理樣品的水樣消解、抽濾、鍍膜等前處理設(shè)備。（4）利用硅藻識別統(tǒng)計(jì)自動化設(shè)備[15]，可提高數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)效率。

科學(xué)成熟的硅藻數(shù)據(jù)庫是支撐破案的基礎(chǔ)，建成完善的數(shù)據(jù)庫可以為案件節(jié)省人力、物力、財(cái)力，提高辦案效率，提供偵查方向。本研究獲得德州市漳衛(wèi)新河硅藻的變化規(guī)律，可用于當(dāng)?shù)毓柙鍞?shù)據(jù)庫的建設(shè)，利用好硅藻數(shù)據(jù)庫，可以在水中尸體鑒定中發(fā)揮巨大作用。