蔡杰，王博，陳建華，鄧建強(qiáng)

海南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)鑒定中心 海南省熱帶法醫(yī)學(xué)司法鑒定工程研究中心 海南省院士工作站（熱帶法醫(yī)學(xué)）海南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，海南 海口 571199

水中尸體檢驗(yàn)是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐和研究的重要內(nèi)容之一，判斷死者是生前溺水死亡還是死后拋尸入水，以及推斷落水地點(diǎn)成為研究的核心和重點(diǎn)。硅藻在自然界（特別是水中）大量存在，在溺水過(guò)程中硅藻會(huì)隨同溺液進(jìn)入人體，因此尸體器官組織中存在硅藻是認(rèn)定生前溺水的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]，硅藻檢驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)硅藻形態(tài)學(xué)特征或者區(qū)分硅藻DNA 分子差異來(lái)進(jìn)行。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，特別是測(cè)序成本有了較大幅度的下降，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于包括硅藻在內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)等方面的研究[2-5]。本文擬就法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)的現(xiàn)狀和困境、高通量測(cè)序技術(shù)的基本原理及其在法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值和前景進(jìn)行綜述。

1 法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)現(xiàn)狀及困境

法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，硅藻檢驗(yàn)可應(yīng)用于區(qū)分生前溺死和死后拋尸入水、推斷溺水地點(diǎn)[6]等。硅藻能夠用于推斷溺水地點(diǎn)是因其對(duì)于水體環(huán)境的變化敏感，不同水域的硅藻種類(lèi)會(huì)因環(huán)境的變化而具有很大的差異[7-8]。推斷溺水地點(diǎn)需要了解所在地區(qū)主要水域的硅藻種群分布規(guī)律，必須對(duì)該地區(qū)水域不同時(shí)間的硅藻種群分布狀況進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查和總結(jié)。

目前法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)的研究方法主要分為形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法2種。形態(tài)學(xué)方法是通過(guò)硝酸消化、微波消解等[9]方法將硅藻從溺液、組織中分離出來(lái)，然后利用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡對(duì)硅藻形態(tài)特征進(jìn)行觀察，確定所檢測(cè)樣本內(nèi)所含的硅藻種類(lèi)及數(shù)量，這是目前法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中硅藻檢驗(yàn)的常規(guī)方法[10]。但硅藻的形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)有其不足，如掃描電子顯微鏡價(jià)格昂貴，檢驗(yàn)過(guò)程中需要對(duì)數(shù)量龐大的照片中的硅藻種類(lèi)進(jìn)行人工判讀，成本高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；且硅藻種類(lèi)和形態(tài)繁多，故其形態(tài)學(xué)分類(lèi)對(duì)檢驗(yàn)人員的硅藻分類(lèi)經(jīng)驗(yàn)要求較高，檢驗(yàn)人員需要經(jīng)過(guò)多年的培養(yǎng)和實(shí)踐才能勝任，而全世界范圍內(nèi)正面臨傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員的不斷減少[11]，致使基于形態(tài)學(xué)特征的硅藻檢驗(yàn)技術(shù)廣泛應(yīng)用更加困難。雖有將人工智能（artificial intelligence，AI）技術(shù)用于掃描電子顯微鏡照片識(shí)別的報(bào)道[12-15]，但其應(yīng)用的可靠性仍有待進(jìn)一步研究。

硅藻分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法是近年來(lái)逐步發(fā)展起來(lái)的硅藻檢驗(yàn)新方法，是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法的重要補(bǔ)充。該方法通過(guò)獲取和分析一段或幾段硅藻特異性DNA 序列實(shí)現(xiàn)對(duì)硅藻種類(lèi)的鑒定，具有可靠、高效、易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究、藻類(lèi)種屬鑒定等。與硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法相比，硅藻分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法大大減少了檢驗(yàn)所需的樣本量，提高了檢驗(yàn)的靈敏度和可靠性，很大程度上降低了硅藻檢驗(yàn)結(jié)果出錯(cuò)的概率[16-23]，并且硅藻分子檢驗(yàn)方法對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)者人體的危害遠(yuǎn)低于硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法。但當(dāng)前法醫(yī)學(xué)硅藻分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法還不完善，一方面其檢測(cè)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方法，另一方面，目前基于PCR 和第一代測(cè)序?yàn)橹鞯墓柙宸肿友芯考夹g(shù)，對(duì)于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中所涉及研究樣本中含有多種硅藻種屬的情況，在技術(shù)方面存在不足，影響其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用[24-25]。近年來(lái)，隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，開(kāi)始有研究嘗試將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)硅藻DNA 檢驗(yàn)，為從檢驗(yàn)技術(shù)角度解決硅藻檢驗(yàn)難題提供了新的思路與方向[26]。

2 高通量測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用于硅藻研究的技術(shù)關(guān)鍵

SANGER 等[27]開(kāi)發(fā)的基于雙脫氧末端終止法的DNA 測(cè)序技術(shù)奠定了一代測(cè)序的基礎(chǔ)，后續(xù)用熒光基團(tuán)標(biāo)記、平行毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)Sanger 測(cè)序法進(jìn)行改進(jìn)[28-29]。然而，一代測(cè)序技術(shù)由于通量較低的限制，無(wú)法滿足遺傳學(xué)研究對(duì)大批量測(cè)序的需求。因此，逐步發(fā)展出高通量測(cè)序技術(shù)[30-31]。

高通量測(cè)序技術(shù)于2005年興起，經(jīng)歷了從短讀長(zhǎng)到長(zhǎng)讀長(zhǎng)的發(fā)展歷程，高通量、短讀長(zhǎng)的測(cè)序技術(shù)被稱(chēng)為二代測(cè)序技術(shù)，高通量、長(zhǎng)讀長(zhǎng)的測(cè)序技術(shù)被稱(chēng)為三代測(cè)序技術(shù)。二代測(cè)序技術(shù)以美國(guó)Roche 公司的454平臺(tái)、美國(guó)Illumina 公司的Solexa 平臺(tái)和美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司的Solid 平臺(tái)為代表。三代測(cè)序技術(shù)以美國(guó)PacBio 公司的單分子實(shí)時(shí)（single molecule real time，SMRT）測(cè)序和英國(guó)Oxford Nanopore Technologies 納米孔單分子測(cè)序技術(shù)為代表。與二代測(cè)序技術(shù)相比，三代測(cè)序技術(shù)無(wú)需PCR 擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)DNA 分子的測(cè)序，避免了PCR 過(guò)程中出現(xiàn)的系統(tǒng)偏好性[32]，其在保持二代測(cè)序技術(shù)高通量低成本優(yōu)勢(shì)的同時(shí)提高了讀長(zhǎng)，但較高測(cè)序錯(cuò)誤率和高昂的儀器試劑價(jià)格，在一定程度上限制了其應(yīng)用。

高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，使DNA 測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從單一的反應(yīng)體系到高效、快速、海量DNA分子同步檢測(cè)的跨越式發(fā)展，直接推動(dòng)了人類(lèi)對(duì)DNA 相關(guān)研究的爆發(fā)式發(fā)展，但目前仍然存在一系列問(wèn)題需要解決。各高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)分別有其優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，不同測(cè)序平臺(tái)采用不同的測(cè)序分析軟件，由于所用算法的差異，測(cè)序準(zhǔn)確率各不相同，分析結(jié)果的一致性也尚需進(jìn)一步驗(yàn)證[33]。當(dāng)前用于高通量測(cè)序序列拼接的算法根據(jù)拼接策略分為基于Greedy 策略的算法、基于Overlap-Layout-Consensus策略的算法和基于De Bruijn Graph 策略的算法，其中基于Greedy 策略的算法是最早應(yīng)用的算法[34]，適合于硅藻DNA 高通量測(cè)序的序列拼接，但其存在計(jì)算資源量耗費(fèi)大的問(wèn)題，也需要進(jìn)一步改進(jìn)[35]。

硅藻作為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，主要集中于生物監(jiān)測(cè)、生物地理學(xué)、植物區(qū)系研究等領(lǐng)域[36]。其中，硅藻及其群落的分類(lèi)和特征是最重要的研究?jī)?nèi)容，最初主要采用基于形態(tài)學(xué)觀察的方法，后來(lái)隨著DNA 分子標(biāo)志技術(shù)的快速發(fā)展，特別是以PCR 為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，硅藻研究開(kāi)始進(jìn)入DNA 分子水平。但是，由于硅藻研究的主要樣本是自然環(huán)境的水樣，其中含有的硅藻數(shù)量和種類(lèi)繁多，所以，在高通量測(cè)序應(yīng)用于硅藻檢驗(yàn)之前，硅藻DNA 分子水平的研究主要針對(duì)培養(yǎng)的單一、純種硅藻進(jìn)行，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)水樣中硅藻種類(lèi)、群落特征、物種豐富度等內(nèi)容的研究，高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得這些問(wèn)題得以迎刃而解，包括硅藻在內(nèi)的藻類(lèi)高通量測(cè)序程序見(jiàn)圖1[37]。

由圖1 可知，高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于硅藻分類(lèi)研究受多個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)影響，主要環(huán)節(jié)有硅藻DNA 提取、硅藻分子標(biāo)志物的選擇和硅藻參考數(shù)據(jù)庫(kù)的選取。

圖1 藻類(lèi)分類(lèi)高通量測(cè)序流程圖Fig.1 High-throughput sequencing flow chart of algae classification

2.1 硅藻DNA 提取

硅藻DNA 提取效率對(duì)硅藻群落組成的準(zhǔn)確鑒定和定量分析有著重要影響。雖然硅藻DNA 提取方法具有不同技術(shù)路線，但過(guò)程不外乎細(xì)胞裂解、DNA 分離和DNA 純化3 個(gè)環(huán)節(jié)。細(xì)胞裂解是否完全、基質(zhì)是否會(huì)吸附DNA、酶抑制劑的共提取和DNA 降解是硅藻樣本DNA 提取過(guò)程中面臨的主要問(wèn)題[38]。細(xì)胞裂解一般采用PK、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、SDS 等化學(xué)試劑消化降解，特異性與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等結(jié)合或者利用研磨、振蕩等物理破碎的方法，破壞硅藻的硅殼結(jié)構(gòu)，釋放硅藻DNA，再利用DNA 自身的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行純化。以目前廣泛使用的PowerSoil?DNA Isolation 試劑盒（美國(guó)Mobio 公司）為例，其裂解步驟中既有玻璃珠擊打破碎，又有SDS細(xì)胞裂解成分，但目前各種試劑盒對(duì)硅藻DNA 的提取效果缺乏對(duì)比性研究報(bào)道。

2.2 硅藻分子標(biāo)記

硅藻DNA 分子標(biāo)記的選擇和篩選，是硅藻分類(lèi)效能的關(guān)鍵，對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)用于硅藻研究來(lái)說(shuō)，亦是如此[39]。硅藻的DNA 來(lái)自硅藻的細(xì)胞核、線粒體和葉綠體三部分，因此，目前關(guān)于硅藻分類(lèi)的分子標(biāo)記選擇的研究，也主要集中在硅藻核糖體基因、線粒體基因和葉綠體基因的單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用[40]。

2.2.1 核糖體基因

核糖體基因是藻類(lèi)分類(lèi)中研究較多的基因，因其廣泛存在于各類(lèi)細(xì)胞中，很少發(fā)生大規(guī)模的橫向基因遷移，具有一系列從非常保守到高變的區(qū)域，又因其所承受的選擇壓力不同，使得核糖體DNA 各區(qū)域核苷酸的保守序列差異明顯，所以適用于生物分類(lèi)研究[41]。硅藻是真核生物，其核糖體DNA 由核糖體基因和與之相鄰的間隔區(qū)域組成，包括5.8S rDNA、18S rDNA、28S rDNA 和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），18S rDNA 的可變區(qū)進(jìn)一步分為V1～V9 區(qū)，ITS rDNA 包括ITS-1 和ITS-2[42]。硅藻核糖體基因的研究主要集中在18S rDNA 基因、ITS rDNA 基因等。目前的研究[43]已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定18S rDNA、ITS rDNA 某個(gè)可變區(qū)的序列，可以反映不同樣本微生物群落間的差異，因而被廣泛應(yīng)用于藻類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)學(xué)研究。ZIMMERMANN 等[44]通過(guò)對(duì)硅藻18S rDNA V4 區(qū)種內(nèi)、種間距離的計(jì)算分析，建議將18S rDNA 作為硅藻的DNA 條形碼。郭瑞軍[45]通過(guò)將18S rDNA V9 區(qū)域的高通量測(cè)序結(jié)果與掃描電子顯微鏡結(jié)果比較，認(rèn)為高通量測(cè)序技術(shù)在硅藻屬水平的分類(lèi)鑒定中具有優(yōu)勢(shì)。馬奔[46]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微囊藻ITS 區(qū)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其對(duì)微囊藻具有較好的分類(lèi)效果。

2.2.2 線粒體基因

線粒體基因具有高重排率和低突變率的特點(diǎn)[47]，應(yīng)用于硅藻分類(lèi)研究主要集中在細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（cytochrome c oxidase subunit I，COI）。COI基因已被成功用于多種動(dòng)物和某些原生生物的DNA條形碼分析[48-49]，EHARA 等[50]基于COI基因的研究表明，該區(qū)段可以用于硅藻分類(lèi)，并證明了8種硅藻系統(tǒng)的進(jìn)化關(guān)系。但是，有研究[51]表明COI基因主要適用于硅藻低分類(lèi)單元和某些近緣物種的鑒別。

2.2.3 葉綠體基因

硅藻葉綠體基因主要集中在葉綠體中編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit，rbcL）基因和23S rDNA V 結(jié)構(gòu)域的UPA（universal plastid amplicon）基因。rbcL 基因以單拷貝形式存在，不發(fā)生基因轉(zhuǎn)變；長(zhǎng)度達(dá)到1 400 bp，有足夠的分子性狀用于分支分析；進(jìn)化速率較適于研究遠(yuǎn)緣親屬間及科級(jí)以上的系統(tǒng)關(guān)系[51-52]。UPA基因廣泛存在于硅藻中，通用性較高，且在硅藻中易于擴(kuò)增，UPA基因曾一度被認(rèn)為是藻類(lèi)DNA 條形碼的首選基因。然而進(jìn)一步研究[51]發(fā)現(xiàn)，UPA基因在硅藻類(lèi)群中的高保守性限制了其作為硅藻DNA 條形碼的應(yīng)用。黃艷等[53]對(duì)紅藻的rbcL、UPA、COI基因區(qū)域進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ龋l(fā)現(xiàn)測(cè)序成功率從高到低依次為rbcL、UPA、COI，得出rbcL 的硅藻種屬分類(lèi)能力優(yōu)于COI的結(jié)論。HAMSHER 等[54]通過(guò)對(duì)rbcL-3p和UPA區(qū)域進(jìn)行對(duì)比研究，也建議將rbcL-3p作為硅藻分類(lèi)的首選基因。

2.2.4 聯(lián)合應(yīng)用

線粒體基因、葉綠體基因和核糖體基因普遍存在于藻類(lèi)細(xì)胞中，對(duì)單一基因位點(diǎn)的檢測(cè)有時(shí)往往無(wú)法實(shí)現(xiàn)滿意的藻類(lèi)種屬鑒別[55]。通過(guò)多個(gè)DNA 分子標(biāo)志的聯(lián)合應(yīng)用，可以提高對(duì)藻類(lèi)種屬鑒別的能力，如MONIZ 等[56-57]通過(guò)對(duì)28 種硅藻（89 個(gè)樣本）的18S rDNA、COI和ITS2+5.8S rDNA 的分析，建議將ITS2+5.8S rDNA 作為硅藻分類(lèi)的條形碼，后又對(duì)114 種硅藻的ITS2+5.8S rDNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，建議將ITS2+5.8S rDNA 作為硅藻門(mén)內(nèi)中心綱和硅藻綱的DNA 條形碼。

2.3 硅藻參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)

高通量測(cè)序技術(shù)要實(shí)現(xiàn)對(duì)硅藻的分類(lèi)，必須與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中已被分類(lèi)的硅藻序列進(jìn)行比對(duì)匹配，因此參考數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性和完整性對(duì)硅藻分類(lèi)尤為重要。目前已有多個(gè)與硅藻分類(lèi)有關(guān)的分類(lèi)參考數(shù)據(jù)庫(kù)，但這些數(shù)據(jù)庫(kù)存在著不同程度硅藻序列的分類(lèi)錯(cuò)誤，不同數(shù)據(jù)庫(kù)間參考序列數(shù)量偏差極大，不同種類(lèi)硅藻的序列錄入差別較大，且有些種類(lèi)缺乏[58]。VASSELON等[59]利用形態(tài)學(xué)方法和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)法國(guó)某個(gè)島嶼河流的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，高通量測(cè)序和形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)中只有13%的硅藻種類(lèi)相同，分析其差異可能主要來(lái)源于高通量測(cè)序參考數(shù)據(jù)庫(kù)的不完善。RIVERA 等[60]在對(duì)布爾熱湖的底棲硅藻DNA 進(jìn)行高通量測(cè)序與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)比較中也發(fā)現(xiàn)同樣的問(wèn)題。因此，在通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行硅藻研究中，數(shù)據(jù)庫(kù)的完善、糾錯(cuò)、擴(kuò)大以及選擇，直接影響后續(xù)分析結(jié)果。表1為硅藻常見(jiàn)DNA 比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的匯總。

表1 目前常用硅藻DNA 比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)Tab.1 Currently commonly used database of diatom DNA alignment

總之，與硅藻高通量測(cè)序研究技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域的研究，為將該技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)提供了研究基礎(chǔ)，但基于法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)的特殊性，將該技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)，尚需解決一系列技術(shù)難題。

3 高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)的現(xiàn)狀及技術(shù)難題

高通量測(cè)序技術(shù)本身具有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)決定了其特別適合法醫(yī)學(xué)硅藻分子檢驗(yàn)的要求，直接將相關(guān)學(xué)科的硅藻研究結(jié)果應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)實(shí)踐存在極大風(fēng)險(xiǎn)：一方面法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)涉及的樣本（如溺死者肺、肝、腎等器官組織）為法醫(yī)學(xué)科特殊檢材，其他學(xué)科的研究成果不適用；另一方面則是為解決實(shí)際應(yīng)用中溺水地點(diǎn)推斷的問(wèn)題，法醫(yī)學(xué)對(duì)硅藻種群關(guān)系的區(qū)分提出了更高的要求，對(duì)參考數(shù)據(jù)庫(kù)的覆蓋程度提出了更高的標(biāo)準(zhǔn)。相較其他領(lǐng)域，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)，在同樣的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，面臨不一樣的技術(shù)要求和難題。

3.1 DNA 的提取

溺死地點(diǎn)水樣、溺死組織的樣本采集及后續(xù)DNA 的提取是應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行硅藻種屬檢驗(yàn)的基礎(chǔ)。溺死地點(diǎn)水樣、溺死組織的采集雖然已有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)[61]，但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)都是針對(duì)硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)制定的，缺乏針對(duì)硅藻分子生物學(xué)檢驗(yàn)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。由于檢材、水樣等的復(fù)雜性和多樣性，每個(gè)案件中樣本的情況都不同，硅藻在不同水域、不同人體組織的含量與分布存在差異，增加了制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的困難，需要大量研究數(shù)據(jù)支撐。NGUYEN 等[62]對(duì)7 種成品試劑盒的硅藻DNA 提取效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)提取的DNA 普遍存在RNA 污染，推測(cè)與樣本中抑制物未能完全去除有關(guān)。王志龍等[63]發(fā)現(xiàn)，不同DNA 提取方法對(duì)微生物群落的多樣性存在較大影響，但這些研究都是針對(duì)自然環(huán)境樣本進(jìn)行的，與法醫(yī)學(xué)樣本中充斥著大量人體組織DNA 的情況存在差異，因此，需要評(píng)價(jià)不同硅藻DNA 提取方法對(duì)法醫(yī)學(xué)不同硅藻樣本的DNA 提取效果，甚至需要建立專(zhuān)門(mén)適合人體組織硅藻DNA 提取的技術(shù)方法體系，此需求是法醫(yī)學(xué)硅藻研究所特有的，只有依靠法醫(yī)學(xué)自身的研究和積累去完成。后續(xù)可以開(kāi)展針對(duì)法醫(yī)學(xué)溺死樣本硅藻DNA 提取方法的專(zhuān)項(xiàng)研究，如不同DNA 提取方法效果的比較，綜合考慮可靠性、經(jīng)濟(jì)性、普及性等因素，制定統(tǒng)一的法醫(yī)學(xué)溺死樣本硅藻DNA提取方法標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 分子標(biāo)志的選擇

硅藻DNA 不同區(qū)域的保守度不同，擴(kuò)增區(qū)域的選擇會(huì)對(duì)硅藻種群分類(lèi)的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。CAI等[64]對(duì)淤泥中的微生物多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)微生物的多樣性和擴(kuò)增區(qū)域具有很大關(guān)系。同一樣本用不同引物得出的微生物種群豐度存在差異[65]。理想的引物是用一種引物盡可能多地?cái)U(kuò)增出樣本DNA，同時(shí)有效區(qū)分不同種屬，但“通用引物”都是基于已有序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過(guò)少量已知序列設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)大量未知微生物存在嚴(yán)重問(wèn)題，不同的引物對(duì)不同種屬硅藻的覆蓋度不同，導(dǎo)致硅藻種屬結(jié)果與實(shí)際情況存在較大偏差[66]。同時(shí)，含硅藻的人體組織樣本中含有大量人體DNA，這就要求設(shè)計(jì)硅藻種屬特異性較強(qiáng)的引物以避免人類(lèi)DNA 的干擾，同時(shí)實(shí)現(xiàn)可擴(kuò)增的硅藻種類(lèi)最大化，因此需要對(duì)已有硅藻研究的引物進(jìn)行篩選，設(shè)計(jì)適合法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)的分子標(biāo)志引物，后續(xù)可以設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物[67]來(lái)擴(kuò)大覆蓋度或針對(duì)單一硅藻種屬設(shè)計(jì)特異性引物。當(dāng)前法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)中應(yīng)用較多的引物主要集中在硅藻核糖體、葉綠體區(qū)域，如KANE 等[68]選擇16S rDNA 區(qū)域引物對(duì)水樣和組織中微型浮游生物的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)微型浮游生物的16S rDNA 的PCR 分析有助于溺水的確定。袁文勇等[69]利用硅藻DNA 的5.8S+ITS2 區(qū)域的片段長(zhǎng)度多態(tài)性來(lái)區(qū)分生前溺死和死后拋尸入水，取得了較好的效果，但由于樣本量很少，需要考慮其偶然性。ZHAO 等[70]利用對(duì)硅藻18S rDNA V7 區(qū)域的測(cè)序分析技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同水域不同生長(zhǎng)環(huán)境的硅藻種群的有效識(shí)別。VINAYAK[71]利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究不同硅藻葉綠體基因位點(diǎn)用于硅藻分類(lèi)的效果，發(fā)現(xiàn)UPA的分類(lèi)效果強(qiáng)于rbcL，并用DNA 測(cè)序的方法證明了硅藻檢驗(yàn)是區(qū)分生前溺死和死后拋尸入水的有力證據(jù)。LIU 等[72]用高通量測(cè)序技術(shù)和形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法對(duì)實(shí)際案件組織中的硅藻進(jìn)行檢驗(yàn)，比較兩者的可靠性，提出當(dāng)前高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于硅藻檢驗(yàn)最大的困難是缺乏可靠的硅藻分類(lèi)參考序列。FANG 等[55]利用焦磷酸測(cè)序?qū)彝梅谓M織和可疑溺液分別進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)用AdvISER-M-PYRO 算法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理后，通過(guò)溺死組織中的浮游生物群落可追溯溺液的來(lái)源。KAKIZAKI 等[26]將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際案例，發(fā)現(xiàn)高通量測(cè)序技術(shù)所需的樣本量從常規(guī)硅藻檢驗(yàn)所需的10 g降低到200 mg，具備更高的靈敏度。

通過(guò)對(duì)已有文獻(xiàn)的硅藻分子標(biāo)志引物進(jìn)行篩選，應(yīng) 用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST，https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢驗(yàn)以排除人類(lèi)基因的干擾，目前已報(bào)道的可以排除人體組織影響的硅藻分子標(biāo)志引物匯總見(jiàn)表2。

表2 可以排除人體組織影響的硅藻檢驗(yàn)引物匯總Tab.2 Summary primers for diatom tests which can exclude the influence of human tissues

續(xù)表2Continued Tab.2

3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)

目前利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)分類(lèi)所依賴(lài)的參考數(shù)據(jù)庫(kù)尚不完善，硅藻種類(lèi)尚未實(shí)現(xiàn)全覆蓋，且各數(shù)據(jù)庫(kù)中硅藻分類(lèi)也存在不同程度的分類(lèi)錯(cuò)誤和序列錯(cuò)誤。因此，高通量測(cè)序能否有效應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)，還需要大量的數(shù)據(jù)積累，對(duì)各地硅藻種類(lèi)進(jìn)行調(diào)查，建立各地符合法醫(yī)學(xué)實(shí)踐需求的硅藻分子檢測(cè)參考數(shù)據(jù)庫(kù)。

總之，高通量測(cè)序技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的諸多領(lǐng)域，但其在法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)中的研究和應(yīng)用尚處在起步階段，面臨著諸多問(wèn)題和挑戰(zhàn)，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)說(shuō)，在法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)中應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)具有良好的前景，相信隨著技術(shù)的進(jìn)步和相關(guān)難題的攻克，必將在法醫(yī)學(xué)溺水案件鑒定中發(fā)揮重要作用。