李麗，楊樣，孫姍姍，王文強(qiáng)，錢凱，鄒潔

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督研究院，江蘇南京 210007）

目前文獻(xiàn)報(bào)道的染發(fā)劑檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1]、液質(zhì)聯(lián)用法[2，3]、氣相色譜 法[4]、氣質(zhì)聯(lián)用法[5]及毛細(xì)管電泳法[9]等。其中液相色譜-質(zhì)譜法應(yīng)用最為廣泛，但質(zhì)譜儀器成本較高，且在分析復(fù)雜樣品及成分含量未知的樣品時(shí)， 易造成離子源污染；氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用和毛細(xì)管電泳法在分析復(fù)雜樣品時(shí)易造成對(duì)毛細(xì)管柱和儀器污染，定性和定量不準(zhǔn)確； 而高效液相色譜法具有儀器普及率較高、靈敏度高以及分析速度快等特點(diǎn)。由于染料成分具有極性強(qiáng)，不易揮發(fā)，不穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此高效液相色譜法是目前優(yōu)先選擇的檢測(cè)手段。染發(fā)劑中2,6-二羥乙氨基甲苯、3-硝基對(duì)羥乙氨基酚、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚、5-氨基-4-氯鄰甲酚4 種限用物質(zhì)的檢測(cè)方法， 目前國(guó)家暫未出臺(tái)統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)報(bào)道也不多見(jiàn)，存在檢測(cè)方法缺失、職能部門無(wú)法監(jiān)管的現(xiàn)象，因此本研究采用高效液相色譜法檢測(cè)染發(fā)劑中4 種限用物質(zhì)，并利用此方法對(duì)市售染發(fā)劑產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，為化妝品的市場(chǎng)監(jiān)督提供技術(shù)支持[6～9]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC1260 高效液相色譜儀 （Agilent 公司，美國(guó)）；電子分析天平（賽多利斯，德國(guó)）；超純水機(jī)（Millipore，美國(guó)）；超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó)）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher，美國(guó)）；渦旋振蕩器（其林貝爾，中國(guó)）；4 種限用物質(zhì)：2,6-二羥乙氨基甲苯（CAS：149330-25-6）、3-硝基對(duì)羥乙氨基酚（CAS：65235-31-6）、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚（CAS：6538-09-4）、5-氨基-4-氯鄰甲酚（CAS：110102-86-8），標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈（色譜純，Merk，德國(guó)），樣品為市售染發(fā)劑。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取2,6-二羥乙氨基甲苯、3-硝基對(duì)羥乙氨基酚、5-氨基-4-氯鄰甲酚2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚4 種標(biāo)準(zhǔn)品各100mg（精確到0.1mg）分別置于10mL 棕色容量瓶中，加入1mL 亞硫酸氫鈉（2g/L）和40%乙腈-水溶液使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液依次稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5mg/L、10mg/L、20 mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L 的 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理

稱取樣品0.5g（精確至0.001g），置25.0mL 離心管中，加入1mL 亞硫酸氫鈉（2g/L），少量40%乙腈-水溶液，混勻樣品后定容至刻度，渦旋30s 并冰浴超聲提取15min 后，以10000rpm/min 轉(zhuǎn)速離心8min，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾后，待測(cè)備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseplusC18 （250mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈和20mmol/L 磷酸二氫鉀水溶液，4 種限用物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1；梯度洗脫，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL，采用外標(biāo)法定量。

圖1 4 種限用物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖

表1 4 種限用物質(zhì)的梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定取樣量為0.5g， 提取溶劑為10mL50%乙醇水溶液。 按照標(biāo)準(zhǔn)方法在日常檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：部分樣品提取液會(huì)乳化或凝結(jié)，離心后的上層液較混濁，難以通過(guò)0.45μm 微孔濾膜；此外，在部分樣品配方中未見(jiàn)加入亞硫酸氫鈉或異抗壞血酸，制得的供試溶液容易氧化分解，影響測(cè)定結(jié)果。 為了消除染發(fā)劑中增稠劑和凝膠劑的影響，防止供試溶液被氧化，本方法加入硅藻土吸附增稠劑和凝膠劑， 并在提取溶液中加入1mL亞硫酸氫鈉（2g/L），提取溶液體積改為25mL 并在冰浴環(huán)境中超聲提取。 優(yōu)化后的前處理方法乳化凝結(jié)現(xiàn)象明顯減少，便于離心后取得上層清液。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)以20mmol/L 磷酸二氫鉀水溶液（pH=4.0）作為流動(dòng)相A 相，考察以甲醇或乙腈（B 相）作為有機(jī)相在相同梯度洗脫條件下4 種目標(biāo)化合物的色譜行為。 結(jié)果表明：當(dāng)以甲醇為有機(jī)相時(shí)，4 種目標(biāo)化合物出現(xiàn)出峰時(shí)間緩慢、出峰延遲的現(xiàn)象，而以乙腈為有機(jī)相出峰時(shí)間快并能很好的分離各目標(biāo)組分，且峰形尖銳對(duì)稱，故本方法選擇乙腈作為有機(jī)相。

2.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別對(duì)4 種限用物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描分析 （190～400nm）。 根據(jù)所測(cè)結(jié)果4 種目標(biāo)物在250nm 左右區(qū)域都有吸收峰，因此本方法最終確定定量檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。

2.2.3 色譜柱溫度的選擇 色譜柱的溫度對(duì)于4種染發(fā)劑限用物質(zhì)的色譜保留行為及分離效果都具有一定的影響。 本研究考察了當(dāng)色譜柱溫度在10～40℃范圍對(duì)色譜行為的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)色譜柱溫度為25℃時(shí)，既保證了保留時(shí)間的穩(wěn)定性， 同時(shí)也避免溫度過(guò)高引起目標(biāo)化合物成分的變化， 因此本方法最終確定25℃為色譜柱溫。

2.3 方法的線性關(guān)系和定量限

將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋得到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按測(cè)定條件質(zhì)量分?jǐn)?shù)由低到高依次進(jìn)樣分析，以4 種染發(fā)劑限用物質(zhì)的峰面積作為縱坐標(biāo)， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。 4 種限用物質(zhì)的線性回歸方程、線性回歸系數(shù)、檢出限(S/N＞3)及定量下限(S/N＞10)結(jié)果見(jiàn)表2。 結(jié)果表明：在5～200mg/L 質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，各染發(fā)劑限用物質(zhì)的峰面積和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，且本方法的檢出限完全滿足實(shí)際樣品的分析要求。

表2 4 種限用物質(zhì)的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 方法的回收率和精密度

利用空白基質(zhì)進(jìn)行回收率和精密度的考察。在低、中、高3 個(gè)加標(biāo)水平下，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6 次，結(jié)果表明4 種限用物質(zhì)的平均回收率范圍在87.6%～97.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.18%～4.64%，RSD 均小于5%（見(jiàn)表3），說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度、精密度均好。

表3 4 種限用物質(zhì)的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果(n=6)

2.5 樣品的測(cè)定

本次實(shí)驗(yàn)共購(gòu)買10 種染發(fā)劑，利用本文建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，10 種樣品中均未檢出4 種限用物質(zhì)染料，符合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）規(guī)定。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定染發(fā)劑中4種限用物質(zhì)的檢測(cè)方法。 該方法前處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、靈敏度高，可用于染發(fā)產(chǎn)品中常用染料成分的測(cè)定，為市場(chǎng)監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)手段支撐。