汪芳 李玉彬 劉婷 回連強(qiáng) 穆蘭澄 謝利民 沈鴻※

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

活血軟膏是由羌活、獨(dú)活、乳香、沒藥等中藥組成的復(fù)方制劑，具有溫經(jīng)散寒祛濕、活血消腫止痛功效。主治膝骨關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)活動(dòng)不利等。膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis，KOA）是以膝關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病[1]，其發(fā)病可能與遺傳、性別、年齡增長、體質(zhì)量增加及創(chuàng)傷、炎癥等多種因素有關(guān)[2]。通過兔膝關(guān)節(jié)損傷所致骨關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型，觀察活血軟膏對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔血清中氧自由基（SOD、MDA、LPO）的水平變化，從兔血清中的氧自由基代謝和關(guān)節(jié)軟骨退變角度，研究活血軟膏對(duì)軟骨組織損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 受試樣品活血軟膏，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院大興制劑中心提供，批號(hào)：20171126。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本大耳白兔，體質(zhì)量2.5～2.7 kg，購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，許可證編號(hào)為SYXK（京）2016-0013。動(dòng)物給藥劑量，是根據(jù)人與動(dòng)物體表面積折算的等效劑量，經(jīng)皮給藥。

1.3 試劑與儀器扶他林軟膏（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：vp0678 201909）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），過氧化脂質(zhì)（LPO）酶聯(lián)免疫測定（ELISA）試劑盒（Shanghai FANKEL Industrial Co.，Ltd.品 牌Fankew，批號(hào)分別為LOT.NO.20090145R，LOT.NO.20090121R，LOT.NO.20090117R）；電子計(jì)價(jià)秤（大陽衡器有限公司產(chǎn)品）；酶標(biāo)分析儀（Rayto RT-6100，美國雷社公司生產(chǎn)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法參考Hulth 等方法[3,4]稍加改進(jìn)，復(fù)制兔KOA 模型。取大耳白兔60 只，體質(zhì)量2.5～2.7 kg，雌雄各半，隨機(jī)選取兔10 只，設(shè)為正常組，余下兔進(jìn)行造模，在兔右后腿膝關(guān)節(jié)的股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面造成關(guān)節(jié)軟骨損傷并剪斷前交叉韌帶后，逐層縫合切口，紗布包裹傷口。正常組則切開皮膚后立即縫合。術(shù)后2 周，將兔隨機(jī)分為模型組；陽性扶他林組（1 cm/kg）；活血軟膏高、中、低劑量組（6 g、3 g、1.5 g 生藥/kg）。經(jīng)皮給藥，連續(xù)6 周。給藥結(jié)束當(dāng)日晚上，兔禁食禁水12 h。次日早上，兔稱重，耳靜脈取血后，空氣栓塞處死動(dòng)物，用酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測各組兔血清中氧自由基SOD、MDA、LPO 的含量，并肉眼觀察手術(shù)后兔步態(tài)運(yùn)動(dòng)情況。

1.5 兔步態(tài)評(píng)價(jià)分別于造模前、造模給藥2、4、6 周時(shí)進(jìn)行觀察，做步態(tài)評(píng)價(jià)，步態(tài)分級(jí)按Coderre 的方法，即0 級(jí)：正常行走；I 級(jí)：輕微跛行，受試下肢略有彎曲；Ⅱ級(jí)：中度跛行，受試下肢剛觸及地面；Ⅲ級(jí)：重度跛行，受試下肢略離開地面，后足著地行走[5]。

1.6 大體形態(tài)觀察及評(píng)價(jià)肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨色澤，光滑程度，有無糜爛及潰瘍，有無骨贅形成；關(guān)節(jié)液的顏色及黏稠度，滑膜有無增生等。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：關(guān)節(jié)面光整，色澤如常；1分：關(guān)節(jié)面粗糙，有裂隙且色澤灰暗；2分：關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨有缺損；3分：關(guān)節(jié)面潰瘍，缺損嚴(yán)重；4分：軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露[6]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)用（）表示，比較采用單因子方差法進(jìn)行處理，組間兩兩比較，方差齊時(shí)用LSD 方法分析，方差不齊時(shí)用Dunnetts 方法分析；等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05和P＜0.01 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔步態(tài)評(píng)價(jià)正常組兔正?；顒?dòng)，無關(guān)節(jié)腫脹；在造模給藥2 周后，模型組兔大部分兔神態(tài)萎靡，行走受阻嚴(yán)重，關(guān)節(jié)明顯腫脹，扶他林組和活血軟膏組，部分兔神態(tài)萎靡，行走受阻，關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹。給藥4～6 周治療后，模型組兔神態(tài)有輕度萎靡，行走受阻有所改善，關(guān)節(jié)腫脹有所改善。扶他林組和活血軟膏組，家兔神態(tài)基本正常，行走受阻明顯改善，除部分動(dòng)物關(guān)節(jié)有腫脹外，其他基本恢復(fù)。與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 活血軟膏各組家兔實(shí)驗(yàn)前后步態(tài)變化情況

2.2 關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)學(xué)觀察正常組兔關(guān)節(jié)軟骨外觀呈極淡藍(lán)色，光澤有彈性，關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)邊緣齊整，無骨贅形成。關(guān)節(jié)液量較少，質(zhì)地清澈透明。滑膜未見增生肥厚。模型組外觀呈暗黃色，無光澤，不透明，軟骨變薄，表面粗糙糜爛，部分有潰瘍形成，多數(shù)動(dòng)物關(guān)節(jié)可見不同程度的骨贅形成，關(guān)節(jié)液量增多，呈泡沫狀、渾濁，軟骨有明顯缺損，關(guān)節(jié)滑膜增生肥厚明顯。扶他林組和活血軟膏組，兔關(guān)節(jié)軟骨外觀呈淡黃色，失去原有光澤，半透明，軟骨變薄，部分關(guān)節(jié)表面粗糙不平，糜爛，有不同程度的骨贅形成，關(guān)節(jié)液輕微黏稠渾濁，量較模型組少，軟骨未見明顯缺損。滑膜有輕度增生。與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意我（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 各組兔滕關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)學(xué)觀察

表2 活血軟膏各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)觀察

2.3 對(duì)血清中氧自由基的影響活血軟膏所試組，均能降低兔血清中MDA 和LPO 的含量，提高SOD 活性。高、中劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 活血軟膏對(duì)兔KOA 血清中氧自由基的影響（）

表3 活血軟膏對(duì)兔KOA 血清中氧自由基的影響（）

注：與模型組比較，*P＜0.01。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA 的發(fā)生與“虛、邪、瘀”密切相關(guān)，歸屬“膝痹”“骨痹”等范疇，是一種因外邪侵?jǐn)_筋骨關(guān)節(jié)，閉阻經(jīng)脈氣血而導(dǎo)致肢體沉重、關(guān)節(jié)疼痛的疾病，病機(jī)為肝腎虧虛、筋失濡養(yǎng)、血瘀阻絡(luò)[7]。中醫(yī)對(duì)痹證的治則是補(bǔ)肝益腎、散寒除濕、活血通絡(luò)止痛。劉洪旺等[8]用六味地黃丸加減治療腎虛型骨關(guān)節(jié)炎，取得滿意療效。周遵謙等[9]重用活血化瘀之品，治療KOA 效果明顯。黃柏強(qiáng)[10]用中醫(yī)補(bǔ)腎活血治療KOA，通過改善局部微循環(huán)，使軟骨細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄活躍，增強(qiáng)膠原和蛋白聚糖合成功能，而抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。現(xiàn)代研究表明，KOA 發(fā)生、發(fā)展與氧自由基代謝有一定關(guān)系，自由基是帶有不成對(duì)電子的具有高度反應(yīng)活性的基團(tuán)，包括由氧派生的自由基和體內(nèi)各類物質(zhì)，例如藥物、毒物等，通過體內(nèi)代謝而產(chǎn)生的多種自由基，在機(jī)體正常情況下，可將體內(nèi)代謝所產(chǎn)生的自由基及時(shí)清除。但在病理情況下，機(jī)體對(duì)自由基清除率下降，會(huì)導(dǎo)致自由基堆積，引發(fā)疾病的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)研究表明該類自由基是引起關(guān)節(jié)軟骨變質(zhì)及關(guān)節(jié)滑液改變的重要原因[11]。MDA 和LPO 都是氧自由基作用后過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，在KOA 患者中，氧自由基作用于軟骨細(xì)胞，可以引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，MDA 和LPO 的產(chǎn)生增多，檢測血清中LPO 和MDA 的含量，可反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。SOD 是一種活性蛋白酶，是保護(hù)氧化損傷細(xì)胞的一種關(guān)鍵酶，它通過清除軟骨損傷所產(chǎn)生的氧自由基，緩解關(guān)節(jié)軟骨被破壞，起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨作用[12,13]，從而抑制機(jī)體過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞免受氧自由基的損傷，SOD 可以參與機(jī)體抗感染、免疫及炎癥反應(yīng)[14]。通過測定血清中SOD的含量變化，可反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力[15]。因此，測定KAO 兔血清中MDA、SOD 和LPO 含量變化，可以研究機(jī)體軟骨細(xì)胞的受損程度，以及治療手段對(duì)KOA 是否有效。孫材江等[16]檢測了骨關(guān)節(jié)炎患者機(jī)體內(nèi)自由基水平，發(fā)現(xiàn)該類患者紅細(xì)胞內(nèi)SOD 含量明顯降低，血漿中LPO 含量明顯增高，表明氧自由基影響了軟骨細(xì)胞膠原合成，造成了脂質(zhì)過氧化，使軟骨細(xì)胞膠原合成場受到了損害。Shingu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基參與了軟骨基質(zhì)降解，軟骨細(xì)胞膠原酶的激活受到影響，抑制了軟骨基質(zhì)的降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組中兔血清中MDA 和LPO 含量明顯高于正常組，SOD 含量明顯低于正常組，說明氧自由基參與了KOA 的發(fā)病，經(jīng)活血軟膏治療后，MDA 和LPO 含量明顯下降，SOD 含量明顯升高，說明活血軟膏具有清除氧自由基作用，對(duì)軟骨組織損傷有治療作用，并能明顯改善KOA 兔的行走狀態(tài)，對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷，亦有明顯的修復(fù)作用。其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。