陳 雪 張嫄怡 段文彪

1.肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室，廣東肇慶 526020；2. 肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校學(xué)校辦公室，廣東肇慶 526020

腦缺血再灌注損傷是腦組織出現(xiàn)供血中斷后再恢復(fù)血流灌注時(shí)出現(xiàn)的病理?yè)p傷過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，主要與鈣超載、氧化應(yīng)激、能量衰竭、炎癥凋亡等有關(guān)[1]。 腦缺血再灌注損傷，破壞血腦屏障，引起大量炎癥因子釋放，損傷神經(jīng)元，繼而造成腦功能障礙[2]。炎癥小體通路激活后，細(xì)胞會(huì)進(jìn)行程序性死亡，細(xì)胞焦亡在腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)元損傷中越來(lái)越受重視。 二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glucoside，TSG）是中藥何首烏中主要的水溶性生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈血管硬化、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)等作用。 目前對(duì)TSG 在腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型中的研究主要是通過(guò)清除自由基、 抗氧化、抑制細(xì)胞鈣超載等來(lái)保護(hù)腦神經(jīng)元細(xì)胞，影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 本研究通過(guò)建立腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型， 探索TSG 對(duì)受損的海馬組織Nalp3、Caspase-1 及IL-18 表達(dá)的影響， 探究TSG 抗炎癥反應(yīng)的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

mRNA 提取試劑盒和DNA Marker（天根生化科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 反應(yīng)體系（莫納生物科技有限公司），引物（武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司），TSG（上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)：178031025），PCR 擴(kuò)增儀（上海力康生物醫(yī)療科技有限公司，T960A），瓊脂糖水平電泳槽（北京六一生物科技有限公司，DYCP-31DN），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon4100）。 實(shí)驗(yàn)所需的儀器由肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？蒲衅脚_(tái)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型的制備

健康雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，2月齡，體重（200±10）g，購(gòu)買(mǎi)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0001]，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃，濕度約55%，明暗交替時(shí)間為12 h/12 h，自由攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。 大鼠隨機(jī)分為5 組，即假手術(shù)組、模型組、TSG 低劑量組、TSG 中劑量組、TSG 高劑量組，每組12 只。 大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水。

采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈制備腦缺血再灌注損傷模型。 用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥固定，備皮，手術(shù)區(qū)域常規(guī)消毒后沿頸部正中線作一縱形切開(kāi)，用玻璃分針小心鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈2 h 后，取下動(dòng)脈夾恢復(fù)血流再灌注，縫合皮膚，傷口抗感染處理。假手術(shù)組接受相似的手術(shù)操作，但不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈。 TSG 低、中、高劑量組缺血再灌注后30 min 開(kāi)始腹腔注射給藥，劑量分別為30、60、90 mg/kg、，連續(xù)給藥7 d，每天給藥一次。 假手術(shù)組、模型組均采用相同的給藥方式給予等劑量的生理鹽水。本研究已經(jīng)過(guò)肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.3 腦組織含水的測(cè)定

術(shù)后第8 天，每組隨機(jī)選取4 只大鼠，麻醉，斷頭取腦，舍棄小腦及腦干等，稱量腦濕重量，其后把已包裹錫紙的腦組織放于烘箱中烘干48 h 后， 取出再次稱量腦重量為干重，計(jì)算腦組織含水量，腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4 大鼠腦組織HE 染色

大鼠麻醉仰臥固定后， 用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，取出腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，取材，脫水，透明，石蠟包埋，常規(guī)切片HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)大鼠海馬Nalp3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-18 mRNA 的表達(dá)

PCR 反應(yīng)體系（參考PCR 說(shuō)明書(shū)）：Taq Master Mix 25 μl，上下游引物各1 μl（0.4 μmol/L），模板DNA 0.4 μg，加DEPC 水補(bǔ)至50 μl。 PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃，2 min，變性94℃，30 s，退火55～65℃，30 s，延伸72℃，1 min，終延伸72℃，5 min（30 個(gè)循環(huán)）。 Nalp3 引物序列：正向5′-GAGGAGTGGATAGGTTTGCTG-3′，反向5′-TGGGTGTGACGTCTGTTGAG-3′；Caspase-1 引物序列：正向5′-ACCGAGTGGTTCCCTCAAGT-3′，反向5′-CGTGTACGAGTGGGTGTTTTC-3′；IL-18 引物序列：正向5′-GGCTGCCATGTCAGAAGAAG-3′，反向5′-GCTCCGTATTACTGCGGTTGT-3′。 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 用全自動(dòng)圖像分析儀分析電泳結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)改變

假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞排列整齊致密，形態(tài)正常，呈橢圓形，染色勻稱，核膜清晰，淺藍(lán)紫色的胞核，可見(jiàn)顯著的核仁。 模型組大鼠海馬可見(jiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，染色變深，細(xì)胞核不明顯，核質(zhì)混為一體。 TSG 低劑量組模型組大鼠海馬可見(jiàn)大部分神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核染色變深，核固縮明顯，神經(jīng)細(xì)胞病理性損傷改善不明顯。 TSG 中劑量組模型組及TSG 高劑量組海馬組織較模型組的神經(jīng)細(xì)胞損傷程度明顯減輕，只見(jiàn)少部分核固縮的改變（圖1，封三）。

2.2 五組大鼠腦組織含水量的測(cè)定

五組大鼠的腦組織含水量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組及TSG 低、中、高劑量組大鼠的腦組織含水量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TSG 中、 高劑量組大鼠的腦組織含水量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化（±s）

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化（±s）

注 與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；TSG：二苯乙烯苷

組別 n 腦含水量（%）假手術(shù)組模型組TSG 低劑量組TSG 中劑量組TSG 高劑量組F 值P 值44444 75.247±2.118 83.981±2.750a 82.306±2.462a 80.120±2.278ab 79.116±2.245ab 7.841＜0.001

2.3 五組大鼠海馬區(qū)Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達(dá)的比較

五組大鼠海馬區(qū)的Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； 模型組大鼠海馬區(qū)內(nèi)Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達(dá)水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TSG 中、高劑量組大鼠海馬Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠海馬區(qū)Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA表達(dá)的結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠海馬區(qū)Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA表達(dá)的結(jié)果（±s）

注 與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；TSG：二苯乙烯苷；IL-18：白介素-18

組別 n Nalp3 mRNA Caspse-1 mRNA IL-18 mRNA假手術(shù)組模型組TSG 低劑量組TSG 中劑量組TSG 高劑量組F 值P 值44444 0.958±0.035 1.243±0.050a 1.186±0.057a 1.111±0.053ab 1.040±0.048ab 21.188＜0.001 0.832±0.034 0.991±0.048a 0.968±0.046a 0.927±0.039ab 0.900±0.038ab 8.983＜0.001 0.824±0.041 1.153±0.054a 1.088±0.052a 1.059±0.051ab 1.029±0.051ab 24.771＜0.001

3 討論

缺血性腦病的發(fā)病率、致殘率、死亡率逐年升高，嚴(yán)重危害老年人的生活質(zhì)量甚至是生命，腦缺血會(huì)導(dǎo)致缺血區(qū)域相應(yīng)的功能障礙，目前治療腦缺血的主要方法是恢復(fù)血流灌注[3]。 腦缺血再灌注可通過(guò)炎癥反應(yīng)、凋亡、氧化應(yīng)激等多種損傷機(jī)制造成神經(jīng)細(xì)胞不可逆性損傷、腦水腫，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜及未明確，而且目前尚未有有效的治療方案避免腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷與炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞焦亡密切相關(guān)，各類炎癥因子（IL-18、IL-1β 等）的活化參與了細(xì)胞焦亡過(guò)程。 細(xì)胞焦亡屬于炎癥程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞體積不斷增大，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，產(chǎn)生大量的促炎癥因子，導(dǎo)致劇烈的炎癥反應(yīng)。 細(xì)胞焦亡既可引起細(xì)胞的死亡，也可引起組織損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]。 細(xì)胞焦亡是由Caspse-1 介導(dǎo)的，與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞程序性死亡。炎癥因子的過(guò)度釋放及伴隨繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷惡化的其一重要原[5]。腦缺血再灌注后，受損的細(xì)胞功能不但難以恢復(fù)，而且，還可激活因缺血產(chǎn)生的炎癥因子和過(guò)氧化物，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生更嚴(yán)重的損傷或者死亡。 通過(guò)抑制Caspse-1 的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減輕缺血再灌注損傷，為治療缺血再灌注損傷提供新途徑。

目前，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[6]。 Nalp3 炎癥小體在腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的損傷中起著重要的作用。 Nalp3 炎癥體是研究比較透徹的炎癥復(fù)合體。Nalp3 參與炎癥性疾病， 應(yīng)激性疾病及免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。 Nalp3 炎癥體是細(xì)胞內(nèi)的一種模式識(shí)別受體，是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，在激發(fā)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)控功能，可誘導(dǎo)腦缺血再灌注損傷發(fā)生炎癥反應(yīng)， 從而引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷及細(xì)胞焦亡。Nalp3 在識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)的過(guò)程中被激活，招募轉(zhuǎn)接蛋白ASC 及Caspse-1 組裝成Nalp3 炎癥復(fù)合體，從而激活Caspse-1， 激活下游IL-1β 前體及IL-18 前體， 進(jìn)而引起炎癥瀑布反應(yīng)。 在正常的生理狀態(tài)下，Nalp3 炎癥體處于抑制狀態(tài)，但容易被激活。當(dāng)腦缺血再灌注時(shí)，會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激、鈣超載、自由基損傷、微循環(huán)障礙等，這些危險(xiǎn)信號(hào)都可被Nalp3 識(shí)別，激活Nalp3 炎癥體， 誘導(dǎo)腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)。Nalp3 炎癥小體的活化與腦缺血再灌注損傷的損傷緊密相關(guān)[8]。 腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)升高， 減少炎癥反應(yīng)可減輕腦缺血再灌注損傷的損傷程度[9]。 腦缺血時(shí)，腦細(xì)胞的代謝障礙，能量生成減少，腦細(xì)胞出現(xiàn)損傷甚至是死亡。 在本研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷嚴(yán)重，細(xì)胞體積縮小，可見(jiàn)明顯的核固縮的改變，海馬中的炎癥因子Nalp3、Caspse-1、IL-18 表達(dá)升高， 腦缺血再灌注損傷與炎癥反應(yīng)有關(guān)。 腦缺血再灌注時(shí)，可激活炎癥因子，誘發(fā)大腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞焦亡程序，導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡[10]。

TSG 是何首烏中的水溶性生物活性有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血脂、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[11]。 TSG 與白藜蘆醇具有相似的結(jié)構(gòu)，僅在二位多一個(gè)酚羥基，都屬于二苯乙烯類。 白藜蘆醇可通過(guò)抑制Nalp3 炎癥小體活化后沉默調(diào)節(jié)蛋白1依賴的自噬活動(dòng)來(lái)改善腦缺血再灌注損傷[12]。 在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型中， 病變側(cè)大腦半球Nalp3、Caspse-1、IL-1β 和IL-18 表達(dá)上升，并上調(diào)自噬活動(dòng)，減輕腦缺血再灌注損傷中Nalp3 炎癥小體引起的炎癥反應(yīng)，下調(diào)自噬，減少腦梗死體積、腦水腫減輕[13]。孫玉潔等[14]研究證實(shí)白藜蘆醇可通過(guò)提高大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞的Nalp3 炎癥小體、Caspase-1 水平，降低閉鎖小帶蛋白-1 的水平， 抑制腦缺血再灌注過(guò)程中的細(xì)胞焦亡，從而保護(hù)腦功能。TSG 在關(guān)節(jié)炎、腸道炎癥及脂肪性肝炎中具有良好的抗炎作用[15]。 IL-18在感染性疾病和慢性炎癥反應(yīng)中具有重要的作用[16]。IL-1β 和IL-18 表達(dá)升高，可誘導(dǎo)受損傷局部聚集更多的炎癥細(xì)胞，加重腦組織損傷[17]。 本實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)制備腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型， 給予TSG 腹腔注射干預(yù)，發(fā)現(xiàn)TSG 中高劑量可減輕腦水腫，降低腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織中的Nalp3、Caspse-1、IL-18 的表達(dá)，提高抗炎能力，從而減輕腦缺血再灌注損傷。TSG 能降低Nalp3、Caspse-1 以及IL-18 的表達(dá)，減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 王齊等[18]研究發(fā)現(xiàn)TSG 可上調(diào)腦缺血再灌注沙鼠腦內(nèi)B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）水平，降低P53 和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）水平，以調(diào)節(jié)線粒體膜上鈣離子的內(nèi)流來(lái)維持完整的線粒體膜，調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。TSG 可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的釋放，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減輕炎癥損傷作用[19]。 TSG 能通過(guò)抑制腦缺血再灌注損傷的腦組織氧化應(yīng)激蛋白煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3/9 的表達(dá)發(fā)揮腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[20]。 TSG可通過(guò)抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激損傷、抗凋亡等多種途徑發(fā)揮其對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，TSG 可抑制炎癥因子Nalp3、Caspse-1、IL-18 表達(dá)，減少炎癥因子的活化，減輕炎癥損傷反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用。TSG 可通過(guò)多種途徑發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，這需要我們更深入的研究，為腦缺血再灌注損傷的防治提供新的方案。