王志慧，劉炳炎，黃彩霞，邱鵬瀅，潘宇睦，鄭文珺，王俊濤，蘆光新

(青海大學(xué)，青海 西寧 810016)

目前，隨著種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?、集約化發(fā)展，以玉米、小麥、稻谷秸稈和畜禽糞便為主的農(nóng)業(yè)廢棄物大部分被隨意棄置，造成了有機(jī)肥資源巨大的浪費(fèi)及較為嚴(yán)重的環(huán)境污染[1-3]。因此，如何合理處置農(nóng)業(yè)廢棄物以減少對環(huán)境的污染就顯得尤為重要。為響應(yīng)國家綠色環(huán)保的發(fā)展政策，針對畜禽糞便的處理，好氧堆肥發(fā)酵是最有效可行的方式之一。高溫好氧堆肥是在合適的條件下利用多種微生物將固體有機(jī)物進(jìn)行分解并逐步轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定腐殖質(zhì)的復(fù)雜生物學(xué)過程[4]。黃繼川等[5]利用盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化肥與堆肥配施能夠改善土壤的酸度，提高養(yǎng)分的有效性，有利于作物的吸收。仝少偉等[6]采用啤酒污泥、牛糞和菇渣進(jìn)行堆肥試驗(yàn)表明，以含有活性小顆粒啤酒污泥堆肥對土壤呼吸和微生物生物量碳、氮、磷的影響最為明顯。堆肥中微生物數(shù)量及種群分布與多種因素有關(guān)[7]，了解堆肥過程中微生物變化對于縮短堆體腐熟時間具有重要意義。目前,關(guān)于自然堆肥過程中可培養(yǎng)細(xì)菌群落多樣性等方面的研究甚少。鑒于此，本研究將新鮮豬糞與油菜秸稈按照一定比例混勻自然堆肥，同時對自然堆肥中的溫度變化，可培養(yǎng)細(xì)菌的種類和多樣性進(jìn)行分析，旨在探討自然堆肥過程中微生物的變化與發(fā)酵過程的關(guān)系，以期為后續(xù)堆肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料 新鮮豬糞，油菜秸稈(將其粉碎至粒徑1～3 cm)。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將新鮮豬糞與油菜秸稈按照質(zhì)量比3∶1混勻，調(diào)節(jié)含水率為60%～70%，堆成底部直徑1 m、高0.7 m的圓錐形。C/N比控制在25∶1～30∶1。堆肥時間從6月1日至7月17日，整個堆肥階段為47 d。每4 d翻堆前取樣，樣品均從堆體內(nèi)部選取，從每堆上、中、下三個方向的縱切面進(jìn)行取樣，混勻后裝入樣袋進(jìn)行后續(xù)測定，共取樣12次。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與測定

1.2.1 牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基制備 牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離及純化鑒定 將1 g樣品加入至99 mL滅菌的蒸餾水中，配制成懸浮液(加入鏈霉素抑制非目標(biāo)培養(yǎng)物)，利用常規(guī)培養(yǎng)手段進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，期間觀察菌落形態(tài)，最后選取不同形態(tài)的群落進(jìn)行純化、保存、鑒定。

1.2.3 微生物菌落測定 采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌數(shù)測定。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 溫度的測定 分別在每天上午10：00和下午15：00使用溫度計(jì)測量堆體上、中、下層的溫度，計(jì)算其平均值并做好記錄。本試驗(yàn)溫度劃分為升溫階段:堆肥初期，溫度不斷上升；高溫階段:溫度上升至50 ℃以上,并保持一段時間，隨后又逐漸降低；降溫階段:高溫后溫度逐漸下降并穩(wěn)定；腐熟階段:處于堆肥后期，堆體的含水量降低，無刺激性氣味，堆體呈黑色或棕黑色。

1.3.2 菌種鑒定

(1)菌株基因組DNA的提取。用接種環(huán)蘸取經(jīng)純化的菌落放入液體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35 ℃、120 r/min 條件下振蕩，至培養(yǎng)基由澄清變?yōu)闇啙?，制備的菌液用于提取?xì)菌DNA。菌株DNA采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(編號：B518255-0050)進(jìn)行提取，采用16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：模板DNA 1 μL，上下游引物各2 μL(濃度10 μmol/L)，2X SanTaq PCR Mix 25 μL，ddH2O 20 μL；反應(yīng)程序：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，57 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃、15 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

(2)菌株16S rDNA序列分析。將測序所得的序列用Contig Express軟件做序列拼接，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對，下載同源性高的序列及模式菌株的序列，選用MEGA 7.0軟件上的Clustal W功能進(jìn)行序列比對，用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.4 群落結(jié)構(gòu)特征分析

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征用物種豐富度、相對多度、Simpson優(yōu)勢度、Shannon多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)等指標(biāo)[8-10]表示：

物種豐富度(S)即群落中的物種數(shù)，指自然堆肥中樣品分離得到的細(xì)菌屬級物種數(shù)。

相對多度(Pi)指群落中某一物種的多度占所有物種的多度之和的百分比。

Pi=Ni/N

式中：N為物種總數(shù)；Ni為第i物種個體總數(shù)(本文以屬級為單位統(tǒng)計(jì)菌落數(shù))。

Simpson優(yōu)勢度(D指數(shù))在生態(tài)學(xué)中主要反映群落中最常見的物種，評估微生物群落豐富度。

Shannon多樣性指數(shù)(H指數(shù))在生態(tài)學(xué)中用來估算群落多樣性的高低。

式中：H′為物種的多樣性指數(shù)；S為物種(本文為屬級單位，下同)總數(shù)；Pi為第i種物種個體數(shù)占群落總個體數(shù)的比例。

Pielou均勻度指數(shù)(J指數(shù))在生態(tài)學(xué)中用來反映物種豐富度。

J=H′/lnS

式中：J為均勻度指數(shù)；H′為Shannon多樣性指數(shù)；S為物種種數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用DPS6.55對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然堆肥中溫度的變化

由圖1可知，堆體整體的溫度變化趨勢大致為先升高后下降。1～2 d為升溫階段，堆體初始溫度為48.3 ℃，之后溫度不斷上升，第2天溫度升至51.5 ℃；3～27 d為高溫階段，隨著堆肥時間的延長，溫度持續(xù)升高，第8天堆體最高溫度達(dá)到最大值，為68.0 ℃，此階段平均溫度為59.5 ℃；28～39 d為降溫階段，該階段的溫度隨堆肥時間的持續(xù)開始下降，平均溫度為49.7 ℃；此后堆體進(jìn)入腐熟階段，該階段因微生物的活動減少而導(dǎo)致溫度下降，平均溫度為32.9 ℃。在整個自然堆肥過程中溫度>50 ℃共有28 d，符合GB 7959—2012《糞便無害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[11]。

圖1 自然堆肥發(fā)酵的溫度變化Fig.1 Temperature variation of natural composting fermentation

2.2 自然堆肥中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)及物種數(shù)

經(jīng)16S rDNA分子鑒定后，分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌種類共有16屬，細(xì)菌菌落數(shù)總計(jì)29 108個(表1)，其中微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)的菌落數(shù)最多，占總細(xì)菌菌落數(shù)的30.62%；其次為沙門氏菌(Salmonellabongori)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，分別占總細(xì)菌菌落數(shù)的20.32%和20.21%；其余13種細(xì)菌的菌落數(shù)較少，占總細(xì)菌菌落數(shù)的28.85%。

表1 自然堆肥中可培養(yǎng)細(xì)菌物種數(shù)量及所占比例

表2為自然堆肥中細(xì)菌數(shù)量及物種數(shù)的變化情況。由表可知，堆體初始溫度為48.3 ℃，此時堆體處于升溫階段(<50 ℃)，菌落數(shù)為4 738個，物種數(shù)有5種。3～27 d為高溫階段(>50 ℃)，其中第8天的溫度為68.0 ℃，第21天的溫度為57.0 ℃，物種數(shù)均有6種；第12天的溫度為53.7 ℃，細(xì)菌菌落數(shù)最多，達(dá)到5 776個。第28天之后，堆體溫度下降并開始腐熟，直至堆肥結(jié)束，溫度為29.2 ℃，細(xì)菌菌落數(shù)有2 075個，物種數(shù)有2種。由此可知，隨著堆肥時間及溫度的變化，堆體細(xì)菌菌落數(shù)和物種數(shù)逐漸減少。

表2 自然堆肥中細(xì)菌數(shù)量及物種數(shù)變化

2.3 自然堆肥中不同菌株(屬)優(yōu)勢度比較

某物種占整體物種的比例≥0.1為優(yōu)勢屬，0.01～0.1為常見屬，≤0.01為稀有屬[12]。由圖2可知，16個菌株中，微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物內(nèi)生賴氨酸芽孢桿菌等4種菌為優(yōu)勢種；弗氏大腸桿菌、消化鏈球菌、嗜酸酸桿菌、熱帶芽孢桿菌、米曲芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌等6種菌為稀有種；大腸桿菌、沙門氏菌、海洋芽孢桿菌、不動桿菌、嬰兒芽孢桿菌和花椒芽孢桿菌等6種菌為常見種。

圖2 自然堆肥中可培養(yǎng)細(xì)菌菌株優(yōu)勢度Fig.2 Dominance of culturable bacterial strain in natural composting

2.4 自然堆肥中可培養(yǎng)細(xì)菌群落多樣性分析

由表3可知，在自然堆肥過程中，微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌的Simpson優(yōu)勢度最大，顯著高于其他菌株(P<0.05)；沙門氏菌的Shannon指數(shù)、Pielou指數(shù)最大，且與其他菌株存在顯著差異(P<0.05)。微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌生長的最適溫度為30 ℃[13]，沙門氏菌為37 ℃[14]，且在前兩次樣品微生物培養(yǎng)中菌落數(shù)較多，分別為2 247個和1 063個(表4)，此時堆體處于高溫階段，大部分的嗜溫細(xì)菌(超過60%)能夠在堆肥的高溫期分離出來[15]。隨著堆體發(fā)酵時間的持續(xù)，整體上細(xì)菌菌落數(shù)逐漸減少，直至消失。由此可見，物種多樣性與堆肥溫度有關(guān)。

表3 自然堆肥中可培養(yǎng)細(xì)菌群落多樣性

表4 自然堆肥中樣品菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)表

3 討論與結(jié)論

溫度是堆肥過程中非常重要的變量[16]。有研究表明，堆肥最佳溫度一般保持在50～60 ℃，此溫度范圍內(nèi)有利于殺死糞便中的病原菌。過低的堆肥溫度(<40 ℃)能夠抑制微生物活動，延長堆肥腐熟的時間；過高的堆肥溫度(>70 ℃)將對堆肥微生物產(chǎn)生有害影響[17]。堆肥溫度高于55 ℃必須保持3 d以上，才能殺死病原菌，達(dá)到無害化標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。本研究的堆肥溫度連續(xù)有9 d高于55 ℃，堆肥內(nèi)的病原菌已被有效殺死。C/N是有機(jī)肥發(fā)酵過程中的一個關(guān)鍵因素，不合適的C/N會影響微生物的生長、有機(jī)物的分解和發(fā)酵時長[20]。黃國鋒等[21]提出堆肥起始的C/N在25∶1～30∶1為堆肥的最佳條件。本試驗(yàn)中自然堆肥的C/N控制在25∶1～30∶1，且高溫階段維持在50～60 ℃的時間較長，說明自然堆肥的發(fā)酵效果良好。

在發(fā)酵過程中，細(xì)菌可以將堆肥物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為有機(jī)物并伴隨熱量的產(chǎn)生。在本次堆肥試驗(yàn)的發(fā)酵過程中，細(xì)菌數(shù)量整體呈“下降—升高—下降”的趨勢，在高溫階段菌落數(shù)與物種數(shù)增加，這與劉佳等[22]的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樵囼?yàn)材料和環(huán)境不同導(dǎo)致微生物群落變化存在差異。本試驗(yàn)在前中期的時候，細(xì)菌數(shù)量急速上升，溫度也不斷上升，最高溫度達(dá)到68 ℃。這是由于升溫階段堆肥內(nèi)的微生物可以利用現(xiàn)有的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行快速繁殖，使菌群數(shù)量急速增加；微生物因活動而產(chǎn)生熱量，使得溫度隨著發(fā)酵時間的延長逐漸升高。另外，在自然堆肥過程中發(fā)現(xiàn)，升溫階段微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌和沙門氏菌占主導(dǎo)地位，這可能是由于嗜溫細(xì)菌在高溫階段形成了微菌落的原因。隨著嗜熱細(xì)菌活性的減弱，堆肥的溫度開始降低，嗜溫細(xì)菌又開始占主導(dǎo)地位[14]。

綜上可知，本研究通過對自然堆肥過程中可培養(yǎng)細(xì)菌群落多樣性的研究，發(fā)現(xiàn)在堆肥發(fā)酵過程中，前中期階段細(xì)菌的主要優(yōu)勢菌以微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌屬、沙門氏菌屬和解淀粉芽孢桿菌屬為主；隨著發(fā)酵時間的延長，微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌屬、沙門氏菌屬和解淀粉芽孢桿菌屬的數(shù)量逐漸減少甚至消失；堆肥后期以芽孢桿菌屬(枯草芽孢桿菌屬和花椒芽孢桿菌屬)為主。本研究結(jié)果為自然堆肥可培養(yǎng)細(xì)菌的后續(xù)菌落特征研究提供一定的理論參考。