馬金輝 劉 潔 李媛媛 宋彥坤 鄭立雙 檀迎會 郗 昕

1.河北大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北保定 071000；2.河北省第六人民醫(yī)院普通精神科，河北保定 071000；3.河北大學醫(yī)學院，河北保定 071000；4.河北大學附屬醫(yī)院科研處實驗中心，河北保定 071000

2 型糖尿病發(fā)病機制尚不明確，目前認為胰島素抵抗起著主要作用[1-4]。胰島素抵抗與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）密切相關，GLUT4是存在于肌肉及脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的主要亞型，是維持血糖穩(wěn)定的重要因素[5-8]。胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展都有氧化應激的參與，與機體內(nèi)抗氧化防御體系功能紊亂和自由基的增多有關[9-12]。已有研究證實在3T3-L1 脂肪細胞中，長時間胰島素刺激會引起GLUT4 減少，降低胰島素反應性[13-15]。這一負面效應與其增加細胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平密切相關[16-18]。氧化應激的主要特點是ROS 的產(chǎn)生和抗氧化酶之間的不平衡。任何原因破壞了這一平衡系統(tǒng)，就會啟動氧化應激的損傷機制[19]。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是人體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶，與2 型糖尿病氧化應激密切相關[20-23]?；诖?，我們推測在3T3-L1 脂肪細胞中，胰島素對GLUT4 的負性調(diào)控可能不僅是促進ROS 產(chǎn)生，抗氧化酶系也可能發(fā)揮了一定作用。本研究通過檢測胰島素對GSH-Px 表達的影響及GSHPx 抑制劑Mercaptosuccinate（MS）對GLUT4 表達的影響探討GSH-Px 在胰島素負性調(diào)控GLUT4 過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

3T3-L1 小鼠前脂肪細胞株（CL-173）購于美國標準生物品收藏中心（ATCC）；DMEM 高糖（貨號：C1199 5500BT）、低糖（貨號：C11885500BT）培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（貨號：T1300）、胰島素（貨號：I8040）購于北京索萊寶科技有限公司；地塞米松（貨號：HY-14648）購于MedChemExpress 公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）（貨號：15879-100MG）、脂質(zhì)（油紅O）染色試劑盒（貨號：MAK194）購于Sigma 公司；mercaptosuccinate（貨號：M0064）購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；TRIzol（貨號：RK145）、TIANScript RT Kit（貨號：KR104）、Super-Real PreMix Plus（貨號：FP205）購于天根生化科技（北京）有限公司；GLUT4 抗體（貨號：ab654）購于艾博抗公司；α-tubulin 抗體（貨號：66031-1-Ig）、羊抗鼠（貨號：SA00001-1）、羊抗兔（貨號：SA00001-2）二抗購于Proteintech 公司。

1.2 3T3-L1 細胞培養(yǎng)及誘導

3T3-L1 前脂肪細胞用含10%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照文獻[24]報道的雞尾酒法將其分化為脂肪細胞。

1.3 油紅O 染色

3T3-L1 前脂肪細胞及誘導分化后第5、8 天，按試劑盒說明書進行油紅O 染色，倒置顯微鏡下觀察脂滴。

1.4 總RNA 提取及熒光定量PCR

3T3-L1 前脂肪細胞接種于6 孔板，誘導分化成熟后用500 nmol/L 胰島素刺激1 h，用TRIzol 法提取細胞總RNA。用TIANScript RT Kit 合成cDNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。用SuperReal PreMix Plus 試劑盒進行PCR 擴增反應。反應總體積25 μl：cDNA 5 μl、引物1.5 μl、2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μl、50×ROX Reference Dye 0.5 μl、RNase-free ddH2O 5.5 μl。用ABI 7300 型熒光定量PCR 儀進行擴增。循環(huán)條件為：95℃預變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火/延伸32 s，共40 個循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參基因。采用2－ΔΔCt法計算基因表達相對含量。GSH-Px1 正向引物：5’-GTTTGAGAAGTGCGAAGTGAAT-3’，反向引 物：5’-CGGAGACCAAATGATGTACTTG-3’（產(chǎn)物長度：130 bp）；GSH-Px4 正向引物：5’-GATAAGAACGGCTGCGTGGTG-3’，反向引物：5’-AGATAGCACGGCAGGTCCTTC-3’（產(chǎn)物長度：80 bp）；GSH-Px7 正向引物：5’-CAGGACTTCTACGACTTCAAGG-3’，反向引物：5’-A-AGCACATTAAAATGATGGGGG-3’（產(chǎn)物長度：180 bp）；β-actin 正向引物：5’-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3’，反向引物：5’-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3’（產(chǎn)物長度：90 bp）。

1.5 SDS-PAGE 電泳及Western blot 檢測

3T3-L1 脂肪細胞分別用10 或20 mmol/L 的MS處理4 h 后加入或不加500 nmol/L 胰島素刺激4 h，RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白，Bradford 法測定各組細胞蛋白濃度，用10% SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（120 mA，3 h）。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應一抗4℃孵育過夜。TBS-T 漂洗（5 min，6 次）后加入相應HRP 標記的二抗，室溫孵育1 h，TBS-T漂洗（5 min，6 次），ECL 發(fā)光顯影。應用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值計算相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1 前脂肪細胞分化及鑒定

3T3-L1 前脂肪細胞呈長梭形（圖1A）；誘導分化后第5 天可見細胞逐漸變?yōu)榍蛐?，胞?nèi)可見細小脂滴（圖1B）；誘導分化后第8 天可見細胞進一步變?yōu)榍蛐吻野麅?nèi)脂滴明顯增多（圖1C）。

圖1 3T3-L1 前脂肪細胞誘導分化為脂肪細胞（油紅O 染色，100×）

2.2 胰島素對GSH-Px mRNA 相對表達量的影響

胰島素組GSH-Px1、GSH-Px4、GSH-Px7 mRNA相對表達量比對照組低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 胰島素對GSH-Px mRNA 相對表達量的影響

2.3 MS 對GLUT4 蛋白表達的影響

2.3.1 胰島素不存在的條件下，MS 對GLUT4 蛋白表達的影響 胰島素不存在的條件下，10 mmol/L MS 處理組與MS 未處理組GLUT4 蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；20 mmol/L 處理組GLUT4 蛋白表達較MS 未處理組低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 胰島素不存在的條件下MS 對GLUT4 蛋白表達的影響

2.3.2 胰島素存在的條件下，MS 對GLUT4 蛋白表達的影響 胰島素存在的條件下，10 mmol/L MS 處理組與MS 未處理組GLUT4 蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；20 mmol/L 處理組GLUT4 蛋白表達較MS 未處理組低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 胰島素存在的條件下MS 對GLUT4 蛋白表達的影響

3 討論

GLUT4 是存在于肌肉及脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的主要亞型，在基礎狀態(tài)時GLUT4 主要位于細胞內(nèi)的GLUT4 貯存囊泡（GLUT4 storage vesicles，GSVs）及反式高爾基網(wǎng)等細胞區(qū)隔中[7]。進餐后血糖升高促進胰島素分泌，胰島素促使GSVs 在胞吐作用下轉(zhuǎn)位至細胞外膜，將葡萄糖轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。已有研究證實，長時間的胰島素刺激會引起GLUT4 呈劑量依賴性減少且主要是對胰島素應答的GSVs 減少，而使葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對胰島素反應性降低[13-15]。有研究表明，在3T3-L1 脂肪細胞中添加胰島素后GLUT4 的半衰期由原來無胰島素狀態(tài)時的50 h 降至15.5 h[14]，并且溶酶體抑制劑的添加有效阻止了這一過程[25]。長時間胰島素刺激對GLUT4 的負性調(diào)控主要是因為其促進GLUT4 分選至溶酶體途徑降解，并且此過程與胰島素引起ROS 產(chǎn)生關系密切[16]。有研究報道NADPH氧化酶4 可促進胰島素刺激的脂肪細胞產(chǎn)生ROS[18]。本研究結(jié)果顯示，胰島素刺激下調(diào)了GSH-Px 的轉(zhuǎn)錄水平，提示胰島素刺激對抗氧化防御酶系的抑制作用。MS 可與胰島素同樣減少GLUT4 表達，提示抗氧化防御酶系GSH-Px 的活性可影響GLUT4 蛋白的表達。胰島素不僅可通過NADPH 氧化酶4 等促進ROS 產(chǎn)生也可通過下調(diào)GSH-Px 家族的表達來影響細胞內(nèi)ROS 的水平而負性調(diào)控GLUT4。為進一步研究胰島素促進ROS 的產(chǎn)生負性調(diào)控GLUT4 提供了線索。由于有限的經(jīng)費及實驗時間，本研究還未檢測長時間胰島素刺激對GSH-Pxs 蛋白表達及活性的影響，以及其他抗氧化酶系如catalase 等是否也參與了這一過程也有待進一步研究證實。