徐秋玲 鄭學(xué)芝 王文婷 張緒東 郭 冉

牡丹江醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江牡丹江 157011

糖尿病是一種慢性內(nèi)分泌和代謝紊亂疾病，糖尿病心肌病是糖尿病的并發(fā)癥之一[1]。線粒體功能障礙、自噬和炎癥參與心臟肥大和心肌纖維化的病理機制，增加心力衰竭的風(fēng)險[2]。 線粒體呼吸鏈復(fù)合物功能異常參與糖尿病鼠腦組織損傷的病理過程[3]，線粒體呼吸鏈復(fù)合物是否參與糖尿病心肌損傷的病理過程報道較少。 黃芩苷（C21H18O11）是中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜、調(diào)節(jié)免疫等作用[4-6]。 黃芩苷能改善鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對糖尿病鼠心肌有保護作用，但黃芩苷對心肌的保護作用是否與心肌線粒體有相關(guān)性報道較少。本研究探討黃芩苷對糖尿病鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物的保護作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

24 只健康雄性SD 鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于SPF/VAF 級動物室，室溫18～25℃，相對濕度50%～80%，每日光照12 h，自由攝食、飲水。 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。動物實驗經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與和試劑

血糖儀（美國強生公司，20202221732），熒光定量PCR 儀（美國Invirtogen 公司，A43162），黃芩苷（Sigma公司，MFCD00134418），生理鹽水配制藥液，STZ（美國Sigma 公司，MFCD00006607）， 線粒體呼吸鏈復(fù)合物試劑盒（南京建成生物工程研究所，A089-1、A089-2、A089-3、A089-4）， 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（quantitative real-time PCR，qPCR）試劑盒（美國Invirtogen 公司，F(xiàn)455XL），一抗兔抗鼠ND1（M02292）、β-actin 多克隆抗體（BM3873）和羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，BA1039）。

1.3 實驗分組及處理

取24 只雄性SD 鼠隨機分為對照組（6 只）、黃芩苷對照組（6 只）、模型組（6 只）、治療組（6 只）。 其中對照組用正常普通飼料飼養(yǎng)， 同時腹腔注射與黃芩苷等容積的生理鹽水；黃芩苷對照組用正常普通飼料飼養(yǎng)，同時腹腔注射黃芩苷藥液15 μmol/（L·kg·d）。模型組和治療組尾靜脈注射STZ 45 mg/kg（溶于0.1 mmol/L 枸櫞酸緩沖液），72 h 后連續(xù)2 次空腹血糖≥16.7 mmol/L 為糖尿病模型。 模型組用正常普通飼料飼養(yǎng)， 同時腹腔注射與黃芩苷等容積的生理鹽水；治療組用正常普通飼料飼養(yǎng)，同時腹腔注射黃芩苷藥液15 μmol/（L·kg·d）。 連續(xù)用藥8 周后，動物禁食12 h，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔麻醉，然后在冰上快速取心臟組織，稱重記錄，放入液氮10 s，然后置于-80℃冰箱中冷凍儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 各組鼠血糖值比較 斷尾收集血樣，采用血糖監(jiān)測儀（試紙）法測定血糖。

1.4.2 電鏡觀察心肌線粒體 將心肌組織切成小塊（＜1 mm3）， 迅速置于4°C 的4%戊二醛中進行固定，連續(xù)酒精脫水（50%、75%、95%和100%）后，包埋樣品，進行超薄切片，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色超薄切片[8]，透射電子顯微鏡觀察心肌組織，計算損傷線粒體比例。

1.4.3 制備心肌組織線粒體溶液和測定呼吸鏈復(fù)合物活性 冰浴中將心肌剪成碎塊，加入勻漿緩沖液勻漿30 s，間隔30 s，重復(fù)3 次。 800 g 離心10 min；取上清800 g 離心10 min； 取上清12 000 g 離心15 min，棄上清，所得沉淀12 000 g 離心15 min，沉淀物為線粒體。參照試劑盒說明測定線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性，將待測樣品放于冰槽，準(zhǔn)備背景對照，讀數(shù)0～3 min，分別檢測樣品總活性和非特異性活性，樣本特異活性=樣本總活性-樣本非特異活性。

1.4.4 qPCR 檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物I 蛋白亞基ND1m RNA 提取鼠心肌線粒體，檢測RNA 純度，樣品選取標(biāo)準(zhǔn)為A260/A230＞2.0 且1.8＜A260/A280＜2.1，根據(jù)qPCR 引物合成要求，使用Primer 3 軟件進行引物設(shè)計， 上海生工生物有限公司合成目的基因和內(nèi)參。 ND1 引物長度為331 bp，F(xiàn)P：5′-CGGCTCCTTCTCCCTACAA-3′；RP：5′-TCGACGTTAAAGCCTGAGACT-3′。 內(nèi)參引物porin 長度為211 bp，F(xiàn)P：5′-GTTGGCTATAAGACGGATGA-3′；RP：5′-CCTGATACTTGGCTGCTATT-3′。qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Green 9 μl，cDNA 2 μl，正向引物2 μl，反向引物2 μl。 逆轉(zhuǎn)錄條件：37°C 水浴15 min，50°C 水浴5 min，90°C 水浴5 min，離心，置于冰上。qPCR 條件：95℃20 s，65℃35 s，72℃40 s，共40 個循環(huán)。 溶解曲線條件為：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。 用2-△△CT法計算目的基因相對于內(nèi)參基因相對表達量[9]。

1.4.5 Western blot 檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物I 蛋白亞基ND1 心肌組織200 mg 加1 ml 裂解緩沖液，冰上研磨勻漿，4℃15 000 g 離心15 min， 取上清液，蛋白定量，進行分裝，每管蛋白為50 μg，凍存于-80℃冰箱備用。 Western blot 步驟：電泳，轉(zhuǎn)膜，分別加入抗ND1、β-actin 一抗抗體孵育（封閉液稀釋一抗l∶500），4℃過夜，TBST 洗2 次，每次5 min，加入二抗（封閉液稀釋二抗l∶2000），室溫10 min，TBST 洗3 次，每次5 min。濾膜于顯色液中反應(yīng)1 min。 置于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光各組蛋白條帶，拍照并計算灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析， 計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用Fisher 確切概率法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組血糖值的比較

模型組的血糖高于對照組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的血糖低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組和治療組、黃芩苷對照組的血糖比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 四組血糖值的比較（mmol/L，±s）

表1 四組血糖值的比較（mmol/L，±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) 血糖對照組模型組治療組黃芩苷對照組6666 4.98±0.03 24.6±1.01a 11.5±2.25b 5.01±0.01

2.2 四組心肌電鏡結(jié)果及損傷線粒體百分比的比較

電鏡觀察對照組鼠心肌線粒體形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形，線粒體外膜光滑完整，嵴形態(tài)完整；模型組心肌線粒體線粒體空泡樣變，嵴斷裂或消失，外膜腫脹破裂；治療組鼠心肌線粒體外膜完整，腫脹減輕，沒有嵴斷裂；黃芩苷對照組心肌線粒體形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形，線粒體外膜光滑完整，嵴形態(tài)完整（圖1）。模型組的損傷線粒體百分比高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的損傷線粒體百分比低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組和治療組、黃芩苷對照組的損傷線粒體百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

圖1 各組心肌線粒體電鏡下圖像（×23 000）

表2 四組損傷線粒體百分比的比較（%，±s）

表2 四組損傷線粒體百分比的比較（%，±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) 損傷線粒體百分比對照組模型組治療組黃芩苷對照組6666 18.4±0.04 70.1±1.06a 34.6±2.32b 18.6±0.01

2.3 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的比較

模型組的心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組和治療組、黃芩苷對照組的線粒體酶復(fù)合物活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表3 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的比較[μmol/（min·mg），n=6，±s]

表3 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的比較[μmol/（min·mg），n=6，±s]

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ心肌線粒體復(fù)合物Ⅱ心肌線粒體復(fù)合物Ⅲ心肌線粒體復(fù)合物Ⅳ對照組模型組治療組黃芩苷對照組0.115±0.009 0.047±0.010a 0.087±0.002b 0.112±0.001 0.134±0.007 0.082±0.010a 0.101±0.003b 0.133±0.002 0.126±0.011 0.064±0.010a 0.096±0.011b 0.124±0.002 0.128±0.004 0.071±0.010a 0.104±0.009b 0.126±0.003

2.4 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 mRNA 的比較

模型組的心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 mRNA 表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 mRNA 表達高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組和治療組、黃芩苷對照組的心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 m RNA 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表4 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 mRNA 的比較（±s）

表4 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 mRNA 的比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) ND1 mRNA對照組模型組治療組黃芩苷對照組6666 1.15±0.02 0.47±0.01a 0.92±0.03b 1.13±0.06

2.5 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1表達的比較

模型組的心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 表達高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組和治療組、黃芩苷對照組的線粒體復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），蛋白表達水平：相對光密度ND1/β-actin，灰度值×面積（圖2、表5）。

圖2 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 表達

表5 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 表達的比較（±s）

表5 四組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1 表達的比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) 心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ蛋白亞基ND1對照組模型組治療組黃芩苷對照組6666 0.78±0.01 0.32±0.03a 0.61±0.04b 0.77±0.01

3 討論

本研究依據(jù)1 型糖尿病動物模型造模方法，應(yīng)用STZ 72 h 后模型組血糖高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），模型組空腹血糖均≥16.7 mmol/L，符合糖尿病模型[10]。 糖尿病心肌組織在高糖和高營養(yǎng)應(yīng)激下， 氧化磷酸化和線粒體三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成均降低，影響心肌的功能[11]。研究發(fā)現(xiàn)高血糖降低心肌葡萄糖攝取和氧化，線粒體功能障礙導(dǎo)致糖尿病心力衰竭[12]。 本實驗電鏡結(jié)果顯示模型組鼠心肌線粒體空泡樣變，線粒體嵴斷裂或嵴消失，外膜破裂，說明高糖刺激破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，推測高糖刺激破壞心肌線粒體結(jié)構(gòu)參與糖尿病心肌病病理過程。

完整的線粒體呼吸鏈復(fù)合物能夠同步將電子傳遞給氧分子，將氧還原成水，在電子傳遞過程中，產(chǎn)生ATP，供細胞生命活動[13]。呼吸鏈功能異常影響機體細胞的能量供給。在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型腎皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)電子傳遞鏈損傷，復(fù)合體1 和復(fù)合體2 活性下降[14]。 本實驗?zāi)Ｐ徒M鼠心肌呼吸鏈復(fù)合物活性低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示高糖不但損傷腎呼吸鏈也損傷心肌的呼吸鏈， 導(dǎo)致ATP 合成減少，心肌細胞的能量供給不足，影響心肌細胞功能。

線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ是呼吸鏈復(fù)合物中最為重要的一個，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ催化三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的NADH 所帶電子沿呼吸鏈進行傳遞。 心肌對能量供給依賴性非常強，對能量缺乏很敏感，因此心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ的缺陷影響ATP 的合成， 導(dǎo)致能量的供給障礙，干擾心肌細胞功能[15]。 抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ會引起電子從呼吸鏈中泄露而導(dǎo)致超氧自由基、過氧化氫產(chǎn)生增多，造成心肌細胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及DNA 的氧化損傷，最終導(dǎo)致細胞死亡[16]。 線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ由45 個亞基組成，線粒體基因（mitochondrial DNA，mtDNA）編碼其中7 個亞基包括ND1～ND6、ND4L，其余由核DNA 編碼[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組的ND1 mRNA 和ND1 蛋白低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示高糖干擾線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ亞基ND1 的表達， 這進一步說明高糖刺激不但影響線粒體的結(jié)構(gòu)，而且直接抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ亞基ND1 的表達， 降低對心肌細胞的能量供給，降低心肌收縮力，降低心臟做功，影響心肌功能。

黃芩苷是黃芩中主要的黃酮類成分[18]，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等功能。 黃芩苷在保護心臟驟停、心肌缺血再灌注損傷和保護心肌細胞等方面均有研究報道[19-21]。 本實驗黃芩苷干預(yù)后糖尿病鼠的血糖降低，電鏡下鼠心肌線粒體外膜完整，腫脹減輕，嵴完整， 推測黃芩苷降低血糖對心肌線粒體具有保護作用。黃芩苷可以提高心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ的活性， 增強心肌線粒體復(fù)合物Ⅰ亞基ND1 mRNA 和ND1 蛋白表達， 推測黃芩苷可能通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性， 提高復(fù)合物Ⅰ亞基ND1 mRNA 和ND1 蛋白表達，增強線粒體合成ATP 能力，增強心肌抗應(yīng)激耐力，進而對糖尿病鼠心肌細胞起保護作用，但黃芩苷調(diào)控線粒體呼吸鏈復(fù)合物的機制尚需進一步研究。

綜上所述，黃芩苷可能通過提高線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性，增強ND1 mRNA 和ND1 蛋白表達保護糖尿病鼠心肌。