祁晶晶，楊雨陽(yáng)，馬秀敏，宮海燕，單驕宇

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，烏魯木齊 830011)

隨著廣譜抗菌藥物應(yīng)用的普及，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻，特別是對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率高達(dá)32.8%[1]，死亡率明顯高于非耐藥菌株[2]。近年來(lái)，KPN的新變種——高毒力KPN(hyper virulent KPN，hvKP)以高致病性、高檢出率和高傳播性為特點(diǎn)，引起人們的關(guān)注。與普通KPN不同，hvKP原發(fā)病灶形成后，可在短時(shí)間內(nèi)引起血流播散性感染，且極易導(dǎo)致院內(nèi)暴發(fā)流行[3]。研究表明，KPN毒力強(qiáng)弱主要與其攜帶的毒力基因有關(guān)，這些基因?qū)PN的黏附性和侵襲性等產(chǎn)生影響，從而使患者感染KPN后，在感染嚴(yán)重程度和預(yù)后方面存在差異[4]。但目前關(guān)于hvKP的研究多集中于毒力基因的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，其與患者感染嚴(yán)重程度和預(yù)后的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討耐碳青霉烯類KPN(carbapenem-resistant KPN，CR-KP)血流感染患者中高毒力CR-KP(carbapenem-resistant hyper virulent KPN，CR-hvKP)毒力基因的流行病學(xué)特點(diǎn)，并分析毒力基因與感染嚴(yán)重程度的相關(guān)性，以期為患者臨床治療和預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2018年1月至2020年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科首次分離的180株非重復(fù)CR-KP，以上菌株來(lái)自180例重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)血流感染患者的血液樣本(多次標(biāo)本送檢者以第一次檢查結(jié)果為準(zhǔn))。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者血流感染臨床診斷明確，所有經(jīng)血液分離的CR-KP菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定；②患者年齡≥18周歲，男女不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他細(xì)菌引起的感染；②無(wú)法獲得膿毒癥相關(guān)序貫器官衰竭(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)評(píng)分。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(倫理批準(zhǔn)號(hào)：XYDWFYLSH-2019-012)。

1.2菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司)對(duì)分離的CR-KP進(jìn)行鑒定并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照由美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)制訂的2017年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[5]。其中，CR-KP菌株定義為KPN對(duì)美羅培南或亞胺培南任一種碳青霉烯類抗菌藥物最低抑菌濃度≥4 mg/L。對(duì)所有分離的CR-KP菌株進(jìn)一步行拉絲試驗(yàn)，即使用接種環(huán)在培養(yǎng)皿上挑起經(jīng)24 h培養(yǎng)的CR-KP菌落，重復(fù)牽拉2次，若每次長(zhǎng)度均≥5 mm，則鑒定為CR-hvKP。

1.3碳青霉烯酶耐藥基因、血清莢膜分型及毒力基因檢測(cè)

1.3.1DNA模板制備 用接種環(huán)從培養(yǎng)皿中挑取適量菌落至1.5 ml EP管，加入滅菌去離子水300 μl后震蕩混勻，并以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心5 min，用移液槍棄去上清液。向離心所得的沉淀物中再次加入300 μl滅菌去離子水，震蕩混勻，于100 ℃煮沸15 min后，以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，抽取上清液即為DNA模板。

1.3.2引物設(shè)計(jì) 參考Antony等[6]的研究設(shè)計(jì)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)、新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)、苯唑西林酶-48型(oxacillinaase-48，OXA-48)和金屬β-內(nèi)酰胺酶(verona integron-mediated，VIM)4種碳青霉烯酶耐藥基因引物序列。參考El-Mahdy等[7]和Xu等[8]研究分別設(shè)計(jì)K1、K2、K5、K20、K54和K57 6種莢膜血清分型引物和rmpA、iutA、rmpA2、magA、allS、wcaG、aerobactin、ybtS、entB、kfu9 10種常見(jiàn)毒力基因引物。各引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。

1.3.3聚合酶鏈反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 聚合酶鏈反應(yīng)體系25 μl，其中包括DNA模板、引物正向引物和引物反向引物各1 μl，Taq PCR Master Mix 12.5 μl，雙蒸水9.5 μl。聚合酶鏈反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s，退火30 s(根據(jù)產(chǎn)物大小略有不同)，72 ℃ 延伸60 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸7 min。

1.3.4電泳 取5 μl聚合酶鏈擴(kuò)增產(chǎn)物并將其加入2.0%瓊脂糖凝膠上樣孔，分別將電壓和電流設(shè)定為180 V和200 mA，電泳30 min后于紫外燈檢測(cè)儀下觀察結(jié)果，并進(jìn)行攝像保存結(jié)果。

表1 各基因聚合酶鏈反應(yīng)引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

2 結(jié) 果

納入本研究的180株CR-KP宿主中男116例、女64例，年齡51～78歲，平均(64±11)歲；合并糖尿病43例，合并高血壓46例；治療過(guò)程中接受氣管插管患者105例，患者均聯(lián)合使用2種或2種以上抗菌藥物，以碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑為主。其中CR-hvKP感染患者62例(34.4%)。

2.1CR-KP血流感染患者的臨床特征分析 CR-hvKP組患者年齡、合并糖尿病及30 d內(nèi)死亡比例明顯高于CR-non-hvKP組(P<0.05)，兩組性別、合并高血壓、醫(yī)源性侵襲操作、抗菌藥物暴露情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CR-hvKP組與CR-non-hvKP組血流感染患者臨床特征比較

2.2CR-KP菌株耐藥基因檢測(cè) 180株CR-KP菌株中檢出攜帶KPC基因172株，攜帶NDM基因8株，未檢出OXA-48和VIM基因。其中攜帶KPC基因的菌株在CR-hvKP組和CR-non-hvKP組分別有61株(98.4%)和110株(93.2%)，攜帶NDM基因的菌株在CR-hvKP組和CR-non-hvKP分別有1株(1.6%)和7株(5.9%)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.284，P=0.131；χ2=1.785，P=0.181)。

2.3CR-KP血清莢膜分型和毒力基因 本研究中僅檢出3株K2血清夾膜分型，均來(lái)自CR-hvKP菌株，其余CR-KP未獲得血清夾膜分型。ICU血流感染患者CR-KP菌株攜帶的毒力基因以ybtS(95.6%)和entB(81.7%)為主，其中CR-hvKP組菌株中攜帶rmpA、iutA和rmpA2毒力基因的比例高于CR-non-hvKP組(P<0.05)，CR-hvKP與CR-non-hvKP組其余毒力基因分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 180株毒力基因檢出情況及在CR-hvKP組和CR-non-hvKP組的分布

2.4毒力基因與SOFA評(píng)分的相關(guān)性 180株CR-KP宿主SOFA評(píng)分3～15分，平均(8.1±3.0)分。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，毒力基因rmpA、iutA和rmpA2與SOFA評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.001)，與其他毒力基因無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表4。

3 討 論

隨著我國(guó)碳青霉烯類抗菌藥物應(yīng)用的不斷增加，CR-KP的檢出率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，由CR-KP導(dǎo)致的感染已成為目前抗感染治療的棘手問(wèn)題。近年來(lái)，不斷有碳青霉烯類抗菌藥物耐藥hvKP流行的臨床報(bào)道[3，9]，該類菌株不僅表現(xiàn)出對(duì)多種碳青霉烯類

表4 180株CR-KP宿主毒力基因與SOFA評(píng)分的相關(guān)性

抗菌藥物耐藥的特點(diǎn)，同時(shí)相較于非高毒力CR-KP，侵襲能力更強(qiáng)、播散范圍更廣、致死率更高，對(duì)患者生命健康造成了極大威脅，成為目前臨床抗感染治療領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，目前關(guān)于CR-hvKP感染患者毒力基因分布特征及其與感染嚴(yán)重程度關(guān)系的報(bào)道非常有限。

大量研究證實(shí)，高齡、合并多種基礎(chǔ)疾病、碳青霉烯類抗菌藥物暴露史及醫(yī)療侵襲性操作是CR-KP感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-11]。本研究以ICU患者作為研究對(duì)象，該類患者往往合并多種基礎(chǔ)疾病，治療過(guò)程中侵襲性操作較多，且抗菌藥物的暴露明顯高于非ICU，是醫(yī)療機(jī)構(gòu)中CR-KP流行的重點(diǎn)區(qū)域。結(jié)果顯示，CR-hvKP組的年齡、合并糖尿病及患者30 d內(nèi)死亡比例明顯高于CR-non-hvKP組(P<0.05)。提示高齡和糖尿病是hvKPN感染的重要誘發(fā)因素，該類患者往往病程進(jìn)展較快，死亡率更高。

本研究中所檢出的ICU血流感染患者致病菌CR-KP均為多重耐藥細(xì)菌。產(chǎn)碳青霉烯酶是碳青霉烯類抗菌藥物對(duì)KPN耐藥的最常見(jiàn)耐藥機(jī)制[12]。其中，KPC型是目前較為關(guān)注的碳青霉烯酶。本研究180株CR-KP中，攜帶KPC基因的菌株達(dá)到95.0%(171/180)，提示產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶可能是ICU血流感染患者CR-KP耐藥的主要機(jī)制。然而，本研究中也發(fā)現(xiàn)8株攜帶NDM基因的CR-KP。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)NDM的CR-KP呈上升趨勢(shì)，且在治療藥物的選擇上與產(chǎn)KPC的CR-KP也存在明顯不同[13-14]，因此應(yīng)引起臨床醫(yī)師的重視。

現(xiàn)有研究證實(shí)，CR-KP的致病能力主要通過(guò)莢膜多糖、高黏液型及鐵攝取等毒力因子實(shí)現(xiàn)[15]。其中，莢膜是一種覆蓋于細(xì)菌細(xì)胞壁表面的多糖物質(zhì)，具有顯著的抗宿主殺傷作用，可規(guī)避免疫細(xì)胞的吞噬作用，目前被認(rèn)為是CR-KP最重要的毒力因子之一。常見(jiàn)的高毒力KPN莢膜分型包括K1、K2、K5、K20、K54和K57[16]，而本研究中僅在CR-hvKP菌株中發(fā)現(xiàn)3株攜帶K2抗原的菌株，其他菌株均未獲得常見(jiàn)的抗原分型，其原因可能是CR-KP在獲得耐藥基因的同時(shí)莢膜的表達(dá)出現(xiàn)下降或出現(xiàn)了其他莢膜分型的表達(dá)，導(dǎo)致常見(jiàn)莢膜分型無(wú)法檢測(cè)。本研究結(jié)果還顯示，毒力基因rmpA、rmpA2和iutA與SOFA評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.01)，提示攜帶這些基因的CR-KP感染患者的病情更嚴(yán)重，預(yù)后更差。rmpA和rmpA2是黏液表型的重要調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)細(xì)菌表面保護(hù)性生物膜的形成，且兩者均可參與自身代謝，具有高度的同源性[17]，而氣桿菌素iutA則是鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)基因，可與rmpA和rmpA2共同作用、相互影響，增加細(xì)菌的繁殖能力和黏附性，加速細(xì)菌的播散，從而加重感染情況[18]。杜芳玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ICU血流感染患者中，CR-KP菌株攜帶rmpA、rmpA2和iutA基因的患者死亡率更高，提示其感染可能更加嚴(yán)重。而郝超國(guó)等[20]分析哮喘合并KPN肺部感染患者疾病嚴(yán)重程度與毒力基因的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，攜帶rmpA和rmpA2基因的KPN肺部感染患者病情更嚴(yán)重。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，ICU中CR-KP血流感染患者菌株主要以產(chǎn)KPC為主，且攜帶多種毒力基因，其中rmpA、rmpA2和iutA基因與疾病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，攜帶上述基因的CR-hvKP感染患者的死亡率較高。臨床中應(yīng)注重ICU細(xì)菌流行病學(xué)的調(diào)查研究，增強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員對(duì)CR-KP的認(rèn)識(shí)，以減少醫(yī)院獲得性感染的發(fā)生。