閔晶晶，陳 琪，顧 群，王小同

(1.浙江省湖州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 313000；2.浙江省湖州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科 313000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)科，浙江溫州 325000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見多發(fā)病，以不完全可逆的氣流受限為特征。COPD并不單純表現(xiàn)為肺部癥狀，還可以繼發(fā)多個臟器的損害，特別是COPD患者的認(rèn)知障礙問題已引起廣泛關(guān)注[1-3]。慢性低氧高二氧化碳(低O2高CO2)是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要病理機(jī)制之一，在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2模型下大鼠存在著不同程度的學(xué)習(xí)記憶障礙[4-5]。有研究表明，神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與低氧環(huán)境誘發(fā)的認(rèn)知障礙密切相關(guān)[6-7]。自噬是真核細(xì)胞溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)成分的自我降解過程[8-9]，近來的研究表明，自噬的缺陷導(dǎo)致蛋白質(zhì)突變或折疊錯誤,是許多神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)[9-10]。丁苯酞軟膠囊是我國第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家一類化學(xué)新藥，目前已被廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的治療，具有重構(gòu)缺血區(qū)微循環(huán)，保護(hù)線粒體功能和抑制細(xì)胞凋亡等作用[11-14]。本實(shí)驗(yàn)通過建立低O2高CO2大鼠模型，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及線粒體凋亡、自噬的表達(dá)情況，并通過丁苯酞軟膠囊的干預(yù)來觀察其是否對此模型下大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

低O2高CO2氧艙購自長沙華曦電子科技有限公司；Morris水迷宮購自北京碩林苑科技有限公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)試劑盒購自羅氏公司(Roch,批號11684817910)；抗B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell CLL/lymphoma 2,Bcl-2)關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)、抗自噬相關(guān)蛋白酵母ATG6同源物(The mammalian ortholog of yeast autophagyrelated gene 6,Beclin-1)、抗自噬標(biāo)記蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-assaiated protein l light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司(批號：2722、9664、3495、2775)；Bcl-2、抗腺病毒E1B 19-kD相互作用蛋白3(Bcl-2/E1B 19 kDa interacting protein 3,BNIP3)、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)均購自英國Abcam公司(批號：ab194583、ab10433、ab8345)；抗低氧誘導(dǎo)因子-1α亞基(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)購自美國Novus Biologicals公司(批號：NB100-105)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購自美國Millipore(批號：IPVH 00010)。電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)發(fā)光液、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗均購杭州自弗德生物科技有限公司(批號：FD8020、FDR007、FDM007)。

1.2 方法

1.2.1造模分組

64只無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性SD大鼠，體重200～230 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司[編號:SCXK(滬)2017-0005]。將64只大鼠分為4組，每組各16只：即對照組、模型組、植物油組、丁苯酞組。參照李勇等[15]的造模方法，將模型組、植物油組、丁苯酞組大鼠置于常壓低O2高CO2艙內(nèi)進(jìn)行造模，通過N2降低模型艙內(nèi)O2濃度，使艙內(nèi)O2濃度維持在9.0%～11.0%，CO2濃度維持在5.0%～6.0%，每天造模8 h，共造模2周，每周6 d；其余時間與對照組一起置于正常環(huán)境中(室溫20～23 ℃，相對濕度50%～70%)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間大鼠可自由獲得食物和飲水，丁苯酞軟膠囊80 mg/kg或相同劑量的植物油在每天造模結(jié)束后進(jìn)行灌胃，持續(xù)2周，每周6 d。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

連續(xù)訓(xùn)練5 d，每天接受3次試驗(yàn)，前2 d如果大鼠在60 s的時間內(nèi)沒有找到平臺，將其輕輕地引導(dǎo)至平臺并在平臺上休息30 s，第3天開始不再引導(dǎo)，未找到者記錄潛伏期為60 s。在第6天的空間平臺搜索實(shí)驗(yàn)中，將平臺從池中移出，并讓老鼠游泳60 s，記錄穿越平臺的次數(shù)。

1.2.3TUNEL法檢測組織細(xì)胞凋亡

將石蠟切片用蒸餾水洗滌并在37 ℃用蛋白質(zhì)消化酶處理20 min，然后根據(jù)羅氏的TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行原位細(xì)胞凋亡的檢測，觀察海馬CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞并計(jì)算百分比。

1.2.4透射電鏡觀察自噬情況

取海馬切成 1 mm3的小塊，戊二醛磷酸緩沖液固定，常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色，制成超薄的切片,在透射電鏡下觀察。

1.2.5Western blot檢測蛋白水平

通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在室溫下用5%無脂奶粉將PVDF膜封閉2 h。然后將膜與各自的一抗在4 ℃溫育過夜，TBS Tween 20 Buffer(TBST緩沖液)洗膜5 min×6次，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×6次，用ECL發(fā)光液(試劑A∶試劑B=1∶1)覆蓋膜(每張約60 μL)，曝光后進(jìn)行分析計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)及穿越平臺次數(shù)比較

在Morris水迷宮訓(xùn)練的第1、2天，各組大鼠在逃避潛伏時間上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3、4、5天，與對照組比較，模型組和植物油組的潛伏期明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，丁苯酞組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。第4、5天的游泳距離也出現(xiàn)類似趨勢。在最后一天的穿越平臺次數(shù)試驗(yàn)中，各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1～2、圖1。

表1 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期時間和穿越平臺次數(shù)比較

表2 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)游泳距離比較

圖1 各組大鼠游泳路線圖

2.2 丁苯酞軟膠囊干預(yù)對于模型大鼠凋亡的影響

Western blot檢測抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、caspase-3水平顯示，模型大鼠造模2周后出現(xiàn)了Bcl-2、Bax以及caspase-3表達(dá)的增加，丁苯酞軟膠囊的干預(yù)抑制了Bax、caspase-3的增加，進(jìn)一步促進(jìn)了Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)。TUNEL檢測顯示，模型組大鼠凋亡細(xì)胞增加，丁苯酞組較模型組凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及凋亡率比較，見表3和圖2、3。

A:對照組;B:模型組;C:植物油組;D:丁苯酞組。

表3 各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平及凋亡率比較

2.3 丁苯酞軟膠囊干預(yù)對于模型大鼠對線粒體自噬的影響

通過透射電鏡檢查結(jié)果顯示，慢性低O2高CO2模型下存在著自噬體的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，線粒體空泡比，嵴斷裂或溶解，細(xì)胞內(nèi)自噬體增加。并且在丁苯酞干預(yù)后自噬體的數(shù)量進(jìn)一步增加(圖4)。Western blot檢測顯示，模型下存在著HIF-1α的激活，BNIP3表達(dá)的上調(diào)及自噬標(biāo)志物Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)的增加，在使用丁苯酞干預(yù)后，HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)較模型組進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖5、表4。

A:對照組;B:模型組;C:植物油組;D:丁苯酞組。

A:對照組;B:模型組;C:植物油組;D:丁苯酞組。

A:對照組;B:模型組;C:植物油組;D:丁苯酞組。

表4 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較

3 討 論

COPD患者伴發(fā)的認(rèn)知障礙給社會和家庭帶來了較大的負(fù)擔(dān)，慢性低O2高CO2是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機(jī)制之一。本研究中采用了慢性低O2高CO2模型來評估丁苯酞軟膠囊對此模型下大鼠認(rèn)知障礙的保護(hù)作用。通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在慢性低O2高CO2暴露下，大鼠存在著明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，并且伴有線粒體促凋亡蛋白、自噬表達(dá)的增加及抗凋亡蛋白表達(dá)的減少，而在使用丁苯酞軟膠囊干預(yù)后大鼠逃避潛伏期和定位航行游泳距離明顯縮短，學(xué)習(xí)記憶水平明顯提高，同時大鼠海馬CA1區(qū)伴有線粒體自噬水平的增加和線粒體凋亡水平的下降。但在Morris水迷宮中，各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與水迷宮的直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于平臺直徑，目標(biāo)平臺太小有關(guān)。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的場所，它一方面通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量，另一方面參與啟動線粒體的凋亡途徑。Bcl-2是一種存在于線粒體外膜中的抗凋亡蛋白，通常與Bax形成異源二聚體來抑制細(xì)胞凋亡的激活。Bax是一種位于細(xì)胞質(zhì)中的線粒體抗凋亡蛋白，正常情況下無活性，當(dāng)?shù)蛲鰰r被觸發(fā)，Bax與自身形成同源二聚體并從細(xì)胞質(zhì)中移位線粒體外膜，啟動凋亡途徑。在caspase家族中，caspase-3被認(rèn)為是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的最終執(zhí)行者[16-18]。有學(xué)者在血管性癡呆大鼠身上發(fā)現(xiàn)丁苯酞對血管性癡呆大鼠的記憶能力有明顯改善作用,認(rèn)為與其抑制caspase-3過度表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活有關(guān)[19]。而本研究在慢性低O2高CO2模型大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了caspase-3表達(dá)的增加同時伴隨促凋亡蛋白Bax增加及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，但在使用丁苯酞干預(yù)后Bax、caspase-3表達(dá)明顯減少，而Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步增加，說明丁苯酞軟膠囊在此模型下可能通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白之間的平衡從而發(fā)揮一定的抗凋亡作用。

線粒體自噬是指應(yīng)激條件下細(xì)胞通過自噬選擇性地清除損傷或多余線粒體的過程,對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用[19-20]。LC3是酵母細(xì)胞基因Atg-8的同源體[20],自噬泡的形成以LC3Ⅱ從細(xì)胞膜的外表面釋放為標(biāo)志，LC3Ⅱ表達(dá)的增加通常被認(rèn)為是自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)。Beclin-1是啟動自噬小體形成的關(guān)鍵蛋白，其為酵母Atg-6基因的同源體[20]。當(dāng)細(xì)胞處于低氧狀態(tài)時，HIF-1 是低氧應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控者，HIF-1α是HIF-1的一個亞基，受氧濃度的調(diào)節(jié)[21]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，低氧條件下HIF-1α介導(dǎo)了 BNIP 和 BNIP3L 表達(dá)，誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生從而防止細(xì)胞凋亡[21]。BNIP3 和 BNIP3L(NIX)是同源基因，二者與Beclin-1具有相同的BH3結(jié)構(gòu)域，均可競爭性地把Beclin-1從Bcl-2或Bcl-xl的結(jié)合復(fù)合物中游離出來，從而促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生[21]。有研究者在對BNIP3基因敲除鼠及野生大鼠的缺血缺氧動物模型研究，對基因敲除大鼠皮層神經(jīng)元進(jìn)行氧糖剝奪處理，發(fā)現(xiàn)NIX/BNIP3L 表達(dá)上調(diào)，凋亡減弱，自噬增強(qiáng)，大腦梗死灶體積變小[22]。本課題組在慢性低O2高CO2模型下發(fā)現(xiàn)了自噬體的存在及HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)，而在使用丁苯酞軟膠囊干預(yù)后自噬體的數(shù)量較前增加，上述蛋白的表達(dá)較前明顯提高，說明丁苯酞軟膠囊可能在慢性低O2高CO2條件下通過線粒體自噬水平的進(jìn)一步提高從而改善大鼠的認(rèn)知障礙。

本研究表明，慢性低O2高CO2可導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，誘導(dǎo)凋亡和線粒體自噬表達(dá)，丁苯酞可能通過提高線粒體自噬水平同時降低凋亡水平來改善慢性低O2高CO2導(dǎo)致的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。