彭詩(shī)亞，楊 娟，吳 倩，諸 蓉，王儒鵬△

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚風(fēng)濕免疫科，重慶 400037；2.槐蔭人民醫(yī)院皮膚科，濟(jì)南 250021)

銀屑病是一種常見的自身免疫性炎癥性皮膚病，世界范圍內(nèi)發(fā)病率在0.5%～3.0%，具有病程長(zhǎng)、易反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)[1]。臨床表現(xiàn)主要以紅斑、鱗屑等破壞皮膚屏障的癥狀為主[2-3]。銀屑病的發(fā)病因素復(fù)雜[4]，發(fā)病初期樹突狀細(xì)胞被外界各種因素激活后，誘導(dǎo)皮膚內(nèi)T淋巴細(xì)胞活化，分泌白細(xì)胞介素(IL)-17A、IL-22等促炎因子[5]，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌趨化因子[6]，形成正向炎癥環(huán)路加重銀屑病。其中，CC趨化因子配體20(CCL20)起到尤為關(guān)鍵的作用[7]。CCL20是銀屑病發(fā)病過程中角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的一種趨化因子，其產(chǎn)生與機(jī)械搔抓刺激有關(guān)。CC趨化因子受體6(CCR6)為CCL20的特異性趨化因子受體，主要表達(dá)于產(chǎn)生IL-17的γδ T淋巴細(xì)胞亞群、樹突狀細(xì)胞等[8-9]。因此，CCL20是維持銀屑病炎癥中正反饋環(huán)的關(guān)鍵分子[10]。目前，已發(fā)現(xiàn)P38/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/c-Jun氨基末端激酶(P38/ERK/JNK)信號(hào)通路與CCL20的生成有關(guān)[11]。近年來，上皮免疫微環(huán)境(epithelial immune microenvironment，EIME)在銀屑病被作為一個(gè)單獨(dú)的概念提出[12]。CCL20對(duì)于免疫微環(huán)境的調(diào)控及對(duì)皮膚屏障的保護(hù)作用尚未有相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究利用咪喹莫特(imiquimod，IMQ)構(gòu)建小鼠銀屑病皮膚炎癥模型，并注射CCL20中和抗體清除小鼠體內(nèi)CCL20，觀察清除CCL20后小鼠銀屑病發(fā)生過程中免疫微環(huán)境的改變，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性C57BL/6小鼠，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有小鼠在22～24 ℃、50%濕度環(huán)境下獨(dú)立飼養(yǎng)，且所有小鼠可自由獲得飲水及食物。

1.1.2主要儀器與試劑

戊巴比妥溶液(美國(guó)Sigma公司)，IMQ乳膏(美國(guó)3M公司)，鼠抗CCL20/巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)抗體(美國(guó)R&D公司)，蘇木素-伊紅(HE)染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，全玻片掃描顯微鏡(日本Olympus公司)，免疫組織化學(xué)抗體：兔抗小鼠IL-17A抗體、兔抗小鼠IL-23抗體、兔抗小鼠γ干擾素(IFN-γ)抗體(美國(guó)Abcam公司)；CXCL8(美國(guó)Bioworld公司)，Attune流式細(xì)胞檢測(cè)儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，流式細(xì)胞抗體：異硫氰酸熒光素(FITC)抗鼠CD3抗體、PerCP/cyanine5.5抗鼠Vγ2抗體、BV421抗鼠IL-17A抗體、藻紅蛋白(PE)抗鼠TCRγ/δ抗體、Cell Activation Cocktail(美國(guó)Biolegend公司)、Fixation & Permeabilization(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠銀屑病皮膚炎癥模型建立及CCL20清除

將12只小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。建模參照文獻(xiàn)[13]：所有小鼠使用1%戊巴比妥溶液麻醉，并對(duì)背部皮膚脫毛(面積2.5 cm×3.0 cm)；脫毛后1～6 d，每只小鼠涂抹IMQ乳膏62.5 mg/d;脫毛后1～3 d，其中實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射總體積200 μL含20 μg CCL20抗體的磷酸鹽緩沖液(PBS)，對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積PBS。每天對(duì)小鼠背部造模區(qū)域拍照并行銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分，造模后7 d處死小鼠取材進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2小鼠PASI評(píng)分及組織學(xué)分析

小鼠皮膚紅斑及鱗屑嚴(yán)重程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)；1分，輕度；2分，中度；3分，嚴(yán)重；4分，非常嚴(yán)重[14]。取材后的皮膚組織放入4%多聚甲醛溶液脫水固定，石蠟包埋，制作成5 μm厚石蠟切片。對(duì)每組小鼠石蠟切片進(jìn)行HE染色，隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察切片并進(jìn)行炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)。使用Image-pro Plus6.0軟件計(jì)算造模區(qū)域皮膚表皮厚度。

1.2.3免疫組織化學(xué)(IHC)染色

按照1.2.2中所述步驟制作小鼠皮膚組織石蠟切片，使用二甲苯及梯度濃度乙醇對(duì)切片進(jìn)行脫蠟及水化，隨后將切片放入枸櫞酸鈉溶液中加熱15 min進(jìn)行抗原修復(fù)。修復(fù)抗原后冷卻至室溫，使用3%過氧化氫(H2O2)溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再使用10%山羊血清進(jìn)行抗原封閉。分別滴加兔抗小鼠IL-17A、IL-23、IFN-γ、CXCL8抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，第2天使用山羊抗兔二抗室溫孵育30 min。使用二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行抗體染色，并使用蘇木素進(jìn)行細(xì)胞核染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片并拍照，使用Image-pro Plus6.0軟件計(jì)算分析。

1.2.4真/表皮細(xì)胞的分離及流式細(xì)胞檢測(cè)

使用GNK消化液37 ℃消化背部取材皮膚，4 ℃冰箱過夜。第2天用鑷子分離真皮及表皮，并將其分別放置于燒杯中，剪碎組織。表皮組織加入適量胰酶37 ℃消化15 min，其后終止消化，并使用70 μm篩網(wǎng)過濾收集細(xì)胞。此外，按2 mL DMEM培養(yǎng)基、含1 mL 10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基、1 mL 2%Ⅳ型膠原酶、1 mL PBS及10 U DNaseI比例配置真皮細(xì)胞消化液，其后于水平搖床上消化細(xì)胞，37 ℃ 1 h。終止消化后，如前收集真皮細(xì)胞。使用細(xì)胞活化劑Cocktail孵育4 h，表面標(biāo)記染色完成后使用Fixation & Permeabilization混合液使細(xì)胞固定、打孔，其后細(xì)胞內(nèi)抗體染色。染色后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并用Flowjo軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CCL20清除后改善小鼠銀屑病模型皮損癥狀

實(shí)驗(yàn)組小鼠造模區(qū)域皮膚紅斑、鱗屑癥狀較對(duì)照組小鼠均有所減輕，見圖1。實(shí)驗(yàn)組小鼠銀屑病模型紅斑、鱗屑PASI評(píng)分均明顯低于對(duì)照組，與大體照片結(jié)果一致，見圖2。

圖1 兩組小鼠造模區(qū)域大體照片對(duì)比

A:紅斑PASI評(píng)分;B:鱗屑PASI評(píng)分;a：P<0.01，b：P<0.05，與實(shí)驗(yàn)組比較。

2.2 CCL20清除后可減輕小鼠銀屑病樣炎癥典型病理特征

HE染色結(jié)果表明，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠表皮厚度明顯減小，角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生情況明顯緩解，角化程度減輕，細(xì)胞核質(zhì)比接近正常角質(zhì)形成細(xì)胞，見圖3A、B。相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠表皮厚度減小[(38.80±7.48)μmvs.(71.37±12.23)μm]，皮下炎癥細(xì)胞(以淋巴細(xì)胞為主)浸潤(rùn)減少[(311.30±47.29)/0.3 mm2vs.(508.90±98.71)/0.3 mm2]，皮下新生毛細(xì)血管數(shù)減少[(11.08±2.39)/0.3 mm2vs.(21.00±3.07)/0.3 mm2]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，充血程度得到緩解，見圖3C～E。

A、B：小鼠皮膚組織石蠟切片HE染色(×200)；C：兩組小鼠表皮厚度統(tǒng)計(jì)柱狀圖；D：兩組小鼠真皮浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖；E：兩組小鼠新生毛細(xì)血管數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖；a：P<0.001,與實(shí)驗(yàn)組比較。

2.3 CCL20清除后可減少表皮γδT細(xì)胞趨化和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)

流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠表皮γδ T淋巴細(xì)胞(主要為Vγ4+T淋巴細(xì)胞)百分比、IL-17A+T淋巴細(xì)胞百分比明顯降低(P<0.05)，而兩組小鼠真皮的上述細(xì)胞百分比無(wú)明顯差異(P>0.05)，見圖4。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠造模區(qū)皮膚炎癥因子IL-17A、IFN-γ、CXCL8及IL-23表達(dá)水平均降低(P<0.05)，見圖5。

A、B：兩組小鼠表皮T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況；C、D：兩組小鼠真皮T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況；a：P<0.05,與實(shí)驗(yàn)組比較。

A:IL-17A;B:IFN-γ;C:CXCL8;D:IL-23;E:兩組小鼠造模區(qū)皮膚炎癥因子表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)柱狀圖;a:P<0.01，b:P<0.05,與實(shí)驗(yàn)組比較。

3 討 論

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，發(fā)病因素復(fù)雜，主要表現(xiàn)為紅斑、鱗屑性斑塊等，同時(shí)影響患者局部上皮免疫微環(huán)境[15]。而CCL20作為銀屑病發(fā)病過程中的關(guān)鍵趨化因子，可以與表面表達(dá)CCR6的淋巴細(xì)胞相結(jié)合，使淋巴細(xì)胞在皮膚局部聚集，擴(kuò)大炎性反應(yīng)，加重銀屑病病情[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)使用CCL20抗體后，小鼠的銀屑病癥狀相較于對(duì)照組明顯減輕，PASI評(píng)分降低，表明在銀屑病模型中清除CCL20可以明顯改善銀屑病樣皮炎癥狀，起到保護(hù)皮膚屏障的作用。

本研究組織病理學(xué)染色結(jié)果表明，CCL20清除后，實(shí)驗(yàn)組小鼠表皮層細(xì)胞增殖數(shù)量及異常增殖減少，而表皮細(xì)胞過度增殖及異常增殖是銀屑病特征性的病理改變[17]；此外，染色結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及皮下新生血管數(shù)量明顯減少，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)反映了皮膚局部的炎癥改變，而新生周圍毛細(xì)血管是皮膚免疫微環(huán)境的重要組成部分。這一結(jié)果從組織學(xué)上表明了清除CCL20可以改善小鼠銀屑病模型的病理變化，達(dá)到緩解或治療銀屑病樣皮炎的效果。

本研究流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，清除CCL20后，實(shí)驗(yàn)組小鼠表皮內(nèi)γδ T淋巴細(xì)胞(主要為Vγ4+T淋巴細(xì)胞)浸潤(rùn)明顯減少，且IL-17A+T淋巴細(xì)胞百分比也相應(yīng)降低。Vγ4+T淋巴細(xì)胞是維持銀屑病病程正反饋環(huán)的關(guān)鍵細(xì)胞之一，其分泌的相關(guān)炎癥因子IL-17A、IFN-γ等可以作用于角質(zhì)形成細(xì)胞[18-19]，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并表達(dá)更多炎癥因子及趨化因子，不斷放大銀屑病病程[20-21]。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也表明，CCL20清除后，實(shí)驗(yàn)組小鼠相關(guān)炎癥因子IL-17A、IFN-γ、CXCL8及IL-23在局部的表達(dá)明顯受到抑制。CCL20清除后可以阻斷銀屑病病程中的正反饋環(huán)，明顯抑制炎性反應(yīng)，阻止其對(duì)皮膚及局部免疫微環(huán)境的破壞。

綜上所述，清除銀屑病發(fā)病過程中的CCL20，可以通過抑制關(guān)鍵細(xì)胞Vγ4+T淋巴細(xì)胞的趨化打破銀屑病發(fā)病過程中的正反饋環(huán)，抑制銀屑病病程中的炎性反應(yīng)。此外，清除CCL20后，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖被抑制且異常增殖減少，皮下新生毛細(xì)血管數(shù)量減少。炎癥細(xì)胞、炎癥因子、角質(zhì)形成細(xì)胞及新生周圍毛細(xì)血管均為銀屑病局部表皮微環(huán)境的重要組成部分，因此，清除CCL20后可明顯改善銀屑病皮膚局部表皮免疫微環(huán)境，保護(hù)銀屑病病程中的皮膚屏障，改善相關(guān)癥狀。因此，清除CCL20可考慮作為緩解或治療銀屑病的方式之一，有待更進(jìn)一步的研究。