盧 超 ， 陳景鮮， 王國霞， 李春閣， 林 展， 蘇芳誼， 張 苗

（1.鄭州師范學院生命科學學院，河南鄭州450000；2.福建醫(yī)科大學藥學院，福建福州350004）

中性蛋白酶作為工業(yè)酶制劑之一， 在食品工業(yè)、洗滌液、皮革制造業(yè)以及醫(yī)療行業(yè)等領域中均有廣泛的應用（李雪等，2019）。目前我國使用中性蛋白酶的生產(chǎn)菌種主要包括芽孢桿菌、變形桿菌、青霉、曲霉、放線菌等（馮菲等，2021；趙龍妹等，2020）。但直接篩選出的原始產(chǎn)蛋白酶的菌株產(chǎn)酶能力較低，無法滿足工業(yè)化的需求，因此，需對菌株進行處理， 以增強菌株產(chǎn)蛋白酶的能力。 目前提高菌種產(chǎn)酶能力的方法很多，如使用紫外線、粒子束， 以及各種射線的物理誘變方法； 堿基類似物、烷化劑等各種化學誘變方法（高紫等，2021；高若珊等，2021；季旭等，2021；君胡榮等，2019）。 這些物理和化學方法不需要昂貴的大型儀器， 是目前采用最普遍的誘變方法（Yu 等，2019）。 胡悅等（2019）在氯化鋰添加量為1.5%、常壓室溫等離子體照射時間為45 s 的誘變條件下篩選得到地衣芽孢桿菌菌株F-3， 該菌株堿性蛋白酶的酶活達到12147 U/mL（胡悅等，2021）。 黃子凌等（2021）以紫外、氯化鋰為誘變劑，在經(jīng)過3 輪誘變后，得到了一株表現(xiàn)良好抑菌和益生特性， 且穩(wěn)定高產(chǎn)中性蛋白酶的突變菌株UL-191，其中性蛋白酶活達108.812 U/mL，較出發(fā)菌株提高了44.2%。

本試驗通過牛奶平板篩選， 多次劃線從土壤中篩選得到一株產(chǎn)蛋白酶的菌株L01， 福林酚方法測定其酶活。 分別用紫外線和亞硝酸鈉進行單因素處理，以提高該菌株中性蛋白酶酶活。隨后用紫外線和亞硝酸鈉進行復合處理測定其發(fā)酵液的酶活。 篩選出中性蛋白酶酶活最高的菌株經(jīng)過10次以上的傳代探索其遺傳穩(wěn)定性。 最后通過分子生物學方法鑒定篩選出高產(chǎn)中性蛋白酶的菌株。本研究為采用該菌株生產(chǎn)中性蛋白酶的后續(xù)研究及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 細菌基因組DNA 提取試劑盒、真菌基因組DNA 提取試劑盒、引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司；Tks Gflex DNA 聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司；其他試驗所用常規(guī)試劑為市售分析純。

牛奶平板培養(yǎng)基：50%脫脂牛奶，1%瓊脂溶于50%無菌水中，121 ℃滅菌20 min， 溫度降至50 ℃左右混合均勻制作牛奶平板。 酪蛋白平板培養(yǎng)基：0.5%酪蛋白，0.2%磷酸氫二鈉，1%瓊脂，121 ℃滅菌20 min，溫度降至50 ℃左右混合均勻制作酪蛋白平板。 YPD 液體培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，121 ℃滅菌20 min，溫度降至50 ℃左右混合均勻。 LB 培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉，121 ℃滅菌20 min，溫度降至50 ℃左右混合均勻。

1.2 儀器與設備 立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺：上海一恒科學儀器有限公司；pH 計：瑞士梅特勒托利多集團；高速離心機：德國Eppendorf 公司；恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司； 紫外分光光度計： 德國Eppendorf 公司；磁力攪拌器：上海一恒科學儀器有限公司；分析天平：瑞士梅特勒托利多集團。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株篩選 土壤采自鄭州師范學院西校區(qū)4 號樓北面樹林，選取地下10 ~ 20 cm 土樣3 g 于100 mL 水中混勻， 放在培養(yǎng)箱中30 ℃振蕩1 h 使充分混勻。 取培養(yǎng)后的菌液1 mL 至9 mL 無菌水中，制成10-1倍菌液，按照上述方法，制成10-4、10-5、10-6倍菌液，將幾種稀釋后的菌液分別涂布于牛奶平板培養(yǎng)基和酪蛋白平板培養(yǎng)基上，放在培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24 h。 挑出有明顯透明圈的菌種在相同培養(yǎng)基上進行反復劃線處理，根據(jù)透明圈是否容易觀察選擇合適平板培養(yǎng)基。觀察透明圈和菌落直徑大小，測量透明圈直徑/菌落直徑，即H/C 值，作為初篩評價各菌株產(chǎn)蛋白酶的能力。

挑選透明圈明顯且H/C 值較大的菌株進行復篩。 將挑選出來的產(chǎn)酶菌種分別加到LB 和YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h。 根據(jù)菌液24 h 內(nèi)OD600變化快慢選擇合適的液體培養(yǎng)基，取24 h 的培養(yǎng)液進行蛋白酶活力測定。

1.3.2 蛋白酶活力檢測方法 參考盧超等(2020）試驗方法，取新鮮發(fā)酵液于4 ℃，8000 r/min 條件下離心8 min，吸取上清作為活性檢測的粗酶液。按照GB/T23537-2009《蛋白酶制劑》，利用福林-酚法測定酶活力。

1.3.3 單因素誘變處理 紫外線誘變處理： 超凈臺紫外滅菌30 min 后，用滅菌針頭蘸取稀釋后的菌懸液在紅燈下分別在牛奶平板培養(yǎng)基上點板處理。對照組點板之后不做任何處理；試驗組在預試驗中確定時間間隔為12 s， 完全暴露在功率20 W的紫外燈下20 cm 處，分別照射12、24、36、48、60、72、84 s。 處理后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24 h。測量每個培養(yǎng)基上所有菌落的H/C 值，挑選出H/C值最大的4 個菌落，分別放入LB 培養(yǎng)基，在振蕩培養(yǎng)箱中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測酶活力。

化學試劑誘變處理： 取初篩出的菌懸液稀釋20 倍，后取0.2 mL 稀釋液加入等量0.1 moL 亞硝酸鈉溶液，由預試驗得出誘變時間間隔是2 min，從6 min 開始處理，分別處理6、8、10、12、14、16 min后，分別加入0.2 mL 的等濃度磷酸氫二鈉溶液混勻。 空白對照組將亞硝酸鈉替換成生理鹽水。 處理后的菌液在牛奶平板培養(yǎng)基上進行點板， 置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)24 h。 測量每個培養(yǎng)基上所有菌落的H/C 值，挑選出H/C 值最大的4 個菌落，分別放入LB 培養(yǎng)基，在振蕩培養(yǎng)箱中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測酶活力。

1.3.4 復合誘變處理 先紫外再化學處理： 首先用滅菌牙簽蘸取稀釋20 倍后的菌懸液在紅燈下分別在牛奶平板培養(yǎng)基上點板處理。 置于超凈臺上完全暴露在功率20 W 的紫外燈下， 分別照射36、48、60 s， 同時以未經(jīng)紫外誘變處理的作為對照組，處理后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)8 h。其次， 在離心小管中加入0.2 mL 的亞硝酸鈉溶液， 用滅菌牙簽蘸取紫外誘變后的菌分別放入亞硝酸鈉溶液中， 分別誘變8、10、12 min 后加入磷酸氫二鈉溶液。 對照組以生理鹽水代替亞硝酸鈉溶液。 蘸取誘變后的菌液及對照組在牛奶平板上進行點板，置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)24 h。測量每個培養(yǎng)基上所有菌落的H/C 值， 挑選出H/C值最大的3 個菌落，分別放入LB 培養(yǎng)基，在振蕩培養(yǎng)箱中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測酶活力。

先化學再紫外處理：取0.2 mL 稀釋液加入等量0.1 mol 亞硝酸鈉溶液混勻，分別處理8、10、12 min 后，各加入0.2 mL 的等濃度磷酸氫二鈉溶液。對照組以生理鹽水代替亞硝酸鈉溶液?；瘜W誘變后的菌液在制備好的牛奶平板培養(yǎng)基上進行點板。 點板之后將其置于已滅菌的超凈臺上完全暴露在功率20 W 的紫外燈下，分別照射36、48、60 s，同時以未經(jīng)紫外誘變處理的作為對照組。 蓋上培養(yǎng)基蓋子并做好相應標記，于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)24 h。 測量每個培養(yǎng)基上所有菌落的H/C值，挑選出H/C 值最大的3 個菌落，分別放入LB培養(yǎng)基， 在振蕩培養(yǎng)箱中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測酶活力。

1.3.5 菌株穩(wěn)定性研究 將挑選出的菌株進行酶活測定后， 從這6 個菌株中挑選出酶活最大的3個菌株進行穩(wěn)定性研究。 將3 個菌株接種到LB培養(yǎng)基中， 在振蕩培養(yǎng)箱中以30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 后測蛋白酶酶活， 依次連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，并用福林-酚法測定中性蛋白酶酶活力。

1.3.6 菌種的鑒定 利用細菌基因組DNA 提取試劑盒和真菌基因組DNA 提取試劑盒分別提取菌種基 因 組DNA。 利 用 通 用 引 物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和1492R （5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’） 擴增細菌基因組DNA 提取試劑盒提取產(chǎn)物， 通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增真菌基因組DNA 提取試劑盒提取產(chǎn)物。 PCR 采用Tks Gflex DNA 聚合酶，25 μL 擴增體系。擴增程序為94 ℃變性1 min，98 ℃變性10 s，60 ℃復性15 s，68 ℃延伸50 s，30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將其產(chǎn)物送上海生工進行測序。 測序結果在NCBI 中進行BLAST 分析，然后用MEGA 7.0 軟件進行序列相似性分析， 以N-J 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap（1000 次重復）進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基篩選結果 用牛奶平板和酪蛋白平板兩種培養(yǎng)基涂板之后進行培養(yǎng)。通過菌種在兩種平板上生長情況的對比發(fā)現(xiàn)，菌種在牛奶平板上生長的更快，H/C 值相對較大更容易觀察， 另外牛奶平板在配制的時候更方便，因此最終選擇用牛奶平板進行后續(xù)試驗。 挑選出的單菌落在LB 培養(yǎng)基中生長更快，因此液體培養(yǎng)基選擇LB 培養(yǎng)基。 將挑選出的出發(fā)菌株標記為L01，進行后續(xù)試驗。

2.2 紫外線及亞硝酸鈉單因素處理結果

2.2.1 紫外線處理結果 由圖1 數(shù)據(jù)可知， 在相同紫外照射的時間下，L01 菌株表現(xiàn)出不同的H/C 值，一部分H/C 值增大，呈現(xiàn)正突變，一部分H/C 值增大，呈現(xiàn)負突變。 從整體上來說，L01 菌株H/C 值在0 ~ 60 s 處理時間段內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)步增加的趨勢，在60 s 時菌株H/C 值有最高點，而H/C 值在60 ~ 84 s 處理時間段內(nèi)呈現(xiàn)快速下降的趨勢。這可能是由于紫外線照射時間較長后引起菌株的死亡，因此L01 菌株紫外線處理的最佳誘變時間為60 s，H/C 值最大為2.75。

圖1 紫外線處理后H/C 值結果

2.2.2 亞硝酸鈉處理結果 由圖2 數(shù)據(jù)可知，從整體上來說，L01 菌株H/C 值在經(jīng)亞硝酸鈉處理0 ~12 min 處理時間段內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)步增加的趨勢， 在12 min 時菌株H/C 值有最高值， 而H/C 值在12~16 min 處理時間段內(nèi)呈現(xiàn)快速下降的趨勢。 而在亞硝酸鈉處理6 min 時，L01 菌株的H/C 值呈現(xiàn)正突變和負突變同時存在的情況。 相比紫外線處理而言，L01 菌株經(jīng)亞硝酸鈉處理后的H/C 值表現(xiàn)出更集中的趨勢。L01 菌株亞硝酸鈉處理的最佳時間誘變時間為12 min，H/C 值最大為2.76。

圖2 亞硝酸鈉處理后H/C 值結果

2.2.3 單因素處理菌株酶活測定結果 分別對單因素處理24 h 后的菌落，挑取H/C 值極大值的菌落，用LB 培養(yǎng)基進行搖菌培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后進行酶活測定，測定結果如表1 所示。紫外線處理時間從0 ~ 60 s，H/C 值從1.75 增加到2.75，L01 菌株中性蛋白酶活力從221.45 U/mL 增加到459.13 U/mL。 這與亞硝酸鈉處理結果類似，亞硝酸鈉處理時間從0 ~ 12 min，L01 菌株中性蛋白酶活力增加到459.13 U/mL。 由表1 數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，紫外線或亞硝酸鈉處理后L01 菌株的H/C 值與酶活力測定結果成正比，說明利用H/C 值初篩中性蛋白酶活力的方法是可行的。

表1 單因素處理菌株酶活測定結果

2.3 復合誘變2 因素3 水平測定結果

2.3.1 先紫外后亞硝酸鈉處理結果 由圖3 試驗數(shù)據(jù)可知， 先紫外后亞硝酸鈉復合處理的9 個組合，各組合的H/C 值差異較大，最低的H/C 值為1.23，出現(xiàn)在先紫外處理60 s 后亞硝酸鈉處理12 min 的組合， 這可能由于復合誘變時間太長導致菌體死亡。 最高的H/C 值為3.00，其處理時間為先紫外處理48 s 后亞硝酸鈉處理8 min 的組合，以及先紫外處理48 s 后亞硝酸鈉處理12 min 的組合，但48 s+10 min 的組合，其H/C 的均值是9個組合中最高，為2.25。

圖3 先紫外后亞硝酸鈉處理結果

2.3.2 先亞硝酸鈉后紫外處理結果 由圖4 試驗數(shù)據(jù)可知， 先亞硝酸鈉后紫外復合處理的9 個組合，12 min+48 s 和12 min+60 s 兩個組合的H/C值差異較大， 其余7 個組合的H/C 值差異較小，但較集中。 最高的H/C 值為4.00，其處理時間為先亞硝酸鈉處理12 min 后紫外處理48 s 的組合，且12 min+48 s 的處理組合，其H/C 值的均值是9 個組合中最高，為2.48。

圖4 先亞硝酸鈉后紫外處理結果

2.3.3 復合處理菌株酶活測定結果 復合誘變之后分別挑取H/C 值極大值的菌落，誘變時間分別是36 s+12 min，48 s+8 min，48 s+12 min，8 min+48 s，12 min+48 s，12 min+60 s 的菌落用LB 培養(yǎng)基進行搖菌培養(yǎng)， 培養(yǎng)24 h 后進行酶活測定，測定結果如表2 所示。

表2 復合處理菌株酶活測定結果

結合表1 和表2 試驗數(shù)據(jù)可知，L01 菌株進行單因素誘變之后， 將篩選出的產(chǎn)中性蛋白酶菌株進行酶活測定， 測定菌株的最大產(chǎn)酶能力是459.13 U/mL，L01 菌株進行復合誘變之后， 篩選出的產(chǎn)中性蛋白酶菌株進行酶活測定，結果表明，最大產(chǎn)酶酶活為577.87 U/mL。 表明復合誘變最大值優(yōu)于單因素誘變效果。由表2 試驗數(shù)據(jù)可知，在進行最優(yōu)產(chǎn)酶菌株篩選時，先亞硝酸鈉后紫外的復合處理優(yōu)于先紫外后亞硝酸鈉的復合處理方法。在12 min+48 s 的誘變方法下，L01 菌株的最大產(chǎn)酶酶活為577.87 U/mL，較出發(fā)菌株的221.45 U/mL提高了158.87%。

2.4 菌株的穩(wěn)定性研究結果 將在復合誘變中篩選出產(chǎn)中性蛋白酶酶活最大的3 個菌株再次用LB 平板劃線后挑出單菌落，用LB 培養(yǎng)基進行搖菌培養(yǎng)，每隔培養(yǎng)24 h 后進行酶活測定，這3 個菌株經(jīng)過連續(xù)10 次傳代， 測定結果如表3 所示。由表3 試驗數(shù)據(jù)可知， 每次測量的中性蛋白酶酶活較前一次菌株保留98%以上，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。 最后，將利用12 min+48 s 的誘變方法篩選出菌株標記為L01F，進行后續(xù)菌種鑒定。

表3 菌種遺傳穩(wěn)定性研究U/mL

2.5 菌種鑒定結果 LB 固體平板上L01F 菌株的菌落形態(tài)為扁平、表面光滑、邊緣不規(guī)則、半透明狀， 顯微鏡下的革蘭氏染色結果表明菌體為長桿狀、染色均勻，可觀察到孢子產(chǎn)生，因此為革蘭氏陽性芽孢桿菌。為進一步確定種屬，分別利用真菌基因組DNA 提取試劑盒和細菌基因組DNA 提取試劑盒提取篩選的L01F 菌株基因組DNA。 直接以提取產(chǎn)物為模板分別用真菌通用引物ITS1/ITS4 和細菌通用引物27F/1492R 進行PCR 擴增。PCR 電泳結果如圖5 所示。

圖5 特異引物PCR 產(chǎn)物電泳

由圖5 電泳結果可知， 泳道1 的真菌通用引物ITS1/ITS4 未擴增出任何特異性條帶，而泳道2的細菌通用引物27F/1492R 擴增產(chǎn)物在1.5 kb左右處有明亮的特異性條帶產(chǎn)生， 隨后將該特異性條帶進行切膠純化并送到上海生工進行測序。將測序結果上傳至NCBI 進行BLAST 檢索，用MEGA 7.0 軟件進行序列相似性分析， 以N-J 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類分析結果如圖6 所示。結合前面形態(tài)鑒定、革蘭氏染色、分子生物學和系統(tǒng)發(fā)育進化樹結果， 可確定菌株L01F 屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖6 菌株L01F 系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 結論

本試驗從土壤中篩選一株高產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌， 利用單因素和復合誘變方法提高菌株的產(chǎn)酶能力。通過牛奶平板篩選，多次劃線得到一株產(chǎn)蛋白酶的菌株，編號L01，福林酚方法測定其酶活力為221.45 U/mL。 分別用紫外線和亞硝酸鈉進行單因素處理，紫外線照射60 s 和亞硝酸鈉處理12 min 時候，菌株L01 的H/C 值達到最大（2.75），其酶活力為459.13 U/mL。 單因素處理后的酶活是原始菌株的2.07 倍。 復合處理結果顯示復合誘變結果優(yōu)于單因素誘變效果， 而先亞硝酸鈉后紫外的復合處理優(yōu)于先紫外后亞硝酸鈉的復合處理方法。 在12 min+48 s 的誘變方法下，L01 菌株的的H/C 值達到最大（4.00），最大產(chǎn)酶酶活力為577.87 U/mL，編號為L01F 菌株的酶活力是原始菌株的2.61 倍。 經(jīng)過10 次以上的傳代，L01F 菌株表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定型。最后經(jīng)過形態(tài)學和分子生物學鑒定，確定篩選出的菌株L01F為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。本研究對產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選、 相關菌株的產(chǎn)酶能力提高和菌種的誘變選擇具有重要意義。