盧 超 , 陳景鮮, 王國(guó)霞, 李春閣, 林 展, 蘇芳誼, 張 苗
(1.鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州450000;2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,福建福州350004)
中性蛋白酶作為工業(yè)酶制劑之一, 在食品工業(yè)、洗滌液、皮革制造業(yè)以及醫(yī)療行業(yè)等領(lǐng)域中均有廣泛的應(yīng)用(李雪等,2019)。目前我國(guó)使用中性蛋白酶的生產(chǎn)菌種主要包括芽孢桿菌、變形桿菌、青霉、曲霉、放線菌等(馮菲等,2021;趙龍妹等,2020)。但直接篩選出的原始產(chǎn)蛋白酶的菌株產(chǎn)酶能力較低,無法滿足工業(yè)化的需求,因此,需對(duì)菌株進(jìn)行處理, 以增強(qiáng)菌株產(chǎn)蛋白酶的能力。 目前提高菌種產(chǎn)酶能力的方法很多,如使用紫外線、粒子束, 以及各種射線的物理誘變方法; 堿基類似物、烷化劑等各種化學(xué)誘變方法(高紫等,2021;高若珊等,2021;季旭等,2021;君胡榮等,2019)。 這些物理和化學(xué)方法不需要昂貴的大型儀器, 是目前采用最普遍的誘變方法(Yu 等,2019)。 胡悅等(2019)在氯化鋰添加量為1.5%、常壓室溫等離子體照射時(shí)間為45 s 的誘變條件下篩選得到地衣芽孢桿菌菌株F-3, 該菌株堿性蛋白酶的酶活達(dá)到12147 U/mL(胡悅等,2021)。 黃子凌等(2021)以紫外、氯化鋰為誘變劑,在經(jīng)過3 輪誘變后,得到了一株表現(xiàn)良好抑菌和益生特性, 且穩(wěn)定高產(chǎn)中性蛋白酶的突變菌株UL-191,其中性蛋白酶活達(dá)108.812 U/mL,較出發(fā)菌株提高了44.2%。
本試驗(yàn)通過牛奶平板篩選, 多次劃線從土壤中篩選得到一株產(chǎn)蛋白酶的菌株L01, 福林酚方法測(cè)定其酶活。 分別用紫外線和亞硝酸鈉進(jìn)行單因素處理,以提高該菌株中性蛋白酶酶活。隨后用紫外線和亞硝酸鈉進(jìn)行復(fù)合處理測(cè)定其發(fā)酵液的酶活。 篩選出中性蛋白酶酶活最高的菌株經(jīng)過10次以上的傳代探索其遺傳穩(wěn)定性。 最后通過分子生物學(xué)方法鑒定篩選出高產(chǎn)中性蛋白酶的菌株。本研究為采用該菌株生產(chǎn)中性蛋白酶的后續(xù)研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
1.1 材料與試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、真菌基因組DNA 提取試劑盒、引物合成,生工生物工程(上海)股份有限公司;Tks Gflex DNA 聚合酶,寶生物工程(大連)有限公司;其他試驗(yàn)所用常規(guī)試劑為市售分析純。
牛奶平板培養(yǎng)基:50%脫脂牛奶,1%瓊脂溶于50%無菌水中,121 ℃滅菌20 min, 溫度降至50 ℃左右混合均勻制作牛奶平板。 酪蛋白平板培養(yǎng)基:0.5%酪蛋白,0.2%磷酸氫二鈉,1%瓊脂,121 ℃滅菌20 min,溫度降至50 ℃左右混合均勻制作酪蛋白平板。 YPD 液體培養(yǎng)基:1%酵母膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖,121 ℃滅菌20 min,溫度降至50 ℃左右混合均勻。 LB 培養(yǎng)基:1%蛋白胨,0.5%酵母粉,1%氯化鈉,121 ℃滅菌20 min,溫度降至50 ℃左右混合均勻。
1.2 儀器與設(shè)備 立式高壓蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(tái):上海一恒科學(xué)儀器有限公司;pH 計(jì):瑞士梅特勒托利多集團(tuán);高速離心機(jī):德國(guó)Eppendorf 公司;恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司; 紫外分光光度計(jì): 德國(guó)Eppendorf 公司;磁力攪拌器:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;分析天平:瑞士梅特勒托利多集團(tuán)。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 菌株篩選 土壤采自鄭州師范學(xué)院西校區(qū)4 號(hào)樓北面樹林,選取地下10 ~ 20 cm 土樣3 g 于100 mL 水中混勻, 放在培養(yǎng)箱中30 ℃振蕩1 h 使充分混勻。 取培養(yǎng)后的菌液1 mL 至9 mL 無菌水中,制成10-1倍菌液,按照上述方法,制成10-4、10-5、10-6倍菌液,將幾種稀釋后的菌液分別涂布于牛奶平板培養(yǎng)基和酪蛋白平板培養(yǎng)基上,放在培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24 h。 挑出有明顯透明圈的菌種在相同培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)劃線處理,根據(jù)透明圈是否容易觀察選擇合適平板培養(yǎng)基。觀察透明圈和菌落直徑大小,測(cè)量透明圈直徑/菌落直徑,即H/C 值,作為初篩評(píng)價(jià)各菌株產(chǎn)蛋白酶的能力。
挑選透明圈明顯且H/C 值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。 將挑選出來的產(chǎn)酶菌種分別加到LB 和YPD 培養(yǎng)基中,30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h。 根據(jù)菌液24 h 內(nèi)OD600變化快慢選擇合適的液體培養(yǎng)基,取24 h 的培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白酶活力測(cè)定。
1.3.2 蛋白酶活力檢測(cè)方法 參考盧超等(2020)試驗(yàn)方法,取新鮮發(fā)酵液于4 ℃,8000 r/min 條件下離心8 min,吸取上清作為活性檢測(cè)的粗酶液。按照GB/T23537-2009《蛋白酶制劑》,利用福林-酚法測(cè)定酶活力。
1.3.3 單因素誘變處理 紫外線誘變處理: 超凈臺(tái)紫外滅菌30 min 后,用滅菌針頭蘸取稀釋后的菌懸液在紅燈下分別在牛奶平板培養(yǎng)基上點(diǎn)板處理。對(duì)照組點(diǎn)板之后不做任何處理;試驗(yàn)組在預(yù)試驗(yàn)中確定時(shí)間間隔為12 s, 完全暴露在功率20 W的紫外燈下20 cm 處,分別照射12、24、36、48、60、72、84 s。 處理后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24 h。測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)基上所有菌落的H/C 值,挑選出H/C值最大的4 個(gè)菌落,分別放入LB 培養(yǎng)基,在振蕩培養(yǎng)箱中,30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測(cè)酶活力。
化學(xué)試劑誘變處理: 取初篩出的菌懸液稀釋20 倍,后取0.2 mL 稀釋液加入等量0.1 moL 亞硝酸鈉溶液,由預(yù)試驗(yàn)得出誘變時(shí)間間隔是2 min,從6 min 開始處理,分別處理6、8、10、12、14、16 min后,分別加入0.2 mL 的等濃度磷酸氫二鈉溶液混勻。 空白對(duì)照組將亞硝酸鈉替換成生理鹽水。 處理后的菌液在牛奶平板培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)板, 置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)24 h。 測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)基上所有菌落的H/C 值,挑選出H/C 值最大的4 個(gè)菌落,分別放入LB 培養(yǎng)基,在振蕩培養(yǎng)箱中,30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測(cè)酶活力。
1.3.4 復(fù)合誘變處理 先紫外再化學(xué)處理: 首先用滅菌牙簽蘸取稀釋20 倍后的菌懸液在紅燈下分別在牛奶平板培養(yǎng)基上點(diǎn)板處理。 置于超凈臺(tái)上完全暴露在功率20 W 的紫外燈下, 分別照射36、48、60 s, 同時(shí)以未經(jīng)紫外誘變處理的作為對(duì)照組,處理后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)8 h。其次, 在離心小管中加入0.2 mL 的亞硝酸鈉溶液, 用滅菌牙簽蘸取紫外誘變后的菌分別放入亞硝酸鈉溶液中, 分別誘變8、10、12 min 后加入磷酸氫二鈉溶液。 對(duì)照組以生理鹽水代替亞硝酸鈉溶液。 蘸取誘變后的菌液及對(duì)照組在牛奶平板上進(jìn)行點(diǎn)板,置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)24 h。測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)基上所有菌落的H/C 值, 挑選出H/C值最大的3 個(gè)菌落,分別放入LB 培養(yǎng)基,在振蕩培養(yǎng)箱中,30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測(cè)酶活力。
先化學(xué)再紫外處理:取0.2 mL 稀釋液加入等量0.1 mol 亞硝酸鈉溶液混勻,分別處理8、10、12 min 后,各加入0.2 mL 的等濃度磷酸氫二鈉溶液。對(duì)照組以生理鹽水代替亞硝酸鈉溶液?;瘜W(xué)誘變后的菌液在制備好的牛奶平板培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)板。 點(diǎn)板之后將其置于已滅菌的超凈臺(tái)上完全暴露在功率20 W 的紫外燈下,分別照射36、48、60 s,同時(shí)以未經(jīng)紫外誘變處理的作為對(duì)照組。 蓋上培養(yǎng)基蓋子并做好相應(yīng)標(biāo)記,于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)24 h。 測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)基上所有菌落的H/C值,挑選出H/C 值最大的3 個(gè)菌落,分別放入LB培養(yǎng)基, 在振蕩培養(yǎng)箱中,30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 測(cè)酶活力。
1.3.5 菌株穩(wěn)定性研究 將挑選出的菌株進(jìn)行酶活測(cè)定后, 從這6 個(gè)菌株中挑選出酶活最大的3個(gè)菌株進(jìn)行穩(wěn)定性研究。 將3 個(gè)菌株接種到LB培養(yǎng)基中, 在振蕩培養(yǎng)箱中以30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h 后測(cè)蛋白酶酶活, 依次連續(xù)傳代培養(yǎng)10次,并用福林-酚法測(cè)定中性蛋白酶酶活力。
1.3.6 菌種的鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒和真菌基因組DNA 提取試劑盒分別提取菌種基 因 組DNA。 利 用 通 用 引 物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和1492R (5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’) 擴(kuò)增細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取產(chǎn)物, 通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴(kuò)增真菌基因組DNA 提取試劑盒提取產(chǎn)物。 PCR 采用Tks Gflex DNA 聚合酶,25 μL 擴(kuò)增體系。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃變性1 min,98 ℃變性10 s,60 ℃復(fù)性15 s,68 ℃延伸50 s,30 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并將其產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行BLAST 分析,然后用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行序列相似性分析, 以N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用Bootstrap(1000 次重復(fù))進(jìn)行檢驗(yàn)。
2.1 培養(yǎng)基篩選結(jié)果 用牛奶平板和酪蛋白平板兩種培養(yǎng)基涂板之后進(jìn)行培養(yǎng)。通過菌種在兩種平板上生長(zhǎng)情況的對(duì)比發(fā)現(xiàn),菌種在牛奶平板上生長(zhǎng)的更快,H/C 值相對(duì)較大更容易觀察, 另外牛奶平板在配制的時(shí)候更方便,因此最終選擇用牛奶平板進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 挑選出的單菌落在LB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)更快,因此液體培養(yǎng)基選擇LB 培養(yǎng)基。 將挑選出的出發(fā)菌株標(biāo)記為L(zhǎng)01,進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
2.2 紫外線及亞硝酸鈉單因素處理結(jié)果
2.2.1 紫外線處理結(jié)果 由圖1 數(shù)據(jù)可知, 在相同紫外照射的時(shí)間下,L01 菌株表現(xiàn)出不同的H/C 值,一部分H/C 值增大,呈現(xiàn)正突變,一部分H/C 值增大,呈現(xiàn)負(fù)突變。 從整體上來說,L01 菌株H/C 值在0 ~ 60 s 處理時(shí)間段內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)步增加的趨勢(shì),在60 s 時(shí)菌株H/C 值有最高點(diǎn),而H/C 值在60 ~ 84 s 處理時(shí)間段內(nèi)呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)。這可能是由于紫外線照射時(shí)間較長(zhǎng)后引起菌株的死亡,因此L01 菌株紫外線處理的最佳誘變時(shí)間為60 s,H/C 值最大為2.75。
圖1 紫外線處理后H/C 值結(jié)果
2.2.2 亞硝酸鈉處理結(jié)果 由圖2 數(shù)據(jù)可知,從整體上來說,L01 菌株H/C 值在經(jīng)亞硝酸鈉處理0 ~12 min 處理時(shí)間段內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)步增加的趨勢(shì), 在12 min 時(shí)菌株H/C 值有最高值, 而H/C 值在12~16 min 處理時(shí)間段內(nèi)呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)。 而在亞硝酸鈉處理6 min 時(shí),L01 菌株的H/C 值呈現(xiàn)正突變和負(fù)突變同時(shí)存在的情況。 相比紫外線處理而言,L01 菌株經(jīng)亞硝酸鈉處理后的H/C 值表現(xiàn)出更集中的趨勢(shì)。L01 菌株亞硝酸鈉處理的最佳時(shí)間誘變時(shí)間為12 min,H/C 值最大為2.76。
圖2 亞硝酸鈉處理后H/C 值結(jié)果
2.2.3 單因素處理菌株酶活測(cè)定結(jié)果 分別對(duì)單因素處理24 h 后的菌落,挑取H/C 值極大值的菌落,用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌培養(yǎng),培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行酶活測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如表1 所示。紫外線處理時(shí)間從0 ~ 60 s,H/C 值從1.75 增加到2.75,L01 菌株中性蛋白酶活力從221.45 U/mL 增加到459.13 U/mL。 這與亞硝酸鈉處理結(jié)果類似,亞硝酸鈉處理時(shí)間從0 ~ 12 min,L01 菌株中性蛋白酶活力增加到459.13 U/mL。 由表1 數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn),紫外線或亞硝酸鈉處理后L01 菌株的H/C 值與酶活力測(cè)定結(jié)果成正比,說明利用H/C 值初篩中性蛋白酶活力的方法是可行的。
表1 單因素處理菌株酶活測(cè)定結(jié)果
2.3 復(fù)合誘變2 因素3 水平測(cè)定結(jié)果
2.3.1 先紫外后亞硝酸鈉處理結(jié)果 由圖3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知, 先紫外后亞硝酸鈉復(fù)合處理的9 個(gè)組合,各組合的H/C 值差異較大,最低的H/C 值為1.23,出現(xiàn)在先紫外處理60 s 后亞硝酸鈉處理12 min 的組合, 這可能由于復(fù)合誘變時(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致菌體死亡。 最高的H/C 值為3.00,其處理時(shí)間為先紫外處理48 s 后亞硝酸鈉處理8 min 的組合,以及先紫外處理48 s 后亞硝酸鈉處理12 min 的組合,但48 s+10 min 的組合,其H/C 的均值是9個(gè)組合中最高,為2.25。
圖3 先紫外后亞硝酸鈉處理結(jié)果
2.3.2 先亞硝酸鈉后紫外處理結(jié)果 由圖4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知, 先亞硝酸鈉后紫外復(fù)合處理的9 個(gè)組合,12 min+48 s 和12 min+60 s 兩個(gè)組合的H/C值差異較大, 其余7 個(gè)組合的H/C 值差異較小,但較集中。 最高的H/C 值為4.00,其處理時(shí)間為先亞硝酸鈉處理12 min 后紫外處理48 s 的組合,且12 min+48 s 的處理組合,其H/C 值的均值是9 個(gè)組合中最高,為2.48。
圖4 先亞硝酸鈉后紫外處理結(jié)果
2.3.3 復(fù)合處理菌株酶活測(cè)定結(jié)果 復(fù)合誘變之后分別挑取H/C 值極大值的菌落,誘變時(shí)間分別是36 s+12 min,48 s+8 min,48 s+12 min,8 min+48 s,12 min+48 s,12 min+60 s 的菌落用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌培養(yǎng), 培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行酶活測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如表2 所示。
表2 復(fù)合處理菌株酶活測(cè)定結(jié)果
結(jié)合表1 和表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,L01 菌株進(jìn)行單因素誘變之后, 將篩選出的產(chǎn)中性蛋白酶菌株進(jìn)行酶活測(cè)定, 測(cè)定菌株的最大產(chǎn)酶能力是459.13 U/mL,L01 菌株進(jìn)行復(fù)合誘變之后, 篩選出的產(chǎn)中性蛋白酶菌株進(jìn)行酶活測(cè)定,結(jié)果表明,最大產(chǎn)酶酶活為577.87 U/mL。 表明復(fù)合誘變最大值優(yōu)于單因素誘變效果。由表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,在進(jìn)行最優(yōu)產(chǎn)酶菌株篩選時(shí),先亞硝酸鈉后紫外的復(fù)合處理優(yōu)于先紫外后亞硝酸鈉的復(fù)合處理方法。在12 min+48 s 的誘變方法下,L01 菌株的最大產(chǎn)酶酶活為577.87 U/mL,較出發(fā)菌株的221.45 U/mL提高了158.87%。
2.4 菌株的穩(wěn)定性研究結(jié)果 將在復(fù)合誘變中篩選出產(chǎn)中性蛋白酶酶活最大的3 個(gè)菌株再次用LB 平板劃線后挑出單菌落,用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌培養(yǎng),每隔培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行酶活測(cè)定,這3 個(gè)菌株經(jīng)過連續(xù)10 次傳代, 測(cè)定結(jié)果如表3 所示。由表3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知, 每次測(cè)量的中性蛋白酶酶活較前一次菌株保留98%以上,具有良好的遺傳穩(wěn)定性。 最后,將利用12 min+48 s 的誘變方法篩選出菌株標(biāo)記為L(zhǎng)01F,進(jìn)行后續(xù)菌種鑒定。
表3 菌種遺傳穩(wěn)定性研究U/mL
2.5 菌種鑒定結(jié)果 LB 固體平板上L01F 菌株的菌落形態(tài)為扁平、表面光滑、邊緣不規(guī)則、半透明狀, 顯微鏡下的革蘭氏染色結(jié)果表明菌體為長(zhǎng)桿狀、染色均勻,可觀察到孢子產(chǎn)生,因此為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌。為進(jìn)一步確定種屬,分別利用真菌基因組DNA 提取試劑盒和細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取篩選的L01F 菌株基因組DNA。 直接以提取產(chǎn)物為模板分別用真菌通用引物ITS1/ITS4 和細(xì)菌通用引物27F/1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 電泳結(jié)果如圖5 所示。
圖5 特異引物PCR 產(chǎn)物電泳
由圖5 電泳結(jié)果可知, 泳道1 的真菌通用引物ITS1/ITS4 未擴(kuò)增出任何特異性條帶,而泳道2的細(xì)菌通用引物27F/1492R 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5 kb左右處有明亮的特異性條帶產(chǎn)生, 隨后將該特異性條帶進(jìn)行切膠純化并送到上海生工進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI 進(jìn)行BLAST 檢索,用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行序列相似性分析, 以N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,聚類分析結(jié)果如圖6 所示。結(jié)合前面形態(tài)鑒定、革蘭氏染色、分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果, 可確定菌株L01F 屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
圖6 菌株L01F 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹
本試驗(yàn)從土壤中篩選一株高產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌, 利用單因素和復(fù)合誘變方法提高菌株的產(chǎn)酶能力。通過牛奶平板篩選,多次劃線得到一株產(chǎn)蛋白酶的菌株,編號(hào)L01,福林酚方法測(cè)定其酶活力為221.45 U/mL。 分別用紫外線和亞硝酸鈉進(jìn)行單因素處理,紫外線照射60 s 和亞硝酸鈉處理12 min 時(shí)候,菌株L01 的H/C 值達(dá)到最大(2.75),其酶活力為459.13 U/mL。 單因素處理后的酶活是原始菌株的2.07 倍。 復(fù)合處理結(jié)果顯示復(fù)合誘變結(jié)果優(yōu)于單因素誘變效果, 而先亞硝酸鈉后紫外的復(fù)合處理優(yōu)于先紫外后亞硝酸鈉的復(fù)合處理方法。 在12 min+48 s 的誘變方法下,L01 菌株的的H/C 值達(dá)到最大(4.00),最大產(chǎn)酶酶活力為577.87 U/mL,編號(hào)為L(zhǎng)01F 菌株的酶活力是原始菌株的2.61 倍。 經(jīng)過10 次以上的傳代,L01F 菌株表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定型。最后經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,確定篩選出的菌株L01F為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。本研究對(duì)產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選、 相關(guān)菌株的產(chǎn)酶能力提高和菌種的誘變選擇具有重要意義。