祁根兄，紀(jì)麗麗，張慧

摘要：準(zhǔn)確識別血液中各種血細(xì)胞的形態(tài)、構(gòu)造，并繪出各種血細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖，是動物醫(yī)學(xué)專業(yè)大一學(xué)生在心血管系統(tǒng)這一章節(jié)中的實(shí)訓(xùn)技能課。針對此種情況，對血涂片的制作提出改進(jìn)方法，盡可能減少實(shí)驗失敗的幾率，從而提高學(xué)生的實(shí)習(xí)熱情，把學(xué)生的注意力吸引到實(shí)驗課上來。為圓滿完成實(shí)驗教學(xué)任務(wù)創(chuàng)造了必要條件。

關(guān)鍵詞：動物醫(yī)學(xué)專業(yè);血涂片;制作;血細(xì)胞形態(tài);識別

對于絕大多數(shù)動物醫(yī)學(xué)專業(yè)的大一學(xué)生而言，血細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢的學(xué)習(xí)和實(shí)踐較為困難，能將其學(xué)好、學(xué)精者為數(shù)不多，具體表現(xiàn)為學(xué)生相關(guān)理論知識欠缺，多數(shù)學(xué)生僅停留在單個血細(xì)胞的形態(tài)識別上，而欠缺利用血細(xì)胞形態(tài)學(xué)理論課上的內(nèi)容對各種血細(xì)胞進(jìn)行觀察和總結(jié)，實(shí)習(xí)熱情不高，因此為了激發(fā)興趣、調(diào)動積極性并保證每個學(xué)生積極主動地投入實(shí)驗，取得較滿意的教學(xué)效果。血細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢是血液檢驗的重要內(nèi)容，也是眾多血液病的基礎(chǔ)診斷技術(shù)，同時可為疾病療效判斷提供依據(jù)[1]。

1 采血

做血涂片所用血液可以提前采好，也可以現(xiàn)用現(xiàn)采，各有優(yōu)、缺點(diǎn)，提前采好的優(yōu)點(diǎn)是可以節(jié)約上課時間，缺點(diǎn)在于保存時間過長或溫度不合適，會造成血細(xì)胞沉淀和凝集?，F(xiàn)場采集的優(yōu)點(diǎn)是血液比較新鮮，血細(xì)胞在血涂片上分布較均勻，不會造成血細(xì)胞的凝集現(xiàn)象。缺點(diǎn)是采血時出現(xiàn)學(xué)生之間推來推去或不敢采血的現(xiàn)象，有的同學(xué)還會導(dǎo)致采血失敗，耽擱時間，影響實(shí)驗順利開展，實(shí)驗準(zhǔn)備時間會延長，導(dǎo)致課堂秩序混亂和學(xué)生注意力會出現(xiàn)分散現(xiàn)象。

2 血液取用

將血液滴加在載玻片上，此方法可采用載玻片的四個邊角中的其中一個尖角蘸取血液[2]，但是蘸取血液的量一定要少，不能太多，若太多會導(dǎo)致血細(xì)胞大量堆積和重疊，最后致使無法觀察而讓實(shí)驗失敗。也不能太少，太少會導(dǎo)致圖片上可供觀察的血細(xì)胞太少。另外也可采用20μL微量移液管來移取血液，吸取5μL就夠了，此法優(yōu)點(diǎn)是血量的把控準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是微量移液管使用要熟練，微量移液管使用不熟練者會導(dǎo)致血量把控不準(zhǔn)而影響血細(xì)胞的觀察。

3 血液涂片

將血液涂布在載玻片上，此方法可以采取用載玻片1的邊緣去推片或拉片的方法[3]。若用左手固定載玻片2，將血滴加在載玻片2右側(cè)中央時，可以采用350傾斜使載玻片1先與血滴接觸，等血滴沿載玻片1的邊緣慢慢滲透并擴(kuò)散開。然后將載玻片1勻速向載玻片2的左側(cè)勻速推動，直到將血滴推完為止。這樣血液就均勻涂布在載玻片2上了（如圖1所示）。反之，若將血滴滴加在載玻片2的左側(cè)中央時，可以采用350度傾斜，同樣使載玻片1先與血滴接觸，等血滴沿載玻片1的邊緣慢慢滲透并擴(kuò)散開。然后將載玻片1勻速向載玻片2的右側(cè)拉動直到將血滴拉完為止，這樣血液就均勻涂布在載玻片2上了。此操作過程中等待血液沿載玻片1邊緣擴(kuò)散，這一現(xiàn)象非常重要（如圖2所示）。若不等血滴擴(kuò)散就推片或拉片，就會造成血細(xì)胞堆積和重疊現(xiàn)象。若速度控制不好，會導(dǎo)致血膜涂布不均勻，有的區(qū)域有，有的區(qū)域無的斑馬線現(xiàn)象，而致使顯微鏡下無法觀察血細(xì)胞。

4 干燥

將血液涂布在載玻片2上面后，涂片制成后，應(yīng)在空氣中快速搖動或扇干，將血膜干燥并固定附著在載玻片上，防止細(xì)胞皺縮變形或因空氣潮濕而溶血。

5 染色

采用瑞氏-姬母薩染色法[4]，瑞氏-姬姆薩染液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，瑞氏-姬姆薩染液試劑由瑞氏-姬姆薩染液（A液），磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）（B液）組成，在pH值為6.8的緩沖液中，血液中的大多數(shù)蛋白質(zhì)均達(dá)到或接近自己的等電點(diǎn)，因而能很好地吸附相應(yīng)的染料而著色。

瑞氏-姬姆薩染色液是利用Romanowsky Stain技術(shù)原理改良而成的。細(xì)胞的著色過程是染料透入被染物并存留其內(nèi)部的一種過程，此過程既有物理吸附作用，又有化學(xué)親和作用。各種細(xì)胞及細(xì)胞的各種成分由于其化學(xué)性質(zhì)不同，對瑞氏-姬姆薩染色液中的酸性染料（曙紅）和堿性染料（亞甲藍(lán)）的親和力也不一樣。因此，標(biāo)本涂片經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色液染色后，相應(yīng)各類細(xì)胞呈現(xiàn)不同的著色，從而達(dá)到辨別其形態(tài)特征的目的。大一新生第一次接觸到，應(yīng)向他們說明它包括嗜酸性染料和嗜堿性染料兩部分，因此染色后，細(xì)胞中嗜酸性物質(zhì)呈紅色，嗜堿性物質(zhì)呈藍(lán)色，嗜中性物質(zhì)呈紫紅色，這對正確理解血涂片上不同種類血細(xì)胞呈現(xiàn)不同顏色有較好的幫助。

染色方法：滴加A液約0.5～0.8mL于涂片上，染色1min;再將B液滴加于A液上（滴加量為A液的2～3倍），以洗耳球吹出微風(fēng)使液面產(chǎn)生漣漪狀，使兩液充分混合，染色4～10min。切記不要使染液蒸發(fā)干，若染色時間過長或染液蒸發(fā)干，就會導(dǎo)致染料附著太嚴(yán)重，而無論怎么水洗都洗不干凈。

另外，染色時間需視何種標(biāo)本、涂片厚薄、有核細(xì)胞多少、何種細(xì)胞及室溫等而定;氣溫較低時，可適當(dāng)延長染色時間。染色結(jié)果如出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞變堿，則考慮是否染色時間太長所致。染液量需充足，勿使染液蒸發(fā)干燥，以防染料沉著于涂片上。做血細(xì)胞染色時，當(dāng)天氣寒冷或濕度較大時，應(yīng)于37℃溫箱中保溫促干，以免細(xì)胞變形縮小或在染色時脫片。染液若被裝載于染色機(jī)上使用，B液的開封使用時間不宜過長，以免因管路和空氣污染出現(xiàn)絮狀沉淀。染色的好壞固然與涂片的好壞有關(guān)，但染料的質(zhì)量、緩沖液的pH值及染色時間等對其也有重要的影響，而緩沖液的pH值對血涂片染色的影響常被忽視。

6 水洗

水洗（沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖去，以防有沉渣沉淀在標(biāo)本上），水洗時水流要細(xì)小，沿玻片2的邊緣緩慢沖洗，不能用大水流正對血膜直沖，這樣會導(dǎo)致血膜沖落。水洗1～2min后要在顯微鏡下觀察一下水洗的效果，若沒洗干凈，再繼續(xù)水洗，水洗過程中要勤觀察，直到洗干凈為止，不然有可能會導(dǎo)致洗不干凈或沖洗時間過長而導(dǎo)致顏色變淡。

7 鏡檢

等水洗完成后，用吸水紙吸掉玻片2上的水分，注意不要擦拭，以免擦掉血膜。將吸掉水分的玻片2置于顯微鏡載物臺上進(jìn)行鏡檢。紅細(xì)胞呈粉紅色，白細(xì)胞漿中顆粒清楚，并顯示出各種細(xì)胞特有的色彩，細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。白細(xì)胞形態(tài)上與血細(xì)胞涂片的白細(xì)胞相同，一般白細(xì)胞的多寡，提示發(fā)炎程度的高低，對醫(yī)師的診斷具有一定的指標(biāo)作用[5]。血細(xì)胞的染色、白細(xì)胞中的特殊顆粒均顯示清晰，紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白染成桔紅色[6]，中性粒細(xì)胞顆粒染成藍(lán)紫至紫紅色，嗜酸性粒細(xì)胞顆粒染成鮮紅色，嗜堿性粒細(xì)胞顆粒染成深紫藍(lán)色，淋巴細(xì)胞核染成深藍(lán)紫色，胞質(zhì)染成天藍(lán)色。單核細(xì)胞核染成淺紫色，胞質(zhì)染成灰藍(lán)色[7]。

總之，采血、血液取用、涂片、干燥、染色、水洗等過程每一步都至關(guān)重要，稍有疏忽，就會全盤皆輸。因此每一步都要嚴(yán)格把握，不可粗心大意，更不能急于求成。以確保實(shí)驗過程順利進(jìn)行，力求制作出清晰、好辨認(rèn)、標(biāo)準(zhǔn)的血液涂片。

參考文獻(xiàn)：

[1] 方向，蔣婧.血液涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)聯(lián)合全自動血細(xì)胞分析儀在血常規(guī)檢驗中的應(yīng)用價值分析[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，2021，45（23）：2549-2551.

[2] 南京農(nóng)學(xué)院.家畜生理學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1982：62-63.

[3] 周其虎.動物解剖生理[M].第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2019.

[4] 董常生.家畜解剖學(xué)[M].第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[5] 丁靜，黃世霜，胡延生.骨髓涂片、印片與切片檢查在基層醫(yī)院診斷血液疾病中的應(yīng)用[J].福建醫(yī)藥雜志，2020，42（3）：172-174.

[6] 劉春亮.血涂片分析在血常規(guī)檢驗中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥指南，2021，19（18）：89-90.

[7] 鄭秀詩.血涂片染色方法的研究進(jìn)展知多少[J].家庭生活指南，2019（5）：159.