陳璐，吳靜霞，劉曉燕，蔣志濤

(張家港市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 張家港 215600)

目前腦卒中已成為全球致死和致殘的第二大原因[1-2]，其典型病理特征為突發(fā)性神經(jīng)功能損傷。研究表明，缺血性腦卒中的發(fā)病率約為69.6%，居所有腦卒中的第一位[3]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischiemia-reperfusion injury，CIRI)導(dǎo)致的遲發(fā)性神經(jīng)損傷極大地影響患者的預(yù)后以及神經(jīng)功能的恢復(fù)。既往研究表明，CIRI是一種復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)性病理生理過程，其機(jī)制主要涉及氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡等[4-5]。但目前有關(guān)CIRI的具體分子作用機(jī)制以及藥物治療尚不完全明確。阿司匹林是臨床上常用的非甾體抗炎藥物，在抗血栓形成以及神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用。基礎(chǔ)與臨床研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能夠降低大鼠CIRI細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)損傷[6-7]，但阿司匹林對大鼠CIRI神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚不完全清楚。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoid domain receptor 1，DDR1)是一種非整合素膠原受體，為酪氨酸激酶蛋白家族成員之一，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡等[8-9]。DDR1在大鼠CIRI中發(fā)揮重要作用。大鼠CIRI模型中DDR1表達(dá)顯著升高，抑制DDR1可以降低基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，從而降低血腦屏障的通透性[10]。本研究旨在探究阿司匹林通過調(diào)控DDR1表達(dá)對大鼠CIRI神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，以期為CIRI神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取無特定病原體級雄性6～8周齡SD大鼠30只，體重180～200 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證合格證號：SCXK(皖)2017-0001，本實驗經(jīng)動物實驗醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2藥品與試劑 阿司匹林腸溶片(徐州恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：20171001)；蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin staining，HE)染色液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：C0105S)；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：C1091)；DDR1一抗(美國Cell Signaling Technology，批號：5583)；胱天蛋白酶3(caspase-3)一抗(美國Cell Signaling Technology，批號：14220)；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)一抗(美國Cell Signaling Technology，批號：15071)；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：89477)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：5174)；一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：P0023A)；小鼠二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：A0286)；兔二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：A0277)；極超敏ECL發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號：P0018FS)。

1.3儀器 高速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器有限公司生產(chǎn)，型號：G22-W)；多功能酶標(biāo)儀[Thermo賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn)，型號：SuPerMax 3000FA]；組織渦旋儀(武漢維塞爾生物科技有限公司生產(chǎn)，型號：M371450)；熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯Olympus有限公司生產(chǎn)，型號：TC-XDS-500C)；Western blotting檢測裝置(美國Bio-Rad伯樂公司生產(chǎn)，型號：DYCZ-40D)；成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad伯樂公司生產(chǎn)，型號：GoodLook-1000)。

1.4動物建模及分組 30只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組和阿司匹林干預(yù)組，每組10只。其中腦缺血再灌注組采用0.2 mm的尼龍線制作栓子，按照參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行相應(yīng)操作，將大鼠取仰臥位固定，沿頸正中線切開，分離肌肉和筋膜、左側(cè)頸總動脈、頸外動脈以及頸內(nèi)動脈，并在頸總動脈遠(yuǎn)心端、近心端以及頸外動脈處用細(xì)線掛線備用，其中腦缺血再灌注組大鼠采用線栓結(jié)扎，假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。腔內(nèi)線栓法制作大鼠腦中動脈栓塞模型，缺血2 h后，拔出栓子再灌注24 h。假手術(shù)組大鼠不插入栓子，余手術(shù)操作方法與腦缺血再灌注組一致。阿司匹林干預(yù)組大鼠在腦缺血再灌注模型基礎(chǔ)上給予阿司匹林藥物灌胃處理，在再灌注0 h和6 h時分別予阿司匹林60 mg/kg灌胃，其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃處理。

1.5HE染色 再灌注24 h，迅速采用端頭取腦，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%的多聚甲醛固定各組大鼠腦組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進(jìn)行腦組織染色。

1.6TUNEL染色測定細(xì)胞凋亡 實驗取材如HE染色，TUNEL法測定腦細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核呈棕色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率(%)=棕色細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目。

1.7Western blot檢測腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1表達(dá) 取各組大鼠的腦組織放置于組織研磨管內(nèi)，按照1∶4的比例加入組織裂解液并置于冰上裂解40 min，期間每間隔5分鐘進(jìn)行腦組織渦旋振蕩，以保證裂解完全，將裂解后的離心管置于離心機(jī)內(nèi)，在4 ℃條件下，以離心半徑18 cm、12 000 r/min離心10 min，取組織上清液。二辛喹酸法測定蛋白質(zhì)濃度，按照35 μg/孔上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育caspase-3一抗(1∶1 000)、Bcl-2一抗(1∶500)、Bax一抗(1∶1 000)以及DDR1一抗(1∶500)，4 ℃條件下孵育16 h，洗膜，孵育對應(yīng)的二抗室溫孵育60 min，TBST緩沖液(吐溫20磷酸緩沖鹽溶液)洗膜5 min×3次，加入顯影液，顯影并拍照。圖片掃描后用Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶灰度值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腦神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 HE染色觀察各組大鼠腦神經(jīng)元形態(tài)特征，結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦神經(jīng)完整，無典型的病理損傷；腦缺血再灌注組海馬CA1區(qū)域椎體細(xì)胞稀疏、有大量空泡，細(xì)胞間質(zhì)增寬，細(xì)胞核固縮；阿司匹林干預(yù)組CA1區(qū)域椎體細(xì)胞增多、空泡減少，細(xì)胞間質(zhì)變窄，腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。見圖1。

2.2各組大鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較 TUNEL染色檢測各組大鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、阿司匹林干預(yù)組細(xì)胞凋亡率分別為(8.98±2.50)%、(50.25±8.50)%、(30.25±9.44)%，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.431，P<0.001)。與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預(yù)組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注：HE為蘇木精-伊紅

注：TUNEL為原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)

2.3各組大鼠腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1蛋白表達(dá)比較 各組大鼠腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組腦組織caspase-3、Bax和DDR1蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預(yù)組腦組織caspase-3、Bax和DDR1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織caspase-3、Bcl-2、Bax和DDR1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

阿司匹林是一種經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕藥，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及心腦血管疾病中發(fā)揮重要療效[12]。CIRI是臨床常見的一種心腦血管性疾病，指腦組織缺血后于一定時間恢復(fù)血液供應(yīng)誘發(fā)腦功能障礙加重的現(xiàn)象。代謝障礙、氧自由基的合成增加、細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡以及細(xì)胞凋亡等是CIRI的關(guān)鍵分子調(diào)節(jié)機(jī)制[13-14]。既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能夠改善CIRI神經(jīng)損傷，其作用機(jī)制為通過抑制細(xì)胞凋亡降低炎癥、改變腦血管屏障等[15-16]。另外，阿司匹林能夠通過抑制核因子κB信號通路和降低炎癥細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α)緩解CIRI大鼠神經(jīng)損傷[16]。

細(xì)胞凋亡是維持自身穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，又稱程序性細(xì)胞死亡。caspase-3和Bcl-2表達(dá)失衡是造成細(xì)胞凋亡機(jī)制改變的重要因素[17]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注組海馬CA1區(qū)域椎體細(xì)胞稀疏、有大量空泡，細(xì)胞間質(zhì)增寬，細(xì)胞核固縮。阿司匹林灌胃CIRI大鼠海馬CA1區(qū)域椎體細(xì)胞增多、空泡減少，細(xì)胞間質(zhì)變窄；進(jìn)一步觀察阿司匹林對腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組細(xì)胞凋亡率顯著升高；與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預(yù)組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

細(xì)胞凋亡是caspase-3介導(dǎo)的程序性死亡，Bcl-2/Bax表達(dá)比例失衡是造成細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[17]。本研究通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組腦組織caspase-3、Bax表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)；與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預(yù)組腦組織caspase-3、Bax表達(dá)顯著降低(P<0.05)，表明阿司匹林能夠通過抑制細(xì)胞凋亡改善CIRI神經(jīng)損傷。

DDR1是一種酪氨酸蛋白受體激酶，主要分為細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，在多種組織和器官中廣泛性表達(dá)。研究表明，當(dāng)細(xì)胞接受外界膠原蛋白的刺激后可與DDR1細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并最終引起DDR1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域活化介導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡等一系列病理生理過程[9]。DDR1在腦缺血再灌注中發(fā)揮重要作用。大鼠局灶性腦缺血損傷模型的DDR1表達(dá)顯著升高，抑制DDR1能夠降低基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，減輕血腦屏障和腦缺血損傷[18]。另外，在腫瘤和糖尿病血管內(nèi)皮損傷中，DDR1表達(dá)顯著升高，抑制DDR1能夠減少腫瘤細(xì)胞增殖和高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8,19]。故推測，DDR1可能參與阿司匹林抑制CIRI神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。本研究結(jié)果顯示，與腦缺血再灌注組相比，阿司匹林干預(yù)組腦組織DDR1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。DDR1能夠通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[19]。另外，DDR1也能夠通過調(diào)控Noth1和核因子κB信號調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分化與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，如Bcl-2、細(xì)胞周期蛋白D[20-21]。由此可見，阿司匹林可通過下調(diào)DDR1表達(dá)抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮CIRI神經(jīng)保護(hù)作用。但阿司匹林通過下調(diào)DDR1抑制CIRI神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚未闡明。

綜上所述，阿司匹林可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷，其機(jī)制可能與阿司匹林抑制DDR1蛋白表達(dá)、減少細(xì)胞凋亡相關(guān)。