張莉敏，常攀峰，黨 巖，張述斌，馬志宏

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000）

羊接觸傳染性膿皰性皮炎俗稱羊口瘡（ORF），又稱羊傳染性膿皰（contagious ecthyma,CE）或羊傳染性膿皰性皮炎（contagious pustular dermatitis,CPD），是一種由羊接觸傳染性膿皰性皮炎病毒引起的急性接觸性傳染病，患羊在口腔黏膜、唇側(cè)唇部、面部、腿部和乳房部的皮膚形成丘疹、膿皰、潰瘍及結(jié)痂，影響采食、哺乳及運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致患羊身體衰弱，繼發(fā)感染其他疾病而死亡[1]。我國(guó)養(yǎng)羊的地區(qū)均有該病流行。甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所從20世紀(jì)80年代開始經(jīng)多年研究，從多株羊傳染性膿皰病毒中選育出毒力強(qiáng)、免疫原性好的HCE毒株，在犢牛睪丸細(xì)胞上連續(xù)繼代致弱，培育出免疫原性較好的弱毒株，在此基礎(chǔ)上研究出的細(xì)胞弱毒凍干疫苗免疫保護(hù)率達(dá)75%以上，免疫期3個(gè)月[2]。交互免疫試驗(yàn)證明對(duì)甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古、湖北、廣州、云南等10多個(gè)地區(qū)綿山羊傳染性膿皰病毒的攻擊均有良好的保護(hù)作用。該疫苗于1989年通過專家驗(yàn)收鑒定，獲甘肅省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)，原農(nóng)業(yè)部生物制品規(guī)程委員會(huì)審議通過了《羊傳染性膿皰皮炎活疫苗的制造及檢驗(yàn)規(guī)程》，原農(nóng)業(yè)部頒發(fā)了《新獸藥證書》，產(chǎn)品在原蘭州生物藥品廠進(jìn)行中試生產(chǎn)，推廣應(yīng)用于甘肅、陜西、湖北、內(nèi)蒙古等地。該疫苗采用口唇劃痕法接種，方法簡(jiǎn)單、易掌握，對(duì)發(fā)病羊群免疫可控制該病流行，對(duì)潛伏期羊只免疫可使發(fā)病癥狀減輕，特別對(duì)1月齡左右的羔羊和育成羊具有良好的保護(hù)作用。

該病免疫學(xué)的特殊性及日益廣泛的世界貿(mào)易活動(dòng)，導(dǎo)致我國(guó)原在西北地區(qū)已經(jīng)控制的ORF，近年來在全國(guó)普遍流行，特別是山東、天津、北京和江蘇等地流行嚴(yán)重，給我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。在這樣的情況下，甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所與山東華宏生物工程有限公司合作，進(jìn)行羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗研制，以求盡快將羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)中。本文就羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒苗的免疫攻毒試驗(yàn)報(bào)告如下。

1 試驗(yàn)材料

1.1 種毒

試驗(yàn)用的ORF種毒來源于甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究室種毒試驗(yàn)室。

1.2 動(dòng)物與疫苗

試驗(yàn)羊?yàn)楦拭C省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)某羊場(chǎng)的健康羔羊。羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗由山東華宏生物工程有限公司和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所協(xié)作生產(chǎn)。

1.3 場(chǎng)所與儀器設(shè)備

試驗(yàn)場(chǎng)所設(shè)在甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物房。儀器設(shè)備由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.4 藥品與試劑

NaCl、CaCl2、KCl、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、葡萄糖、酚紅、NaHCO3等購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。Hanks原液及應(yīng)用液、1%酚紅、7.5% NaHCO3等按常規(guī)配制。

2 試驗(yàn)方法

2.1 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒預(yù)試驗(yàn)

選擇6月齡左右的健康綿羊25只，隨機(jī)分為5組，每組5只。每組羔羊分別用10 mg/ml、10 mg/ml×3.2-1、10 mg/ml×3.2-2、10 mg/ml×3.2-3、10 mg/ml×3.2-4的HCE強(qiáng)毒進(jìn)行口腔下唇黏膜劃痕攻毒0.2 ml，觀察8 d并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒試驗(yàn)

選擇6月齡左右的健康綿羊16只，隨機(jī)分成3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組共4組，每組4只。3個(gè)試驗(yàn)組分別以正常劑量疫苗組、5倍稀釋疫苗組和25倍稀釋疫苗組進(jìn)行口腔黏膜劃痕接種0.2 ml，觀察21 d[4]。試驗(yàn)組羊免疫試驗(yàn)21 d后，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組羊只用100 ID80HCE強(qiáng)毒口腔黏膜劃痕攻擊，觀察10 d并記錄試驗(yàn)結(jié)果[5]。

3 結(jié)果與討論

3.1 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，ID100為第四組，ID60為第五組。根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）和免疫學(xué)原理，選擇100 ID60/0.2 ml為攻毒劑量[6]。

表1 免疫攻毒預(yù)試驗(yàn)效果

3.2 羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，相對(duì)于對(duì)照組而言，3個(gè)試驗(yàn)組均對(duì)羊體有不同程度的保護(hù)作用，正常劑量疫苗組對(duì)羊體的保護(hù)作用達(dá)到100%，故這批ORF弱毒疫苗達(dá)到了《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定。

表2 疫苗的免疫攻毒試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3.3 討論

羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒試驗(yàn)是ORF疫苗生產(chǎn)過程中疫苗成品效價(jià)測(cè)定的重要組成部分，也是控制疫苗生產(chǎn)質(zhì)量的重要手段之一[7]。羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗成品的免疫攻毒試驗(yàn)的準(zhǔn)確性是決定疫苗質(zhì)量的重要因素。由于羊接觸傳染性膿皰性皮炎的局部細(xì)胞免疫學(xué)的特點(diǎn)（大部分動(dòng)物疾病以體液免疫為主，但有的疾病以細(xì)胞免疫為主，即以體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞介質(zhì)抗病，ORF是以細(xì)胞免疫為主的疾病，且僅感染動(dòng)物皮膚黏膜，故具局部細(xì)胞免疫學(xué)的特點(diǎn)），羊接觸傳染性膿皰性皮炎弱毒疫苗免疫過程中，免疫羊的血清抗體不易檢測(cè)，所以免疫攻毒試驗(yàn)是檢驗(yàn)疫苗免疫原理的可靠手段[8]。本試驗(yàn)選擇100 ID60/0.2 ml為攻毒劑量，使免疫攻毒試驗(yàn)的結(jié)果更加可靠。考慮到動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)的個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響比較大，故在本試驗(yàn)中增加了2個(gè)試驗(yàn)組，提高了免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。