在多細胞生物中，細胞間通訊是維持細胞功能和組織穩(wěn)態(tài)所必需的。這種細胞間的溝通可通過細胞間的直接聯(lián)系來實現(xiàn)，也可通過分泌介質(zhì)來傳遞。其中細胞釋放各種類型的囊泡，如外泌體、核內(nèi)體、微囊泡等可攜帶DNA、RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在細胞通訊中起到關(guān)鍵作用，外泌體為近年生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點

。外泌體是一類由細胞分泌的直徑約30～150 nm，密度為1.13～1.19 g/mL的納米級球形脂質(zhì)雙分子層囊泡

。雖然外泌體這一名詞已得到普遍使用，但根據(jù)國際細胞外囊泡學(xué)會（International Society for Extracellular Vesi?cles，ISEV）2018 年指南，由于外泌體分離存在困難，因此將普遍提取的外泌體學(xué)術(shù)詞匯定義為“細胞外小泡（small extracellular vesicles，sEVs）”

。目前外泌體提取已存在的技術(shù)主要是基于體積和密度差異的原理，這些分離技術(shù)大多不能完全分離及純化出外泌體。

不同細胞來源的外泌體其內(nèi)容物和功能具有特異性，研究發(fā)現(xiàn)不同細胞來源外泌體可根據(jù)其性能分別用于疾病的診斷、藥物的傳輸以及免疫治療和再生藥物等。雖然外泌體的商業(yè)價值已得到廣泛的關(guān)注，但其臨床研究并不樂觀，主要原因在于：①目前尚未研發(fā)出外泌體大規(guī)模生產(chǎn)純化的技術(shù)

；②目前國際上尚未制定出外泌體商品化臨床生產(chǎn)準則

。因此，本文將綜合分析已存在的外泌體分離技術(shù)，比較不同分離技術(shù)的優(yōu)缺點，對目前提出的外泌體提取規(guī)范原則進行論述，并闡明不同細胞來源外泌體的功能及作用，闡述牙源性間充質(zhì)干細胞來源外泌體的應(yīng)用前景，為未來外泌體的提取及使用提供參考和建議。

1 外泌體的形成途徑

所有細胞均可在生理或病理情況下釋放外泌體，最開始外泌體被認為是細胞廢棄物，后來通過研究逐漸發(fā)現(xiàn)外泌體中含有生物活性分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、miRNAs 等，在機體生理和病理過程中扮演著重要角色。它的形成過程主要是由細胞膜內(nèi)陷形成最初的核內(nèi)體，胞內(nèi)生物活性物質(zhì)在早期核內(nèi)體中積累，并在內(nèi)吞分選機制下分選及運輸所需的復(fù)合物和其他相關(guān)蛋白質(zhì)形成晚期核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體再次通過向內(nèi)出芽形成多囊泡，最后多囊泡與細胞膜融合釋放至胞外形成外泌體

。外泌體的產(chǎn)生機制主要通過以下途徑：①Rab 蛋白（小G 蛋白）通過核內(nèi)體和質(zhì)膜調(diào)控外泌體的生物發(fā)生；Rab 蛋白決定細胞器膜的特性，招募機械效應(yīng)因子，并介導(dǎo)細胞器動力學(xué)。Os?trowski 等

發(fā)現(xiàn)Rab27a、Rab27b 參與了多囊泡的生物發(fā)生和定位，其中Rab27a 通過調(diào)控質(zhì)膜PIP2（水通道蛋白）動態(tài)來組裝質(zhì)膜微域，參與質(zhì)膜囊泡出芽。Rab35 可定位于質(zhì)膜，調(diào)節(jié)質(zhì)膜PIP2 水平，參與外泌體的發(fā)生。Rab11 則是通過鈣誘導(dǎo)與多囊泡融合來影響外泌體的生物發(fā)生。②Ral/Arf6/PLD2/syntenin/Alix 軸（小GTP 酶/二磷酸腺苷核糖基化因子6/磷脂酶D2/胞內(nèi)銜接蛋白/凋亡連接基因?2?相互作用蛋白X）調(diào)控外泌體的生物發(fā)生；Ral 蛋白可調(diào)控二磷酸腺苷核糖基化因子6（ADP?ribosylation factor6，Arf6）和磷脂酶D2（phos?pholipase D2，PLD2）的分泌，Arf6 和PLD2 可使外泌體分泌syntenin 和Alix，幫助外泌體的膜形成

。③內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體（endosomal sorting com?plex required for transport，ESCRT）途徑形成外泌體；ESCRT 可參與多囊泡的形成、核包裹、質(zhì)膜修復(fù)，促進囊泡移動以及出芽。ESCRT 主要是催化膜分裂完成這一進程。因此，ESCRT 被大部分學(xué)者認為是外泌體的依賴途徑，但是這一觀點尚缺乏足夠的數(shù)據(jù)支持。該途徑始于合成素?合成聚糖的相互作用，早期核內(nèi)體在內(nèi)吞作用的控制下分選復(fù)合物以及相關(guān)蛋白，通過Arf6 與細胞程序性死亡蛋白1 配體2（programmed cell death1 ligand 2，PDL2）作用進入胞質(zhì)內(nèi)形成晚期核內(nèi)體，進而向腔內(nèi)出芽形成腔內(nèi)囊泡，多個腔內(nèi)囊泡形成了多囊泡內(nèi)體，這一過程中胞內(nèi)的肝細胞生長因子相關(guān)酪氨酸激酶（hepatocyte growth factor associated tyro?sine kinase，Hrs）可與腫瘤易感基因101（tumor sus?ceptibility gene 101，TSG101）作用降低胞內(nèi)囊泡的數(shù)量，而泛素樣蛋白15 可抑制TSG101 的泛素化，增加外泌體的釋放

。④自噬參與外泌體的分泌；研究發(fā)現(xiàn)在癌癥細胞中敲除自噬相關(guān)蛋白5（au?tophagy related gene 5，Atg5），外泌體的產(chǎn)生減少；相反，當CRISPR/cas9（可有效編輯有機體內(nèi)部分基因的CRISPR 基因組）介導(dǎo)敲除的Atg5 神經(jīng)元細胞，發(fā)現(xiàn)可以增加外泌體的釋放

。

隨著醫(yī)保改革的逐漸深入，醫(yī)院的醫(yī)?；颊弑壤饾u增大，醫(yī)院對醫(yī)保費用的合理控制直接關(guān)系到醫(yī)院未來的發(fā)展，同時也影響廣大參?；颊叩臋?quán)益。國務(wù)院辦公廳發(fā)布的《城市公立醫(yī)院綜合改革試點的指導(dǎo)意見》中明確指出公立醫(yī)院要“降低藥品和醫(yī)用耗材費用……嚴格控制醫(yī)藥費用的不合理增長”。在當前的醫(yī)改環(huán)境下，醫(yī)院應(yīng)在提高醫(yī)療服務(wù)技術(shù)和質(zhì)量的同時，加強精細化管理，提高工作效率，節(jié)約運營成本，合理控制藥品和耗材費用。

2017年，我國甘薯總產(chǎn)量7 057.1萬t,按照55%的加工比例和20%的產(chǎn)品原料比,當年我國甘薯加工品產(chǎn)量約為780萬t．戴起偉等[5]估算結(jié)果顯示,當前我國國內(nèi)甘薯加工產(chǎn)品消費量約在500萬t以上,因此，粗略估算,我國甘薯加工品的年出口水平應(yīng)在200～280萬t之間．

2 外泌體分離技術(shù)

為使標準化胞外囊泡提取技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床研究，2018 年11 月國際胞外囊泡協(xié)會在中國廣州發(fā)起了以胞外囊泡為基礎(chǔ)的臨床研討會。眾多專家學(xué)者就4 個關(guān)鍵主題進行了討論：①胞外囊泡的標準化分離及提取技術(shù)；②胞外囊泡組學(xué)分析及生物標記物的探索；③胞外囊泡生物標記物在臨床診斷的應(yīng)用；④胞外囊泡在人類疾病中的治療。就“胞外囊泡的標準化分離及提取技術(shù)”這一專題，學(xué)者們討論了最前沿的外泌體快速分離技術(shù)如目前發(fā)展較快的芯片技術(shù)，另外多種分離技術(shù)結(jié)合的方式也可精確有效地提取外泌體。目前沒有單一的方法可以用于所有樣本類型和應(yīng)用的分析。對于不同樣本中外泌體的提取，參會學(xué)者們認為需要考慮但不限于以下因素：樣品的來源、胞外囊泡的亞群、用于下游的分析；對于外泌體純度的考量，定量方法的比值可以提高外泌體純度測定，可作為外泌體的純度指標，比如：蛋白質(zhì)/顆粒比、蛋白質(zhì)/脂質(zhì)比、RNA/顆粒比

。因此，雖然外泌體的提取技術(shù)趨于規(guī)范和標準，外泌體采集與分離標準的建立、鑒定標準的統(tǒng)一、產(chǎn)品制備過程標準化仍是未來需進一步明確和解決的問題。

2.1 基于密度的分離方法—差速離心技術(shù)、等密度梯度離心技術(shù)

2.1.2 等密度梯度離心技術(shù) 等密度梯度離心技術(shù)是根據(jù)細胞外成分的密度不同分離出外泌體，不同密度的蔗糖或碘克沙醇為密度梯度管中的介質(zhì)成分，其使用率達11.6%

。在離心力的作用下，樣品中的外泌體、凋亡小體以及蛋白聚合物會固定在相同密度介質(zhì)中從而分離外泌體，外泌體一般聚集在1.10～1.18 g/mL 密度層

。雖然這種方法可以分離不同密度的胞外成分以及外泌體亞群，但對于不同大小、相同密度的胞外物質(zhì)如微囊泡分離存在困難，動區(qū)密度梯度離心（moving?zone density?gradient centrifugation）是目前改良的一種分離技術(shù)，可在密度和大小二維方向上更進一步提純外泌體。雖然該方法提取的外泌體純度高，但其容納的樣本有限，設(shè)備貴，且需要高資質(zhì)的技術(shù)人員

。

2.1.1 差速離心技術(shù) 差速離心技術(shù)是目前分離外泌體使用最多的提取方法，其使用率高達45.7%

。差速離心技術(shù)的原理是根據(jù)樣品中胞外囊泡密度和尺寸大小的不同，在不同離心力作用下分離出外泌體。差速離心技術(shù)含量低，不需要繁雜的預(yù)處理，這一提取技術(shù)可廣泛提取細胞上清、血清、唾液、尿液以及腦脊液等來源的外泌體樣本。然而，差速離心技術(shù)可使具有相同質(zhì)量、密度及大小的外泌體、微囊泡以及蛋白、脂質(zhì)體等沉積在一起，難以獲取完全純化的外泌體。此外，由于差速離心技術(shù)需使用大的離心力，對外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)會造成一定程度的損傷

。

2.2 基于尺寸的分離方法—尺寸排阻色譜技術(shù)和超濾技術(shù)

2.2.1 尺寸排阻色譜技術(shù) 尺寸排阻色譜（size ex?clusion chromatography，SEC）技術(shù)是通過特定材料的孔隙微粒分離含有不同分子量的溶液，現(xiàn)使用的固相多孔隙材料主要有高分子右旋糖苷、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等

。尺寸排阻色譜技術(shù)最大的特點是可以保護外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和完整性不受破壞，其次該方法操作簡單，節(jié)約時間，調(diào)整孔隙大小可以得到不同的胞外囊泡亞群

。近期iZON 公司研發(fā)出基于尺寸排阻色譜技術(shù)的自動外泌體分離系統(tǒng)，可對外泌體進行高效、自動化提取

。尺寸排阻色譜技術(shù)也存在一些缺點，如分離的外泌體中含有與其徑粒相似的蛋白質(zhì)聚合物和脂質(zhì)體。在2013 年國際細胞外囊泡學(xué)會上，學(xué)者提議將超濾技術(shù)和尺寸排阻色譜技術(shù)結(jié)合，可提高外泌體的提取純度

。

4.1.1 間充質(zhì)干細胞來源外泌體修復(fù)損傷組織間充質(zhì)干細胞來源于中胚層的多種組織，包括骨髓、肝臟、脾臟、外周血、脂肪、胚胎和臍帶血，具有自我更新和分化的能力。近年來間充質(zhì)干細胞多用于組織再生、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護的研究，大量研究發(fā)現(xiàn)使用間充質(zhì)干細胞研究時，只有小部分細胞可作用于損傷部位，因此，“細胞代替治療”應(yīng)運而生，其中，間充質(zhì)干細胞旁分泌外泌體是當前研究的熱點

。Haga 等

將間充質(zhì)干細胞來源外泌體作用于由D?半乳甘糖（D? Galactose）/腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）誘導(dǎo)的致死性極強的肝損傷小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其中含有短非編碼RNA Y?RNA?1，可緩解肝臟損傷，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，激活抗凋亡通路。Zhang 等

研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理心臟干細胞來源外泌體，將其移植入心肌梗死的大鼠中，可發(fā)現(xiàn)其可降低心臟纖維化，增加毛細血管密度，恢復(fù)心臟的功能。Xiong 等

研究表明，脂肪干細胞來源外泌體中含有細胞外煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl trans?ferasee，NAMPT）可延緩衰老，這種物質(zhì)可以內(nèi)化入細胞中，從而增加NAD

的合成，當從年輕的小鼠中提取富含eNAMPT 的胞外囊泡，并作用于年老小鼠中，發(fā)現(xiàn)可以衰老減緩，并增加了年老小鼠的生命周期。

2.3 基于聚合物共沉淀的分離方法—聚合物共沉淀試劑盒技術(shù)

聚合物共沉淀技術(shù)的原理是親水性聚合物與樣品中外泌體親水鍵相互作用，在外泌體周圍形成疏水微環(huán)境，從而形成沉淀提取出外泌體?，F(xiàn)常用的外泌體試劑盒中使用的親水性聚合物大多是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）

。聚合物共沉淀技術(shù)簡單易行，可用于大規(guī)模提取外泌體以及疾病的快速診斷

。然而，該技術(shù)使用的親水性聚合物不僅可以使外泌體發(fā)生沉淀，還可使親水性物質(zhì)如核酸、脂蛋白或者一些病毒的沉積。Patel 等

研究發(fā)現(xiàn)，相比于其它方法提取的外泌體，通過聚合物共沉淀技術(shù)提取的外泌體更具有細胞毒性。目前，聚合物共沉淀技術(shù)使用了更具有疏水性的PEG 聚合物和更具有親水性的右旋糖苷聚合物形成雙向系統(tǒng)（aqueous two?phase systems，ATPSs），對外泌體及其它分子進行雙向分離，從而在一定程度上改善外泌體污染的問題

。

2.4 基于免疫親和的分離方法—磁珠技術(shù)、色譜固相分離技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附分離技術(shù)

外泌體中含有豐富的特異性膜蛋白如四次跨膜蛋白CD9、上皮細胞黏附分子（epithelial cell ad?hesion molecule，EPCAM）、四次跨膜蛋白63（CD63）、小G 蛋白（Rab5）、四次跨膜蛋白81（CD81）、凋亡連接基因?2?相互作用蛋白X（apoptosis linked gene 2 interacting protein X，ALIX）、磷酯結(jié)合蛋白（An?nexin）等

。免疫親和技術(shù)的原理則是通過識別外泌體的特異性蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)外泌體的分離和富集。根據(jù)抗體底物載體的不同，免疫親和分離技術(shù)可分為磁珠免疫分離、色譜固相分離、酶聯(lián)免疫吸附分離等。在磁珠免疫分離法中，磁珠負載鏈霉親和素，對生物素化的抗體如CD63、CD9 和CD81 具有捕獲能力。雖然免疫親和技術(shù)可提取高純度的外泌體，但該技術(shù)緩沖液中的pH 和鹽濃度會影響外泌體的活性。此外，與抗體結(jié)合后的外泌體只適用于疾病的診斷，并不適用功能性研究

。因此，有學(xué)者提出適配體篩選技術(shù)，適配體是具有抗體功能的小DNA 或RNA，可識別特異性蛋白質(zhì)，從而與外泌體結(jié)合，進行生物樣品中外泌體的分離，再通過改變適配體的三維結(jié)構(gòu)，可對分離的外泌體進行純化，保證外泌體的完整性

。

2.5 基于微流控技術(shù)的分離方法—基于免疫親和的微流體技術(shù)、基于尺寸的微流體技術(shù)、無接觸式微流體技術(shù)

微流控是近年發(fā)展起來的以信號探測為基礎(chǔ)的外泌體提取技術(shù)，可快速對外泌體進行分離，還可以通過實時監(jiān)測外泌體，對早期未侵襲性疾病作出診斷。基于免疫親和的微流體技術(shù)與免疫親和技術(shù)相似，其在微流體芯片裝置中裝有特異性識別抗體，免疫親和微流技術(shù)與免疫親和技術(shù)一樣只能獲取外泌的特異性子集，且價格昂貴，難以維持外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)。

毛主席1936年在保安對斯諾說：“這是我們唯一的外債，是紅軍拿了藏民的糧食而欠的債，有一天我們必須向藏民償還我們不得不從他們那里拿走的給養(yǎng)?！雹堋都t星照耀中國》159頁和《長征——前所未有的故事》308頁。鄧小平同志在1952年7月21日西南軍政委員會第一次全體會議上說：“紅軍北上，在那里（川西北兄弟民族地區(qū)）是把他們（當?shù)乩习傩眨└憧嗔耍@在當時是為保存紅軍，沒有辦法，把他們的糧食吃光了，他們吃了很大的虧，要在具體利益上向他們賠償，真正要從經(jīng)濟上幫助他們得到利益。”⑤《血對西藏說》第31頁——32頁。

另外，外泌體的臨床轉(zhuǎn)化也需其在同種異體環(huán)境中具有可重復(fù)性、可拓展性、穩(wěn)定性和良好的臨床監(jiān)控性能。Melo 等

通過免疫親和分離技術(shù)從胰腺癌患者的血清中提取外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體可高表達蛋白多糖和磷脂酰肌醇聚糖1（glypican1，GPC1），GPC1 陽性可區(qū)分胰腺癌患者及正?；颊摺Ｈ欢?，Lai 等

學(xué)者則通過色譜固相分離技術(shù)提取外泌體，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌患者的循環(huán)外泌體中，其中微小RNA miR?10b、miR?21、miR?30c 和miR?181a 的高表達以及miR?let7a 的低表達更具有診斷價值。這兩份科學(xué)研究的不同主要在于外泌體提取方式的差異。因此對于同一疾病統(tǒng)一的外泌體提取純化標準尤為重要。

基于尺寸的微流體技術(shù)結(jié)合了尺寸排阻色譜技術(shù)及免疫親和技術(shù)的原理，其裝置由多孔硅材料制成的納米線組成，可阻止細胞碎片和凋亡小體，同時裝置中存在特異性的抗體，可有效分離40～100 nm 的外泌體

。無接觸式微流體包含彈性升力

、超聲

及雙向電泳

三種分離方式。彈性升力利用粘彈性介質(zhì)流動所產(chǎn)生的升力可操控不同大小粒子的原理來分離腫瘤細胞、血細胞、細菌、飛沫或微球。2017 年這一技術(shù)用于分離外泌體，其外泌體回收率超過80%，純度超過90%

。超聲微流體技術(shù)是利用超聲波對不同粒子的輻射力分離外泌體，能夠以無標記和無接觸的方式從全血中直接分離外泌體，血細胞去除率超過99.999%

。雙向電泳技術(shù)是一種比較簡單的微流體技術(shù)，微通道的電泳可驅(qū)動樣品中的外泌體通過微流體膜裝置，并過濾其它細胞外囊泡，然而這種技術(shù)還需深入地探索其效率和可靠性，以及提取出的外泌體生物學(xué)性能

。

3 外泌體提取技術(shù)標準化進展

縱觀目前已存在的外泌體提取技術(shù)，主要是基于體積和密度差異的原理來獲取純度較高的外泌體，這一技術(shù)主要體現(xiàn)在臨床前基礎(chǔ)研究中。外泌體的臨床轉(zhuǎn)化勢必需要實現(xiàn)從科學(xué)實驗到商業(yè)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化，這一目標的實現(xiàn)主要需從細胞培養(yǎng)、外泌體提取和外泌體純化三個方面進行思考和研究。攪拌式生物反應(yīng)器技術(shù)、灌注培養(yǎng)技術(shù)和中空纖維灌注生物反應(yīng)器技術(shù)可實現(xiàn)外泌體的大批量生產(chǎn)；合適的培養(yǎng)條件如生長因子、氧氣濃度或其他刺激物影響的研究可探索出高產(chǎn)外泌體的方法。目前，流場流分離和多角度動態(tài)光散射是外泌體商業(yè)化生產(chǎn)和純化常用的方法，可精確地測定粒徑分布和顆粒在溶液中的濃度，分離出的微?？梢宰詣佑脴藴署s分收集器收集。

在進行評價時，既要求教師對學(xué)生所講述的時事新聞有全面的了解，掌握最新動態(tài)，又要求教師能夠客觀準確地進行分析評價，能夠?qū)W(xué)生進行有效的引導(dǎo)。開展時事新聞評論活動，要求教師平時要關(guān)注國內(nèi)外新聞、關(guān)注社會熱點問題，深入思考，這樣教師在回答學(xué)生的疑問時才能做到游刃有余。“教與學(xué)最本質(zhì)的、最有決定意義的關(guān)系是相長，即相互促進?！盵3]時事新聞評論是促進教學(xué)相長的助推器。這一教學(xué)環(huán)節(jié)使得課堂教學(xué)雙向互動過程更加積極有效。學(xué)生能夠參與到課堂教學(xué)中來，能夠分享所見、所感、所思，使學(xué)生從被動接受轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃訁⑴c，不僅提升了學(xué)生的知識水平，而且鍛煉了他們的語言表達能力和組織協(xié)調(diào)能力。

單一的分離技術(shù)并不適用于各種來源的外泌體，因此研發(fā)多種不同分離技術(shù)對有效提取不同生理性能的外泌體尤為重要

。目前，已存在的外泌體分離技術(shù)包括差速離心技術(shù)、等密度梯度離心技術(shù)、尺寸排阻色譜技術(shù)、超濾技術(shù)、超速離心技術(shù)、聚合物共沉淀技術(shù)、免疫親和技術(shù)、微流控技術(shù)。不同分離技術(shù)的原理及優(yōu)缺點見表1。

外泌體幾乎存在于人體內(nèi)的所有細胞中，它們既有共性又有區(qū)別，不同細胞來源的外泌體其在生理病理過程的不同階段具有不同的功能。間充質(zhì)干細胞來源外泌體在非腫瘤環(huán)境下具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及促進組織器官修復(fù)等功能，免疫細胞來源的外泌體可促進體內(nèi)免疫細胞的增殖，從而緩解炎癥或腫瘤的侵襲，而腫瘤來源的外泌體可作用于微環(huán)境，形成一個有利于腫瘤發(fā)生的微環(huán)境

。因此，了解不同細胞來源外泌體的應(yīng)用范圍和功能對科學(xué)研究的進一步發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)化具有重要的指導(dǎo)意義（表2）。

4 外泌體的研究及應(yīng)用

利用篩選出的13對引物，對缺齒蓑蘚11個居群106份樣品進行PCR擴增，獲得了150個位點，其中148個為多態(tài)位點。11個居群的多態(tài)位點百分率為45.95% ～ 81.08%，其中最高的是浙江溫州烏巖嶺居群，最低的是浙江金華大盤山居群，物種總多態(tài)位點百分率為98.67%。

4.1 間充質(zhì)干細胞來源外泌體的研究進展

2.2.2 超濾技術(shù) 超濾技術(shù)使用超細納米復(fù)合膜對含有不同截流分子量（molecular weight cut?off，MWCO）的生物樣品進行分離，篩選出外泌體

。目前常用的有兩種簡易的超濾裝置，第一種裝置是串聯(lián)配置微孔過濾器

；第二種裝置是序列超濾過濾器

。超濾技術(shù)可顯著縮短操作時間，不需要特殊的設(shè)備，可通過調(diào)整超濾膜孔徑大小來尋找胞外囊泡的不同子集。然而，超濾膜易堵塞影響分離效率，傳統(tǒng)方法可通過蛋白酶清洗超濾膜解決濾膜堵塞的問題，現(xiàn)階段改進的切向流過濾技術(shù)是解決這一問題的理想方法。其次，與外泌體大小相近的納米粒子可以通過超濾膜是超濾技術(shù)的另一個缺陷，因此現(xiàn)在較為常規(guī)的使用是將超濾技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合

。

4.1.2 間充質(zhì)干細胞來源外泌體是理想的藥物載體 理想的藥物載體應(yīng)具有細胞靶向性、治療有效性及免疫耐受性?，F(xiàn)在常用的藥物載體是脂質(zhì)體，與較大的脂質(zhì)體相比，較小的脂質(zhì)體雖具有較長的體內(nèi)循環(huán)時間，但其藥物保留率和釋放能力會減弱，為了減少脂質(zhì)體在體內(nèi)的清除率和毒性，經(jīng)過改造后的脂質(zhì)體免疫耐受性降低。因此，脂質(zhì)體作為藥物載體存在局限性，外泌體就具備理想載體的條件：低毒性、免疫耐受、可進入血腦屏障，并可直接作用于炎癥或腫瘤組織。并且外泌體中具有功能性的生物成分可輔助靶向部位的治療，樹突狀細胞來源外泌體膜蛋白（lysosomeassoci?ated membrane glycoprotein 2b，Lamp2b）與神經(jīng)特異性RVG 肽融合進行改建，作為藥物靜脈注射入有阿茲海默癥的小鼠，發(fā)現(xiàn)可以靶向敲除β?分泌酶1（β?site APP cleaving enzyme 1，BACE1），改善阿茲海默癥相關(guān)癥狀

。

4.2 腫瘤細胞來源外泌體的研究進展

4.2.1 腫瘤細胞來源外泌體可促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移 腫瘤細胞來源外泌體其功能與正常細胞來源外泌體有較大差異。腫瘤細胞來源外泌體可通過自分泌和旁分泌途徑影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，慢性髓系白血病細胞來源外泌體中含有轉(zhuǎn)化生長因子?β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1），可與白血病細胞中的TGF?β1 受體結(jié)合，激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinas?es，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和抗凋亡通路從而促進腫瘤的生長

。腫瘤細胞來源外泌體還可作用于基底細胞，從而形成促癌的微環(huán)境，基底細胞來源外泌體可作用于腫瘤細胞，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲；乳腺癌來源外泌體可通過轉(zhuǎn)化生長因子?絲/蘇氨酸激酶受體（TGF?β/SMAD）途徑誘導(dǎo)脂肪干細胞向腫瘤相關(guān)肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化

。

4.2.2 腫瘤細胞來源外泌體可引起腫瘤的耐藥性 黑色素瘤和卵巢癌來源的外泌體可輔助細胞排出藥物毒性，從而產(chǎn)生藥物耐藥性；含有miR?30a、miR?222 和miR?100?5p 的外泌體可以誘使藥物敏感性細胞通過激活絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）或雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）對藥物產(chǎn)生耐受；基底細胞來源外泌體也可使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，巨噬細胞來源外泌體中含有miR?365，激活胞苷脫氨酶，減少胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性

。

4.2.3 腫瘤細胞來源外泌體具有激活免疫或抑制免疫系統(tǒng)的功能 研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源外泌體既有激活免疫系統(tǒng)的功能，又有抑制免疫系統(tǒng)的作用。免疫系統(tǒng)的激活通過外泌體的抗原呈遞作用，免疫抑制則通過外泌體所攜帶的配體，蛋白質(zhì)和miRNA 抑制T 細胞活性。腫瘤來源外泌體可將熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、主要組織相容性復(fù)合體?Ⅰ（major histocompatibility com?plex?Ⅰ，MHC?Ⅰ）傳輸至樹突狀細胞，誘導(dǎo)潛在的CD8

T 細胞發(fā)揮抗癌作用

。外泌體中所攜帶的抗原和MHC 為其作為抗癌疫苗的研發(fā)成為可能

。然而，腫瘤來源的外泌體可以表達TGF?β和自然殺傷細胞2 族成員D（natural killer cell family 2 member D，NKG2），從而下調(diào)NK 細胞和CD8

T 細胞表面NKG2D 的表達，降低其活性

。

汝城縣小型農(nóng)田水利重點縣建設(shè)項目于2011年通過全省公開競爭遴選，以建設(shè)方案第一名、綜合得分第二的好成績被列入全國第三批小型農(nóng)田水利重點縣。該項目計劃分3年實施，發(fā)展高效節(jié)水面積6萬畝（0.4萬hm2），建設(shè)范圍涉及汝城縣的土橋鎮(zhèn)、田莊鄉(xiāng)、附城鄉(xiāng)、三星鎮(zhèn)、大坪鎮(zhèn)、井坡鄉(xiāng)等6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)54個村。項目建成后，將明顯改善汝城人民的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件，進一步提高農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力，增強農(nóng)業(yè)抗御自然災(zāi)害能力。

第二，嚴肅黨內(nèi)政治生活，優(yōu)化黨內(nèi)政治生態(tài)。“嚴肅黨內(nèi)政治生活、凈化黨內(nèi)政治生態(tài)，是黨的建設(shè)中帶有根本性、基礎(chǔ)性的問題，關(guān)乎黨的團結(jié)統(tǒng)一，關(guān)乎黨的生死存亡。”[4]P37要不斷增強黨內(nèi)政治生活政治性、原則性、時代性、戰(zhàn)斗性，自覺抵制商品交換原則對黨內(nèi)平等同志關(guān)系與健康黨內(nèi)生活的侵蝕和污染，通過黨內(nèi)政治生態(tài)的不斷凈化和優(yōu)化來提高黨的凝聚力、創(chuàng)造力和戰(zhàn)斗力，通過匡正選人用人導(dǎo)向、淳化黨內(nèi)風(fēng)氣在全黨營造風(fēng)清氣正、干事創(chuàng)業(yè)、爭先創(chuàng)優(yōu)的大氛圍、大環(huán)境和大場勢，為推動全面從嚴治黨向縱深發(fā)展持續(xù)注入強大正能量。

4.2.4 腫瘤細胞來源外泌體可作為生物標記物外泌體來源于血液、尿液、唾液和腦脊液，它們可作為癌癥診斷中理想的生物標記物。腦脊液外泌體中高表達的miR?21 可作為惡性膠質(zhì)瘤發(fā)展的標記物，并可以預(yù)估腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移

。然而，在不同的研究課題組中外泌體的提取方法不盡相同，研究缺乏一個共性的指標，這些問題會影響臨床診斷和預(yù)后的準確性。

目前，IntelliScore 公司研發(fā)了ExoDx Prostate 試劑盒，通過從患者尿液中獲取外泌體進行檢測，并結(jié)合患者的家族史、種族、年齡、臨床指標和前列腺癌特異性抗原（prostatic specific antigen，PSA），發(fā)現(xiàn)尿液中提取的外泌體具有高度的前列腺癌診斷靈敏性，這一試劑盒已在臨床研究中得到廣泛應(yīng)用

。

5 牙源性間充質(zhì)干細胞來源外泌體的應(yīng)用前景

相比于干細胞，外泌體具有低毒性、低免疫原性、易存儲、安全性高、穩(wěn)定性強、無需考慮細胞活性、可穿透血腦屏障等優(yōu)勢。近年來，外泌體治療在再生醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物運輸、免疫治療等領(lǐng)域取得了巨大的進步，大量的文獻研究為其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。目前已有外泌體相關(guān)研究進入臨床試驗階段。截止2021 年12 月，世界范圍內(nèi)已有123 項正在招募的臨床研究，其中亞洲有27 項研究，中國有20 項研究（https://clinicaltrials.gov）（表3）。

不同細胞來源的外泌體其內(nèi)容物及功能不同，相同細胞不同培養(yǎng)基培養(yǎng)提取的外泌體也不相同，并且當細胞處于不同的條件及環(huán)境時，如細胞密度、細胞狀態(tài)、低氧培養(yǎng)、炎癥刺激、三維培養(yǎng)都會對外泌體造成極大的影響，因此，尋找一類合適的供體細胞是外泌體治療技術(shù)成功的關(guān)鍵。目前牙源性間充質(zhì)干細胞作為一類來源豐富、取材簡單、不會對人體造成二次傷害、不涉及倫理問題的新型間充質(zhì)干細胞已經(jīng)得到大量科學(xué)研究者的青睞。牙源性間充質(zhì)干細胞由頭顱神經(jīng)嵴細胞發(fā)育而來，具有獨特的組織特異性，其分泌的外泌體在神經(jīng)再生性疾病、牙髓牙本質(zhì)、皮膚再生、腫瘤治療、骨損傷修復(fù)等方面均已取得較好的療效。Li等

學(xué)者將牙髓干細胞來源外泌體通過鼠尾靜脈注射于腦缺血再灌注損傷的大鼠中發(fā)現(xiàn)其可抑制高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 pro?tein，HMGB1）/ Toll 樣 受 體4（Toll like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation fac?tor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor kappa?B，NF?κB）通路，達到抑制炎癥的效果，并對腦缺血再灌注損傷提供神經(jīng)保護。Ji 等

學(xué)者發(fā)現(xiàn)牙髓干細胞來源外泌體可以抑制CD4

T 細胞分化成Th17細胞，抑制IL?17 和TNF?α 的分泌，但其可以促進CD4

T 極化成Treg，增強了IL?17 和TNF?α 的分泌；Zhang 等

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)牙齦間充質(zhì)干細胞來源外泌體可促進舌乳頭的修復(fù)、味蕾再生和神經(jīng)支配，為舌癌患者術(shù)后重建提供了可能。Zhang 等

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)牙上皮細胞來源外泌體可被牙乳頭細胞內(nèi)吞，促進牙乳頭細胞增殖和成牙分化，從而誘導(dǎo)牙髓的再生。Liu 等

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，制備牙周膜干細胞來源外泌體的水凝膠系統(tǒng)，通過局部注射可以有效恢復(fù)牙周炎局部的骨再生。目前尚未有研究報道牙源性間充質(zhì)干細胞來源外泌體的副作用，也尚未有臨床招募相關(guān)項目。

因此，牙源性間充質(zhì)干細胞這些特性促使其具有作為提取外泌體供體細胞運用于未來臨床轉(zhuǎn)化研究中的巨大潛能，為未來各類疾病的治療提供全新的治療模式。

6 小 結(jié)

綜上所述，不同細胞來源的外泌體已廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、細胞信號通路、再生醫(yī)學(xué)、癌癥生物學(xué)、免疫學(xué)、藥物運輸?shù)妊芯款I(lǐng)域，為臨床轉(zhuǎn)化提供了大量的理論依據(jù)。表1 展示了近年來已存在的外泌體提取技術(shù)原理，并對比了每一項技術(shù)的優(yōu)缺點；表2 歸納了部分不同細胞來源外泌體的特征和作用；表3 列舉了部分國內(nèi)外正在招募的外泌體治療臨床研究項目。外泌體作為一種新的治療試劑，其功效已得到廣泛的認可和肯定

，合適的外泌體來源選擇和日益標準化的外泌體提取技術(shù)將有助于未來疾病治療的進步。

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