代真真 邢蘇 宋曉婉 歐金玉

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展以及收入水平的不斷提高，人們對(duì)于食品的消費(fèi)能力日漸提高，為了滿足人們多樣化的消費(fèi)需求，各種食品類型逐漸在市場(chǎng)中涌現(xiàn)出來。在這樣的背景下，對(duì)食品質(zhì)量安全進(jìn)行嚴(yán)格謹(jǐn)慎的監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。在信息化時(shí)代，越來越多先進(jìn)的食品安全檢測(cè)技術(shù)被大力研發(fā)和應(yīng)用，本文主要分析了PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用，以供實(shí)踐參考。

PCR技術(shù)是一種有效調(diào)查食品源疾病暴發(fā)以及對(duì)食品源相應(yīng)病原菌進(jìn)行鑒定的工具，在食品微生物檢測(cè)中有著非常廣泛的應(yīng)用，具有較高的靈敏度、極強(qiáng)的特異性、精準(zhǔn)快速等優(yōu)勢(shì)。因此，科學(xué)合理地推廣應(yīng)用PCR技術(shù)，對(duì)于做好食品檢測(cè)工作、預(yù)防食源性疾病以及評(píng)估食源性疾病的危險(xiǎn)性等都有著十分重要的意義。

一、PCR技術(shù)的原理及類型

1.原理。在食品微生物檢測(cè)過程中，PCR技術(shù)的主要原理是反復(fù)操作三個(gè)不同步驟的不同環(huán)節(jié)，包括高溫變性、中溫延伸、低溫退火等，以便對(duì)微生物核酸序列進(jìn)行有效的檢測(cè)，而在實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的目標(biāo)時(shí)則是在單個(gè)核酸分子序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)制來完成。具體來說，高溫變性是在94℃的高溫下，如果處于雙鏈狀態(tài)的食品微生物的DNA序列會(huì)發(fā)生變性現(xiàn)象，也可以順利解鏈，那么其存在形式就是雙鏈。中溫延伸是在72℃的情況下，將被測(cè)食品微生物的引物所發(fā)揮的引導(dǎo)延伸作用作為相應(yīng)的條件進(jìn)行復(fù)制，從而將微生物的DNA序列有效地檢測(cè)出來。低溫退火是在55℃以下，食品微生物在被檢測(cè)過程中有效融合了特異性引物以及單鏈狀態(tài)下的DNA。反復(fù)對(duì)以上三個(gè)步驟進(jìn)行操作，直到能夠?qū)⑽⑸锏腄NA序列檢測(cè)出來并且數(shù)量充足，這樣才能符合PCR技術(shù)的實(shí)際檢測(cè)要求。

2.類型。（1）常規(guī)PCR檢測(cè)。運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的食品微生物檢測(cè)時(shí)，需要利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化作用，獲得緩沖液與MgCl2溶液發(fā)生反應(yīng)后的混合物，擴(kuò)增被界定的DNA片段。（2）多重PCR檢測(cè)。與傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)原理相比，多重PCR的檢測(cè)原理并沒有什么不同，不過與各引物的模板存在著特異性互補(bǔ)，即將1對(duì)以上的特異性引物加入到同一反應(yīng)體系中，這樣就能實(shí)現(xiàn)同時(shí)將一條以上的目的DNA片段在同一個(gè)反應(yīng)管中擴(kuò)增。利用這樣的方法，能夠?qū)?個(gè)以上的基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)或者是確定其交叉限制。（3）熒光定量PCR檢測(cè)。在傳統(tǒng)的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀中應(yīng)用熒光能量傳遞技術(shù)，并促使受體發(fā)色團(tuán)偶極之間產(chǎn)生相互作用，這就是熒光定量。在利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過熒光訊號(hào)就能夠獲取靶序列的初始濃度，能量也會(huì)被快速轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，此時(shí)熒光訊號(hào)強(qiáng)度就能與DNA數(shù)量產(chǎn)生正比例關(guān)系，進(jìn)而達(dá)到定量的目的。

二、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測(cè)中的主要作用

PCR技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的簡稱，這是一種基因技術(shù)，在利用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行食品微生物檢測(cè)時(shí)，為了有效地獲得目標(biāo)DNA片段，需要采用體外模擬DNA的復(fù)制過程來實(shí)現(xiàn)，這樣有利于分析和判定實(shí)驗(yàn)對(duì)象的基因特征。在應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)際的食品微生物檢測(cè)時(shí)，可以有效地將食品檢測(cè)樣品中的各種微生物都進(jìn)行有效的基因標(biāo)記，并且能夠?qū)⑦@些基因都復(fù)制下來，從而在食品樣品較多的情況下也能利用較短的時(shí)間進(jìn)行有效檢測(cè)，這樣不但可以實(shí)現(xiàn)極高的自動(dòng)化檢測(cè)，而且操作非常簡單便捷，極大地提高了食品微生物檢測(cè)的效率和質(zhì)量。

三、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測(cè)中的主要流程

1.引物設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增的特異性能否成功與引物的優(yōu)劣有著直接的關(guān)系。近些年來，分子生物學(xué)的發(fā)展非常迅速，對(duì)于各種微生物基因的研究越來越深入，使得其基因序列也變得越來越明了，從而更容易進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。為了能夠確保引物設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性，還需要全面了解檢測(cè)對(duì)象的遺傳背景。

2.模板的制備。為了確保PCR檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性與可靠性，必須有效提高目標(biāo)模板的純度，確保目標(biāo)分子的數(shù)量充足，因此富集步驟是多數(shù)PCR檢測(cè)中都不可缺少的。

四、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測(cè)中的應(yīng)用特點(diǎn)

1.操作簡單。實(shí)際的食品微生物檢測(cè)工作會(huì)涉及到很多方面，比如微生物生長所必備的培養(yǎng)基、微生物生長環(huán)境中的溫度和酸堿度等，要根據(jù)微生物的類型以及實(shí)際的檢測(cè)需求設(shè)計(jì)不同的檢測(cè)方式，投入一定的檢測(cè)時(shí)間、檢驗(yàn)人員以及檢測(cè)中需要的物力資源，嚴(yán)格密切地觀察培養(yǎng)基中的菌落、微生物細(xì)胞等特征并鑒定其生理生化等。因此，在以往的食品微生物檢測(cè)中所使用的傳統(tǒng)自動(dòng)化技術(shù)不僅達(dá)不到檢測(cè)的高度，花費(fèi)的時(shí)間還比較長，使得檢測(cè)工作的效率非常低。而PCR技術(shù)這種高自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用剛好能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)的不足，不但操作非常簡單便捷，而且只需要一個(gè)檢測(cè)人員就能對(duì)所有檢測(cè)程序進(jìn)行有效控制，極大提高了檢測(cè)效率。

2.檢測(cè)快捷。應(yīng)用傳統(tǒng)的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行食品微生物檢測(cè)時(shí)，往往需要花費(fèi)2-5天的時(shí)間等待檢測(cè)結(jié)果，有些微生物的檢測(cè)甚至需要花費(fèi)一周或者更長的時(shí)間，這就可能導(dǎo)致一些食品在檢測(cè)過程中就已經(jīng)投入到市場(chǎng)。而有些食品則是在檢測(cè)中發(fā)生霉變，導(dǎo)致還未流入市場(chǎng)就已經(jīng)受到損壞，從而給生產(chǎn)企業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了高效地解決傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)存在的這些不足，就可以使用PCR技術(shù)對(duì)食品微生物進(jìn)行檢測(cè)。PCR技術(shù)是一種高自動(dòng)化的檢測(cè)技術(shù)，完全可以有效規(guī)避檢測(cè)時(shí)間比較長的問題，通常在很短的時(shí)間內(nèi)就能得到精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果，多數(shù)是幾個(gè)小時(shí)，有些微生物在檢測(cè)時(shí)花費(fèi)的時(shí)間較長，但也不會(huì)超過1天。

3.準(zhǔn)確率高。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，食品微生物種類越來越多，傳統(tǒng)的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)并不能高效地將微生物從食品中分離出來，更難以全面辨別食品微生物的種類。比如，傳統(tǒng)的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)很難將菌落檢測(cè)出來，即便檢測(cè)出來了，也難以進(jìn)行有效的培養(yǎng)，使得食品微生物檢測(cè)工作進(jìn)行得并不順利，效率也無法提高。應(yīng)用PCR技術(shù)，不僅能夠精準(zhǔn)地提取食品中的微生物，還能科學(xué)合理地進(jìn)行培養(yǎng)，既有利于微生物類型的判斷，又能夠使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，從而為食品生產(chǎn)監(jiān)督提供極大的便利和主要的參考依據(jù)，進(jìn)一步保障食品安全。

4.發(fā)展空間比較大。作為一種高自動(dòng)化技術(shù)，PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中有著巨大的優(yōu)勢(shì)，與傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)技術(shù)相比，PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍更廣，檢測(cè)所花費(fèi)的時(shí)間、人力、物力等相對(duì)較少，而且檢測(cè)質(zhì)量也比較高，潛在的發(fā)展空間巨大。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展以及高新技術(shù)的推廣與應(yīng)用，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，而且這項(xiàng)技術(shù)本身就具有較高的靈敏性與極強(qiáng)的特異性，在我國食品行業(yè)的生產(chǎn)管理中或者是食品流通過程中，PCR技術(shù)都能發(fā)揮出極大的作用。

五、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測(cè)中的注意事項(xiàng)

1.PCR模板的制備。各類食品中會(huì)存在非常多的PCR抑制因子，為了確保食品微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性，就要盡量除去這些抑制因子，這對(duì)于最終的檢測(cè)結(jié)果有著直接的影響。因此，在微生物的核酸提取時(shí)或是對(duì)食品樣品進(jìn)行處理時(shí)，都離不開模板的制備，特別是對(duì)食品樣品進(jìn)行處理時(shí)，更需要注重PCR模板的制備。

2.檢測(cè)對(duì)象的生物活性。在對(duì)食品微生物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，從理論上而言，只要是能夠提供核酸的樣品都可以實(shí)現(xiàn)PCR的擴(kuò)增，這主要是由于在檢測(cè)DNA時(shí)使用的細(xì)胞并不一定是活細(xì)胞，這也表明PCR技術(shù)并不能有效區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。

六、PCR技術(shù)的發(fā)展方向

在信息化的時(shí)代發(fā)展背景下，食品微生物檢測(cè)中所應(yīng)用的PCR技術(shù)愈發(fā)先進(jìn)，所發(fā)揮的作用也越來越大。未來，PCR技術(shù)的發(fā)展方向主要集中于以下三個(gè)方面：

1.DNA或者RNA模板的純度要求逐漸提高。在食品微生物檢測(cè)工作中，DNA或者RNA模板的純度對(duì)于PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有著直接的影響，所以要想提高PCR檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性，就需要提高模板的純度。

2.進(jìn)一步攻克PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的假陽性問題。食品中存在著種類眾多的微生物，而且這些微生物不具備穩(wěn)定性，所以在檢測(cè)過程中會(huì)受到PCR技術(shù)的高靈敏度影響而導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)。為了有效解決這一問題，未來應(yīng)把提高PCR檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性作為工作重點(diǎn)。

3.PCR技術(shù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字化PCR技術(shù)。在大數(shù)據(jù)時(shí)代，PCR技術(shù)在發(fā)展過程中也需要緊密結(jié)合數(shù)據(jù)技術(shù)，將芯片設(shè)計(jì)與制作作為重點(diǎn)，利用內(nèi)置芯片將PCR技術(shù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字化PCR技術(shù)。內(nèi)置芯片的應(yīng)用能夠進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)微滴式可智能識(shí)別的檢測(cè)技術(shù)目標(biāo)，極大地提高食品微生物檢測(cè)工作的效率和質(zhì)量，進(jìn)一步改善傳統(tǒng)PCR技術(shù)中的一些不足之處，全面突破傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中檢測(cè)結(jié)果所受到的限制，比如不再受標(biāo)準(zhǔn)溶液以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的局限，使得檢測(cè)結(jié)果更加精準(zhǔn)。在未來的發(fā)展中，數(shù)字化的PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用會(huì)有更加廣闊的發(fā)展前景。