尹曉新，馮海松，楊濤，朝浩

缺血性腦卒中是一類常見的缺血性腦血管病，具有較高的發(fā)病率、致殘率及致死率，且發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。缺血性腦卒中是由于局部腦組織缺血、缺氧造成的腦組織血液供應不足引起的腦細胞缺血或壞死，并引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[2]。氧化應激反應是缺血性腦卒中發(fā)生及發(fā)展過程中重要的發(fā)病機制，以往的研究表明，脂聯(lián)素在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[3-4]，本研究擬通過構建腦缺血損傷模型探究脂聯(lián)素在腦缺血損傷中的具體作用及機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)實驗動物：SPF級新生7日齡雄性SD大鼠60只由武漢科技大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK(新)2016-003，合格證號：SCXK(新)2016-0002。全部大鼠飼養(yǎng)在(22±2)℃的房間內(nèi)，相對濕度50%～65%。本實驗經(jīng)過武漢科技大學倫理委員會批準同意。(2)主要試劑：SIRT1抑制劑Sirtonol購自美國Selleck公司；氧化因子(ROS、MDA、SOD)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;蘇木素、伊紅購自武漢博士得生物有限公司;BCA蛋白定量及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；PGC-1α抗體購自美國Santa公司，SIRT1抗體購自美國CST公司。(3)主要儀器：切片機購自上海斯歐醫(yī)療器械有限公司；酶標儀購自美國Thermo公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司。

1.2 實驗方法 2019年10月—2020年12月于武漢科技大學動物實驗中心進行實驗。模型構建：60只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、脂聯(lián)素組、Sirtonol組及脂聯(lián)素+Sirtonol組，每組12只。模型制備方法參照文獻[5]，大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥麻醉，行頸正中切口分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)，結(jié)扎CCA近心端，ECA和 ICA近分叉處打活結(jié)，在CCA近分叉處剪一倒“V”型切口，插入線栓，于插入線栓處用備用線結(jié)扎(以不出血為度)，松開ICA處活結(jié)，緩慢推送線栓，線栓進入ICA后調(diào)整線栓頭端向內(nèi)向上，有阻力時停止推進，此時線栓頭端正好處于大腦中動脈(MCA)起始部，造成阻斷，缺血2 h后輕柔拔出線栓?？瞻讓φ战M分離右側(cè)頸總動脈但不插入線栓。脂聯(lián)素組造模后30 min在大鼠的側(cè)腦室注入APN(劑量為1 μg/g)。Sirtonol組及脂聯(lián)素+Sirtonol組在模型組及脂聯(lián)素組基礎上給予SIRT1抑制劑Sirtonol，同樣通過側(cè)腦室注入Sirtonol(濃度劑量為2 μl/100 g)。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 觀察大鼠腦組織損害程度：造模24 h后分離各組大鼠大腦組織，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，組織切片后行HE染色，顯微鏡下采集數(shù)據(jù)并拍照。

1.3.2 ELISA法檢測氧化因子水平：造模后24 h取大腦組織并提取蛋白質(zhì)，BCA定量法測定蛋白后備用。用蛋白裂解液將提取的蛋白稀釋至濃度為1 mg/ml的懸液，取50 μl懸液加入反應液，酶標儀定量檢測并讀取相應的吸光度值，并計算出各樣本的氧化因子ROS、MDA、SOD水平。

1.3.3 免疫印跡法檢測SIRT1及PGC-1α蛋白表達：造模后24 h取大腦組織，裂解組織后提取總蛋白。取等量的蛋白(20 μg)用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉后,在4℃與特定的抗體(包括SIRT1及PGC-1α)一起搖床孵育過夜;次日用TBST將膜洗滌3次，并用對應的二抗孵育1 h，用TBST洗滌3次后配制ECL發(fā)光反應液，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察蛋白的表達情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織損害程度比較 與空白對照組比較，模型組腦組織損傷嚴重，神經(jīng)元細胞排列散亂，間質(zhì)有明顯水腫，胞質(zhì)中有空泡形成，細胞核固縮或溶解消失；與模型組比較，脂聯(lián)素組腦組織損傷程度明顯減輕，神經(jīng)元細胞形態(tài)較規(guī)則，排列較有序，僅為輕度缺血，見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織細胞病理變化比較(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠腦組織氧化應激指標比較 與空白對照組比較，模型組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.01)；與模型組比較，脂聯(lián)素組大鼠氧化因子ROS、SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織氧化應激指標比較

2.3 各組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α蛋白表達比較 與空白對照組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達減少(t/P=22.764/<0.001、28.645/<0.001)；與模型組比較，脂聯(lián)素組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達均顯著增加(t/P=20.089/<0.001、27.937/<0.001)，見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α蛋白表達的比較

2.4 脂聯(lián)素通過SIRT1/PGC-1α信號通路發(fā)揮作用 為進一步確認脂聯(lián)素是否通過SIRT1/PGC-1α信號通路發(fā)揮抗氧化作用,添加SIRT1抑制劑Sirtonol檢測相關氧化因子的表達。與模型組比較，Sirtonol組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.01)；與脂聯(lián)素組比較，脂聯(lián)素+Sirtonol組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織氧化應激指標比較

3 討 論

缺血性腦卒中是由于腦動脈狹窄或阻塞導致供血腦組織缺血壞死引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的一類腦血管疾病。在缺血過程中各種病理機制相互關聯(lián)、彼此交錯，氧化應激損傷貫穿于整個過程[6]。腦組織缺血損傷后過量的氧自由基不能被清除，氧化還原的動態(tài)平衡被打破[7]。因此采取及時有效的措施阻止氧化應激反應的發(fā)生成為治療缺血性腦卒中的關鍵。本研究通過線栓栓塞頸動脈方法構建了缺血性腦卒中模型，探討了脂聯(lián)素在腦缺血損傷中的作用并初步探討其作用機制。

脂聯(lián)素是由脂肪細胞分泌的一種激素蛋白，是脂肪組織中表達最豐富的基因[8]。已有研究表明，脂聯(lián)素能夠提高外周組織對胰島素的敏感性，具有抗動脈粥樣硬化及抗糖尿病的作用。此外有很多證據(jù)表明，脂聯(lián)素在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[3-4]。由于脂聯(lián)素的分子量大很難通過血腦屏障，即使通過了血腦屏障在腦組織中的濃度也很低，很難發(fā)揮作用[9]。本研究擬通過側(cè)腦室注射脂聯(lián)素的方式探討脂聯(lián)素在腦缺血損傷中的作用，結(jié)果顯示，與模型組比較，脂聯(lián)素組腦細胞排列較均勻，壞死腦細胞較前減少，提示脂聯(lián)素具有減輕缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷程度的作用。脂聯(lián)素除了具有胰島素增敏、抗炎、抗凋亡作用外，還能通過抑制氧化應激誘導的自噬相關通路提高心肌的抗氧化損傷，提高線粒體的生物合成功能，改善高糖高脂誘導的氧化應激損傷[10-13]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低，而在給予脂聯(lián)素干預后氧化因子ROS、SOD水平降低，MDA水平升高，可知脂聯(lián)素具有抗氧化應激損傷作用。缺血性腦卒中組織產(chǎn)生ROS的能力增加而清除ROS的能力下降，組織中這種動態(tài)平衡被打破導致大量的ROS在組織內(nèi)蓄積，最終導致細胞的氧化應激損傷[14-16]。MDA是自由基作用下脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其水平反映了脂質(zhì)過氧化及細胞的損傷程度[17-18]。SOD是一種內(nèi)源性的抗氧化酶，可對抗氧自由基對細胞的損傷，是評價氧化應激損傷的另一重要指標。有研究顯示，脂聯(lián)素多肽能夠減輕谷氨酸鹽處理的HT22細胞的氧化應激損傷[19]，這與本研究結(jié)果相符，表明脂聯(lián)素具有抗氧化應激損傷的作用。

此外，本研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達減少，而在給予脂聯(lián)素干預后大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達增加，表明脂聯(lián)素在缺血性腦卒中大鼠腦組織中有助于上調(diào)SIRT1及PGC-1α的蛋白表達。SIRT1屬于sirtuin家族，是一種依賴于煙酰胺去嘌呤二核苷酸的去乙?；福谛?、腦等組織中表達增加，因其在氧化應激方面的作用而受到廣泛關注[20]。miR-29c通過調(diào)控SIRT1表達影響動脈粥樣硬化進程中的氧化應激反應[21]；SIRT1還能通過影響ROS的產(chǎn)生及抗氧化酶的活性從而調(diào)節(jié)阿爾茨海默病的大腦應激損傷[22]。PGC-1α是SIRT1的下游蛋白，通過增強線粒體的生物合成功能增加組織的氧化代謝。在缺血性腦卒中發(fā)生后SIRT1及PGC-1α的蛋白表達水平減少，提示腦組織中氧化及抗氧化功能失衡，從而導致ROS、SOD水平升高，MDA水平降低，進而引發(fā)腦組織的功能障礙[1]。因此缺血性腦卒中通過增加SIRT1/PGC-1α表達進而影響ROS、SOD及MDA的活性，增強腦組織的抗氧化能力，減輕氧化應激引起的腦組織損傷。本研究為了進一步確認脂聯(lián)素是否通過SIRT1/PGC-1α信號通路發(fā)揮抗氧化作用,為此添加SIRT1抑制劑Sirtonol檢測相關氧化因子的表達。與脂聯(lián)素組比較，脂聯(lián)素+Sirtonol組阻斷了脂聯(lián)素對腦組織的抗氧化作用。這些研究結(jié)果提示，脂聯(lián)素通過調(diào)節(jié)SIRT1/PGC-1α蛋白表達影響氧化因子水平進而發(fā)揮抗氧化應激損傷的作用。

綜上所述，脂聯(lián)素減輕缺血性腦卒中大鼠的氧化應激損傷主要是通過調(diào)節(jié)SIRT1及PGC-1α的蛋白表達來實現(xiàn)的，為臨床治療缺血性腦卒中患者氧化應激損傷提供了理論支持，但脂聯(lián)素不能通過血腦屏障限制其在臨床的進一步推廣，其在臨床的應用價值還需進一步的探討。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

尹曉新：課題設計及文章撰寫；馮海松：數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計分析；楊濤：收集資料及論文修改；朝浩：課題指導