尹曉新，馮海松，楊濤，朝浩

缺血性腦卒中是一類常見的缺血性腦血管病，具有較高的發(fā)病率、致殘率及致死率，且發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1]。缺血性腦卒中是由于局部腦組織缺血、缺氧造成的腦組織血液供應(yīng)不足引起的腦細(xì)胞缺血或壞死，并引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[2]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是缺血性腦卒中發(fā)生及發(fā)展過程中重要的發(fā)病機(jī)制，以往的研究表明，脂聯(lián)素在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[3-4]，本研究擬通過構(gòu)建腦缺血損傷模型探究脂聯(lián)素在腦缺血損傷中的具體作用及機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)新生7日齡雄性SD大鼠60只由武漢科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(新)2016-003，合格證號(hào)：SCXK(新)2016-0002。全部大鼠飼養(yǎng)在(22±2)℃的房間內(nèi)，相對(duì)濕度50%～65%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過武漢科技大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。(2)主要試劑：SIRT1抑制劑Sirtonol購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；氧化因子(ROS、MDA、SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蘇木素、伊紅購(gòu)自武漢博士得生物有限公司;BCA蛋白定量及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；PGC-1α抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司，SIRT1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。(3)主要儀器：切片機(jī)購(gòu)自上海斯歐醫(yī)療器械有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Protein Simple公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年10月—2020年12月于武漢科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。模型構(gòu)建：60只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、脂聯(lián)素組、Sirtonol組及脂聯(lián)素+Sirtonol組，每組12只。模型制備方法參照文獻(xiàn)[5]，大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥麻醉，行頸正中切口分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎CCA近心端，ECA和 ICA近分叉處打活結(jié)，在CCA近分叉處剪一倒“V”型切口，插入線栓，于插入線栓處用備用線結(jié)扎(以不出血為度)，松開ICA處活結(jié)，緩慢推送線栓，線栓進(jìn)入ICA后調(diào)整線栓頭端向內(nèi)向上，有阻力時(shí)停止推進(jìn)，此時(shí)線栓頭端正好處于大腦中動(dòng)脈(MCA)起始部，造成阻斷，缺血2 h后輕柔拔出線栓?？瞻讓?duì)照組分離右側(cè)頸總動(dòng)脈但不插入線栓。脂聯(lián)素組造模后30 min在大鼠的側(cè)腦室注入APN(劑量為1 μg/g)。Sirtonol組及脂聯(lián)素+Sirtonol組在模型組及脂聯(lián)素組基礎(chǔ)上給予SIRT1抑制劑Sirtonol，同樣通過側(cè)腦室注入Sirtonol(濃度劑量為2 μl/100 g)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 觀察大鼠腦組織損害程度：造模24 h后分離各組大鼠大腦組織，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，組織切片后行HE染色，顯微鏡下采集數(shù)據(jù)并拍照。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)氧化因子水平：造模后24 h取大腦組織并提取蛋白質(zhì)，BCA定量法測(cè)定蛋白后備用。用蛋白裂解液將提取的蛋白稀釋至濃度為1 mg/ml的懸液，取50 μl懸液加入反應(yīng)液，酶標(biāo)儀定量檢測(cè)并讀取相應(yīng)的吸光度值，并計(jì)算出各樣本的氧化因子ROS、MDA、SOD水平。

1.3.3 免疫印跡法檢測(cè)SIRT1及PGC-1α蛋白表達(dá)：造模后24 h取大腦組織，裂解組織后提取總蛋白。取等量的蛋白(20 μg)用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉后,在4℃與特定的抗體(包括SIRT1及PGC-1α)一起搖床孵育過夜;次日用TBST將膜洗滌3次，并用對(duì)應(yīng)的二抗孵育1 h，用TBST洗滌3次后配制ECL發(fā)光反應(yīng)液，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織損害程度比較 與空白對(duì)照組比較，模型組腦組織損傷嚴(yán)重，神經(jīng)元細(xì)胞排列散亂，間質(zhì)有明顯水腫，胞質(zhì)中有空泡形成，細(xì)胞核固縮或溶解消失；與模型組比較，脂聯(lián)素組腦組織損傷程度明顯減輕，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，排列較有序，僅為輕度缺血，見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織細(xì)胞病理變化比較(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.01)；與模型組比較，脂聯(lián)素組大鼠氧化因子ROS、SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.3 各組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達(dá)減少(t/P=22.764/<0.001、28.645/<0.001)；與模型組比較，脂聯(lián)素組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達(dá)均顯著增加(t/P=20.089/<0.001、27.937/<0.001)，見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α蛋白表達(dá)的比較

2.4 脂聯(lián)素通過SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路發(fā)揮作用 為進(jìn)一步確認(rèn)脂聯(lián)素是否通過SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用,添加SIRT1抑制劑Sirtonol檢測(cè)相關(guān)氧化因子的表達(dá)。與模型組比較，Sirtonol組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.01)；與脂聯(lián)素組比較，脂聯(lián)素+Sirtonol組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

3 討 論

缺血性腦卒中是由于腦動(dòng)脈狹窄或阻塞導(dǎo)致供血腦組織缺血壞死引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的一類腦血管疾病。在缺血過程中各種病理機(jī)制相互關(guān)聯(lián)、彼此交錯(cuò)，氧化應(yīng)激損傷貫穿于整個(gè)過程[6]。腦組織缺血損傷后過量的氧自由基不能被清除，氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡被打破[7]。因此采取及時(shí)有效的措施阻止氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生成為治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。本研究通過線栓栓塞頸動(dòng)脈方法構(gòu)建了缺血性腦卒中模型，探討了脂聯(lián)素在腦缺血損傷中的作用并初步探討其作用機(jī)制。

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素蛋白，是脂肪組織中表達(dá)最豐富的基因[8]。已有研究表明，脂聯(lián)素能夠提高外周組織對(duì)胰島素的敏感性，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗糖尿病的作用。此外有很多證據(jù)表明，脂聯(lián)素在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[3-4]。由于脂聯(lián)素的分子量大很難通過血腦屏障，即使通過了血腦屏障在腦組織中的濃度也很低，很難發(fā)揮作用[9]。本研究擬通過側(cè)腦室注射脂聯(lián)素的方式探討脂聯(lián)素在腦缺血損傷中的作用，結(jié)果顯示，與模型組比較，脂聯(lián)素組腦細(xì)胞排列較均勻，壞死腦細(xì)胞較前減少，提示脂聯(lián)素具有減輕缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷程度的作用。脂聯(lián)素除了具有胰島素增敏、抗炎、抗凋亡作用外，還能通過抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬相關(guān)通路提高心肌的抗氧化損傷，提高線粒體的生物合成功能，改善高糖高脂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[10-13]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組氧化因子ROS、SOD水平升高，MDA水平降低，而在給予脂聯(lián)素干預(yù)后氧化因子ROS、SOD水平降低，MDA水平升高，可知脂聯(lián)素具有抗氧化應(yīng)激損傷作用。缺血性腦卒中組織產(chǎn)生ROS的能力增加而清除ROS的能力下降，組織中這種動(dòng)態(tài)平衡被打破導(dǎo)致大量的ROS在組織內(nèi)蓄積，最終導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[14-16]。MDA是自由基作用下脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其水平反映了脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞的損傷程度[17-18]。SOD是一種內(nèi)源性的抗氧化酶，可對(duì)抗氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激損傷的另一重要指標(biāo)。有研究顯示，脂聯(lián)素多肽能夠減輕谷氨酸鹽處理的HT22細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[19]，這與本研究結(jié)果相符，表明脂聯(lián)素具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

此外，本研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達(dá)減少，而在給予脂聯(lián)素干預(yù)后大鼠腦組織SIRT1及PGC-1α的蛋白表達(dá)增加，表明脂聯(lián)素在缺血性腦卒中大鼠腦組織中有助于上調(diào)SIRT1及PGC-1α的蛋白表達(dá)。SIRT1屬于sirtuin家族，是一種依賴于煙酰胺去嘌呤二核苷酸的去乙?；福谛?、腦等組織中表達(dá)增加，因其在氧化應(yīng)激方面的作用而受到廣泛關(guān)注[20]。miR-29c通過調(diào)控SIRT1表達(dá)影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[21]；SIRT1還能通過影響ROS的產(chǎn)生及抗氧化酶的活性從而調(diào)節(jié)阿爾茨海默病的大腦應(yīng)激損傷[22]。PGC-1α是SIRT1的下游蛋白，通過增強(qiáng)線粒體的生物合成功能增加組織的氧化代謝。在缺血性腦卒中發(fā)生后SIRT1及PGC-1α的蛋白表達(dá)水平減少，提示腦組織中氧化及抗氧化功能失衡，從而導(dǎo)致ROS、SOD水平升高，MDA水平降低，進(jìn)而引發(fā)腦組織的功能障礙[1]。因此缺血性腦卒中通過增加SIRT1/PGC-1α表達(dá)進(jìn)而影響ROS、SOD及MDA的活性，增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激引起的腦組織損傷。本研究為了進(jìn)一步確認(rèn)脂聯(lián)素是否通過SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用,為此添加SIRT1抑制劑Sirtonol檢測(cè)相關(guān)氧化因子的表達(dá)。與脂聯(lián)素組比較，脂聯(lián)素+Sirtonol組阻斷了脂聯(lián)素對(duì)腦組織的抗氧化作用。這些研究結(jié)果提示，脂聯(lián)素通過調(diào)節(jié)SIRT1/PGC-1α蛋白表達(dá)影響氧化因子水平進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上所述，脂聯(lián)素減輕缺血性腦卒中大鼠的氧化應(yīng)激損傷主要是通過調(diào)節(jié)SIRT1及PGC-1α的蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，為臨床治療缺血性腦卒中患者氧化應(yīng)激損傷提供了理論支持，但脂聯(lián)素不能通過血腦屏障限制其在臨床的進(jìn)一步推廣，其在臨床的應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步的探討。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

尹曉新：課題設(shè)計(jì)及文章撰寫；馮海松：數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計(jì)分析；楊濤：收集資料及論文修改；朝浩：課題指導(dǎo)