王俊偉，潘廣林，郭慶彬，黃 爽，陳金銘，楊 新，宋軍科*，趙光輝*

(1.西北農林科技大學 動物醫(yī)學學院，陜西 楊凌 712100；2.秦嶺大熊貓研究中心/陜西省珍稀野生動物救護基地，陜西 周至 710402)

肺線蟲是一種寄生于人和動物肺臟及支氣管等呼吸系統(tǒng)的線蟲，其感染不僅會造成宿主咳嗽、呼吸困難，還可繼發(fā)細菌感染，導致支氣管肺炎、間質性肺炎等[1]。秦嶺羚牛又稱金毛扭角羚，主要分布于秦嶺山脈西部地區(qū)，與四川羚牛同屬于我國特有珍稀物種[2]。成年秦嶺羚牛毛色呈白色或金白色，極具觀賞價值，但由于其大多生存于野外環(huán)境，對其疾病的情況了解較少，防控經驗不足，使得秦嶺羚牛的生存狀況較為艱難。

2019年3月，在陜西省周至縣樓觀臺地區(qū)發(fā)現了1頭野生羚牛死亡，經剖檢發(fā)現其肺部有大量線蟲寄生。為明確這些肺部線蟲的種類，本研究對該頭秦嶺羚牛的肺線蟲進行了采集和固定，并綜合應用傳統(tǒng)形態(tài)學和分子生物學方法對獲得線蟲進行了種屬鑒定，研究結果為秦嶺羚牛肺線蟲病的流行病學調查和防控提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品利用蠕蟲完全剖檢法[3]采集陜西省周至縣樓觀臺地區(qū)發(fā)現的1頭死亡羚牛肺臟內寄生的線蟲。將死亡羚牛的胸腔剖開后，取出肺臟，用手術剪沿支氣管將肺臟剪開，利用挑蟲針挑取其中寄生的線蟲，直接放入70%乙醇，沖洗干凈，標記宿主品種、采樣時間、地點和年齡等信息，將蟲體樣本保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器苯酚、乳酸、甘油均購自天津市致遠化學試劑有限公司；pMDTM19-T Vector Cloning Kit、大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞、DL2000 DNA Marker均購自大連寶生物工程有限公司；2×Es Taq MasterMix購自賽默飛世爾科技公司；TIANamp Genomic DNA Kit、Universal DNA Purification Kit均購自北京天根生化科技有限公司；光學顯微鏡購自尼康儀器有限公司；DYY-31A型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一廠；PCR擴增儀購自杭州博日科技有限公司；紫外凝膠成像儀ChampGei5000購自賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 蟲體形態(tài)學指標的測定和種屬初步鑒定首先觀察蟲體肉眼觀的形態(tài)特點，再將蟲體放入乳酚透明液中透明處理3～5 min，在顯微鏡下用測微尺測量并記錄蟲體的長度、寬度，以及口囊、食道、雌蟲陰門、雄蟲交合傘等形態(tài)特征，按文獻[3-4]方法進行種屬鑒定。

1.4 蟲體基因組DNA的提取選取15條蟲體進行基因組DNA的提取，包括13條雌蟲(命名為BL1900101、BL190A102、BL190B202、BL190C301、BL190D101、BL190D201、BL190D405、BL190E501、BL190F601、BL190G201、BL190H101、BL190I101和BL190J204)和2條雄蟲(命名為BL190M304和BL190M401)。蟲體樣本經無菌雙蒸水洗滌后用蛋白酶K過夜處理，次日使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒按照說明書提取每條蟲體的基因組DNA。

1.5 蟲體ITS-2 rRNA基因的PCR擴增、電泳、克隆和測序PCR擴增采用文獻[5]設計的1對通用引物(NC1：5′-ACGTCTGGTTCAGGGTTGTT-3′；NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。擴增體系為25 μL，包括11 μL 2×Es Taq Mastermix、上下游引物(20 μmol/L)各1 μL和1 μL蟲體基因組DNA，反應條件為：95℃ 5 min;95℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s進行30個循環(huán);72℃延伸7 min。

利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行鑒定，將正確的PCR擴增產物使用Universal DNA Purification Kit試劑盒按照操作步驟純化，純化產物連接至pMDTM19-T載體構建重組質粒，連接產物轉化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，利用上述引物進行PCR鑒定，陽性菌液樣品送上海生工生物工程股份有限公司進行序列測定。

1.6 序列分析測得序列使用NCBI BLAST進行同源性比對，對照測序圖譜進行序列校準，去除兩翼5.8S rRNA和28S rRNA序列，獲得的ITS-2基因全序列利用Megalign進行同源性分析，利用Mega X軟件使用鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以Kimura 2-parameter為模型，自展值設為2 000，以捻轉血矛線蟲(LC360163)為外群。

2 結果

2.1 秦嶺羚牛源肺線蟲的形態(tài)學特征本研究共采集到214份蟲體樣本，均為成蟲。肉眼觀下呈淡黃色、絲狀。顯微鏡下觀察發(fā)現，頭端較為鈍圓、粗大；口端有3個唇片(圖1A)，食道呈棒狀，后端膨大，神經環(huán)位于食道前1/2處(圖1B)。

雄蟲長30.500～31.200 mm，口囊大小為0.025 mm，食道長0.350 mm；尾端有1對翼膜，無橫紋或縱紋；交合傘較小，大小為0.095 mm×0.065 mm，側肋較為粗短，中側肋到達傘緣，其余側肋較短；交合刺1對且不等長，呈褐色，長0.210～0.241 mm(圖1C)。

雌蟲長為36.500～41.600 mm，口囊大小為0.023～0.047 mm，食道長0.360～0.420 mm，肛門距尾尖的距離為0.040～0.057 mm，陰門距尾尖的距離為0.088～0.112 mm。尾端尖銳呈圓錐形，末端有顆粒狀物質，陰門蓋形態(tài)多樣，有扇狀、雙瓣狀、半圓狀等(圖2)，大小為(0.120～0.150) mm×(0.055～0.070) mm。與其他已報道變圓屬線蟲的形態(tài)學數據分析見表1。

表1 變圓屬線蟲的形態(tài)學比較 mm

A.頭端(400×)；B.頭端(100×)；C.雄蟲尾端結構(400×)

A.扇狀(400×)；B.兩瓣狀(400×)；C.半圓狀(400×)

2.2 秦嶺羚牛源肺線蟲ITS-2 rRNA基因的序列特征及種系發(fā)育關系分析結果以蟲體組織DNA作為PCR模板進行擴增，15條蟲體的ITS-2 rRNA基因的擴增條帶均約為500 bp，與預期大小一致(圖3)。序列分析發(fā)現，本研究所獲得肺線蟲的ITS-2 rRNA基因全長為409～431 bp，序列與GenBankTM發(fā)表的原圓科變圓屬線蟲Varestrongyluscf.capreoli(KJ452176)相似性最高，為80.35%～82.30%。利用Megalign進行序列分析發(fā)現(圖4)，本研究中的15條秦嶺羚牛肺線蟲ITS-2 rRNA基因序列相似性為97.5%～100.0%。種系發(fā)育關系分析發(fā)現(圖5)，本研究獲得的秦嶺羚牛肺線蟲樣本單獨位于一支，與原圓科變圓屬線蟲(KJ439597、KJ439598)位于姊妹支，但ITS-2 rRNA基因序列之間的差異較大，為24.1%～25.4%。

M.DL2000 DNA Marker；1～15.秦嶺羚牛肺線蟲樣本 BL1900101、BL190A102、BL190B202、BL190C301、BL190D101、BL190D201、BL190D405、BL190E501、BL190F601、BL190G201、BL190H101、BL190I101、BL190J204、BL190M304、BL190M401；16.陰性對照

圖4 肺線蟲ITS-2 rRNA基因序列的同源性分析結果

▲ 秦嶺羚牛肺線蟲樣本序列

3 討論

國內研究發(fā)現，羚牛體內外寄生蟲的感染強度較大[6-7]，尤其以網尾科線蟲和原圓科線蟲為主的肺線蟲感染率最高[8-9]。向丕元等[9]研究了四川地區(qū)不同年齡野生羚牛寄生蟲的感染情況，發(fā)現原圓線蟲為優(yōu)勢蟲種。楊光友等[10]采集了四川蜂桶寨自然保護區(qū)63頭野生羚牛的新鮮糞樣，肺線蟲幼蟲的檢出率高達79.37%。

目前，對于羚牛肺線蟲的種屬鑒定主要基于形態(tài)學特征，如頭部、食道類型、尾部結構等[11-12]。已報道的6種可寄生于羚牛呼吸系統(tǒng)的肺線蟲，包括胎生網尾線蟲、鹿網尾線蟲、長刺變圓線蟲、天全三叉圓線蟲、羚牛圓線蟲和柯氏原圓線蟲[13]。本研究通過形態(tài)學觀察發(fā)現，寄生于該頭死亡秦嶺羚牛肺部的線蟲符合原圓科變圓屬線蟲的典型結構，如口有3個唇片、食道呈棒狀等，與其他已報道變圓屬線蟲的形態(tài)學數據相似。但本研究所采集雌蟲的尾部陰門蓋形態(tài)特征明顯與其他變圓屬線蟲不同，本研究中的雌蟲均具有陰門蓋結構，且較為發(fā)達，形狀多樣(呈扇狀、雙瓣狀、半圓狀)，而絕大多數已報道的變圓屬線蟲雌蟲的陰門蓋不發(fā)達或不具有陰門蓋結構。此外，本研究獲得的蟲體形態(tài)與劉世修[14]在羚牛體內發(fā)現的長刺變圓線蟲較為相似，但雌雄蟲生殖結構明顯不同，推測本研究中的線蟲可能為原圓科變圓屬的新種。

傳統(tǒng)形態(tài)學方法雖然具有方便、易行等優(yōu)點，但線蟲的形態(tài)學檢查結果可能會受到檢查者的主觀影響，且有時不能有效用于近緣種、幼蟲階段蟲體等的鑒定。近年來，分子生物學方法在寄生蟲的鑒定和分類研究中被證實更高效、準確，已被廣泛地運用于多種寄生蟲感染的分子流行病學調查和種群結構分析[15-17]。分子生物學方法不僅可以從基因層面分析種群內部差異，還可基于系統(tǒng)發(fā)育分析推斷寄生蟲可能的進化演變規(guī)律。眾多研究表明，線蟲的核糖體DNA中的內轉錄間隔區(qū)的種間變異性較大，而種內又具有高度保守性，適用于原蟲、蠕蟲等寄生蟲的分類及種類鑒定[18]。EPE等[19]利用基于ITS-2 rRNA基因的分子生物技術研究了網尾科線蟲的種間差異，證明了利用ITS rRNA基因序列的生物學技術對肺線蟲進行種類鑒別的可行性；KUCHBOEV等[20]通過對烏茲別克斯坦5種山羊原圓線蟲的研究發(fā)現，ITS-2 rRNA基因序列之間的差異足以進行物種鑒定，為山羊原圓線蟲的種類鑒定及進一步分類提供了基礎數據。本研究對秦嶺羚牛肺線蟲的ITS-2 rRNA基因進行序列分析發(fā)現，BLAST比對與原圓科變圓屬線蟲Varestrongylus.cf.capreoli(KJ452176)的相似度最高(80.35%～82.30%)，而本研究的蟲體樣本的ITS-2 rRNA基因序列的相似性很高(97.5%～100.0%)；進一步基于ITS-2 rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現本研究所獲得的蟲體樣本單獨位于一支，與原圓科變圓屬線蟲(KJ439597，KJ439598)位于姊妹支，但兩者的ITS-2 rRNA基因序列差異很大(24.1%～25.4%)?；谛螒B(tài)學特征和分子生物學鑒定結果，推測本研究獲得的秦嶺羚牛肺線蟲應為原圓科變圓屬線蟲的一個新種，我們暫時將其命名為羚牛變圓線蟲。

原圓科線蟲為生物源性寄生蟲，其發(fā)育需要陸地螺或蛞蝓作為中間宿主，蟲卵由雌蟲在肺部產出后，迅速發(fā)育孵化為第1期幼蟲，沿著細支氣管到達口腔，再進入腸道，之后隨糞便排出體外[3,21]。向丕元等[8]研究發(fā)現，外界環(huán)境中的幼蟲只有從軟體動物的肉足褶壁處侵入才可在肉足肌肉組織中停留寄生，并在15～25℃經2次蛻皮后發(fā)育為感染性幼蟲。當反芻動物攝入感染性幼蟲后，幼蟲鉆入宿主腸壁，在腸系膜淋巴結內進行蛻皮后移行至肺，在肺泡、細支氣管或肺實質中發(fā)育為成蟲[22]。目前已報道的原圓科變圓屬線蟲有肺變圓線蟲(Varestrongyluspneumonicus)、長刺變圓線蟲、舒氏變圓線蟲(Varestrongylusschulzi)和青海變圓線蟲(Varestrongylusqinghaiensis)[4]，但均未對其生活史進行相關研究。本研究對獲得肺部線蟲觀察未發(fā)現其他發(fā)育階段蟲體，不確定其生活史是否完全符合原圓科線蟲的特征。因此，未來從生活史的角度對變圓線蟲進行研究，將更能有助于確定其種屬和進行相關防控策略的制定。