張海龍，何云鳳，黨儒堯，陳 玥，李佩國(guó)，李蘊(yùn)玉

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066604)

雞大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)病是一種引起雞腹瀉、腸炎、輕度至重度敗血癥等相關(guān)的綜合征[1]。E.coli通過(guò)土壤、空氣、食物等多種途徑傳播[2]，該病分布廣、呈世界性流行，常與傳染性支氣管炎、新城疫等呼吸道疾病及球蟲病并發(fā)[3]，可感染雛雞、育成雞、產(chǎn)蛋雞、肉雞等在不同季節(jié)發(fā)病，具有較高的病死率，是養(yǎng)雞場(chǎng)最常見(jiàn)的細(xì)菌病之一[4-5]。雞E.coli血清型眾多，主要包括O抗原、K抗原、H抗原3種，而O抗原是臨床E.coli最主要的血清型抗原，我國(guó)雞E.coli主要流行的血清型為O1、O2、O12、O78、O142，由于不同血清型之間的菌株缺乏交叉免疫，且每個(gè)地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型有所不同，從而無(wú)法通過(guò)疫苗的免疫獲得保護(hù)性，給疫苗的研制帶來(lái)一定的困難[6-7]。E.coli的致病性不僅與動(dòng)物種屬有關(guān)，還與自身攜帶的毒力有關(guān)，致病性E.coli基因組可編碼黏附素、攝鐵系統(tǒng)、溶血素、血清抗性蛋白等多種毒力因子[8]，這些毒力因子在獲取編碼毒力因子的基因后，相互協(xié)作，造成機(jī)體各器官的損害[9]，是引起機(jī)體發(fā)病的罪魁禍?zhǔn)住６玖σ蜃优c血清型對(duì)于E.coli的致病能力起主導(dǎo)作用。

本研究對(duì)2019—2020年從河北部分地區(qū)分離的181株致病性E.coli進(jìn)行血清型、毒力基因的檢測(cè)，并分析流行特點(diǎn)，為該地區(qū)E.coli病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源2019-2020年從河北秦皇島、唐山、石家莊、滄州、邢臺(tái)等地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)采集的 225 例疑似E.coli病的病死雞，其中2019年135份樣品，2020年90份樣品。無(wú)菌采集疑似E.coli病的病死雞的肝臟、肺臟等組織。E.coli質(zhì)控菌株ATCC 25922由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1日齡健康的海蘭褐公雛120只購(gòu)于河北振志家禽育種有限公司。

1.3 主要試劑普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，DL2000 DNA Marker，2×Taq Marker Mix 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，E.coli血清型鑒定用O型血清因子購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限公司，ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條購(gòu)自生物梅里埃中國(guó)有限公司。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定將病死雞的肝臟組織無(wú)菌劃線接種于麥康凱平板上，37℃倒置培養(yǎng)12～18 h,挑取麥康凱平板上粉紅色、光滑的單菌落接種于伊紅美藍(lán)平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取伊紅美藍(lán)平板上呈黑色、圓形、帶金屬光澤的單菌落在普通瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)2～3次，-20℃保存?zhèn)溆?。按生化鑒定試劑條說(shuō)明書進(jìn)行生化鑒定。

1.5 菌株的PCR鑒定水煮法進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)16S rRNA的通用引物，引物序列由北京生工合成，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min,94℃ 45 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min，反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL ，無(wú)RNA酶水6 μL。將陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.6 菌株的血清型檢測(cè)參照文獻(xiàn)[10]的方法，采用O型血清因子進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，對(duì)分離的181株致病性E.coli(2019年105株、2020年76株)進(jìn)行血清型檢測(cè)。

1.7 優(yōu)勢(shì)血清型代表株的致病性試驗(yàn)根據(jù)分離菌株的血清型結(jié)果，篩選出了優(yōu)勢(shì)血清型O1、O2、O18、O26、O78，挑選優(yōu)勢(shì)血清型代表株各4株，共20株。將分離純化的菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用滴板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，將菌液稀釋至終濃度為2×107CFU/mL。將105只7日齡健康雛雞隨機(jī)分為21組，每組5只，第1～20組為攻毒組，每只腹腔注射0.20 mL菌液，每株菌接種1組雛雞；第21組為空白對(duì)照組，腹腔注射相同劑量的生理鹽水。觀察7 d，記錄雛雞的精神狀態(tài)、食欲情況和死亡情況，對(duì)死亡的雞進(jìn)行剖檢，觀察各臟器病理變化，并對(duì)其進(jìn)行分離及鑒定。

1.8 分離菌株毒力基因的檢測(cè)水煮法提取細(xì)菌DNA，以提取的DNA為模板，根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]由北京生物工程有限公司合成毒力基因Vat、astA、hlyF、colv、Ler、eaeA、fimC、papC、sfa、tsh、ompT、Iss、iroN、iucD、iutA、iutB、irp2、fyuA、ECs3703、ECs3737等20對(duì)引物，采用 PCR方法進(jìn)行毒力基因的檢測(cè)，膠回收分離菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，分離菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中參考株的基因序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定通過(guò)對(duì)分離菌株進(jìn)行分離純化、染色鏡檢、生化鑒定、16S rRNA鑒定。結(jié)果顯示，從采集的225份病料中分離到了181株E.coli，分離率為80.4%，其中2019，2020年分別分離出105，76株E.coli，分離率分別為77.78%，84.45%。革蘭染色在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)呈兩端鈍圓、紅色短桿狀，在麥康凱平板上呈磚紅色、光滑、濕潤(rùn)的單菌落(圖1A)，在伊紅美藍(lán)平板上呈黑色、圓形、帶金屬光澤的單菌落(圖1B)，培養(yǎng)基上的菌株特征與E.coli特征相符。181株分離菌株經(jīng)ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條鑒定分析，評(píng)定結(jié)果均符合E.coli生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)，符合率為99.50%～99.90%。

A.分離菌株在麥康凱平板上形態(tài)特征;B.分離菌株在伊紅美藍(lán)平板上形態(tài)特征

2.2 分離菌株16S rRNA PCR鑒定181株分離菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在約1 492 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。分離菌株測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的E.coli的參考株基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性在98.8%～99.9%之間，結(jié)果表明181株分離菌株均為E.coli。部分菌株的PCR結(jié)果如圖2。

M.DL2000 DNA Marker;1～4.臨床分離部分菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果;5.陰性對(duì)照

2.3 分離菌株血清型檢測(cè)結(jié)果用E.coli標(biāo)準(zhǔn)O型血清因子進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)分離菌株的血清型，結(jié)果顯示 181株致病性E.coli共有18種不同的血清型，以O(shè)78、O1、O2、O18和O26為主要流行的血清型，分別占比14.92%，14.36%，11.60%，10.50% 和10.50%。其中2019年105株致病性E.coli，94株定型，11株未定型，以O(shè)26、O1、O18、O78和O2血清型為主，檢出率分別為18.10%，14.29%，12.38%，9.52%和7.62%；2020年76株致病性E.coli，71株定型，5株未定型，以O(shè)78、O2、O1、O6和O18血清型為主，檢出率分別為22.37%，17.11%，14.47%，7.89%和7.89%(表1)。

表1 雞源致病性E.coli血清型檢測(cè)結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果攻毒組的雛雞發(fā)病率為100.00%，總病死率高達(dá)82.00%，部分雞在攻毒后6 h開始出現(xiàn)打蔫、精神不佳、食欲下降，死亡7只，攻毒后12～24 h，雞開始拉黃白色稀糞、羽毛粗糙不光滑，死亡42只，攻毒后36～48 h，死亡21只，72 h后，共計(jì)死亡82只，總病死率為82.00%，少數(shù)攻毒未死亡的雞也有明顯E.coli的發(fā)病癥狀。對(duì)病死雞進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)肝臟腫大無(wú)彈性、氣囊渾濁，心臟包膜增厚。無(wú)菌采集病死雞的肝臟、肺臟等組織，在鑒別培養(yǎng)基上進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示，分離出的菌是E.coli。對(duì)照組的雞采食、飲水、排泄均正常，無(wú)死亡。

2.5 分離菌株毒力基因檢測(cè)通過(guò)PCR方法檢測(cè)20種毒力基因的攜帶情況，結(jié)果顯示，181株致病性E.coli攜帶16種不同毒力基因，未檢測(cè)到Ler、eaeA、papC、sfa4種毒力基因(圖3)。

2019年105株致病性E.coli中iutA毒力基因檢出率最高，為96.19%(101/105)；其次為iroN、hlyF、ompT、Iss、fimC和Ecs3703毒力基因檢出率也較高，分別為93.33%，91.43%，90.48%，87.62%，85.71%和83.81%；Vat、iutB、fyuA、colv、tsh、irp2、iucD、astA和Ecs3737毒力基因檢出率為7.62%～76.19%。2020年76株致病性E.coli中hlyF毒力基因檢出率最高為100.00%；iucD、Iss、ompT和fimC毒力基因檢出率分別為93.42%～98.68%；Vat、iutB毒力基因檢出率較低，分別為2.63%和23.68%(表2)。

M.DL2000 DNA Marker;1～16.Vat,hlyF,fimC,ompT,Iss,iroN,iucD,iutA,iutB,irp2,fyuA,tsh,colv,astA,Ecs3703,Ecs3737;17.空白對(duì)照

表2 2019-2020年雞源致病性E.coli毒力基因檢測(cè)結(jié)果

多重毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，181株致病性E.coli均攜帶多種毒力基因，其中2019年的105株E.coli同時(shí)攜帶2～15種毒力基因，其中攜帶2,3和5種基因的菌株各有1株(0.95%)；攜帶11種基因的菌株數(shù)最多，高達(dá)20株(19.05%)；2020年的76株E.coli同時(shí)攜帶4～15種毒力基因，其中攜帶4，7，8和15種毒力基因的菌株最少，均為1株(1.32%)；攜帶13種毒力基因的菌株數(shù)最多，高達(dá)16株(21.05%)(圖4)。

圖4 2019-2020年致病性E.coli多重毒力基因攜帶情況

2019年的105株E.coli主要攜帶5種毒力譜，hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs3703+ECs3737+astA毒力譜檢出率最高，為9.52%，其次是hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+ECs370+ECs3737+astA毒力譜檢出率為7.62%，而hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+ECs370+ECs3737+astA+iutB和hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737毒力譜的檢出率均是4.76%。2020年的76株E.coli主要攜帶4種毒力譜，其中hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA毒力譜檢出率最高，為9.21%，而hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA和hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+ECs370+ECs3737+astA+iutB毒力譜的檢出率均是5.26%，hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA毒力譜連續(xù)2年的檢出率均最高，是2019—2020年最流行的毒力譜(表3)。

表3 不同年份E.coli的主要毒力譜分布

3 討論

3.1 河北部分地區(qū)雞源致病性E.coli的血清型分析E.coli血清型種類有百余種，不同地區(qū)所流行的血清型有所差異，其所導(dǎo)致的致病能力也各不相同。申子平等[13]對(duì)貴陽(yáng)、遵義地區(qū)分離的39株E.coli進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示39株E.coli有8株未定型，其余的31株以O(shè)78、O15和O45為優(yōu)勢(shì)血清型，分別占比29.03%，12.90%和12.90%。李蘊(yùn)玉等[14]對(duì)秦皇島地區(qū)20株E.coli進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示20株E.coli分屬于O1、O2、O78、O18和O89血清型,分別占比40.00%，30.00%，15.00%，10.00%和5.00%。本研究通過(guò)對(duì)河北地區(qū)的181株致病性E.coli進(jìn)行血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)165株E.coli定型，16株未定型，以O(shè)78、O1、O2、O18和O26為主要流行的血清型，分別占比14.92%，14.36%，11.60%，10.50%和10.50% 。由此表明致病性E.coli的優(yōu)勢(shì)血清型與所在區(qū)域存在很大的聯(lián)系。

3.2 河北部分地區(qū)雞源致病性E.coli的毒力基因分析禽致病性E.coli不僅含有多個(gè)毒力因子，并且不同的毒力因子在E.coli中的流行有較大的差異，致病性E.coli侵入機(jī)體后，由于不同的毒力因子相互組合，共同作用而導(dǎo)致發(fā)病。劉璨穎等[15]對(duì)廣東佛山地區(qū)的108株禽致病性E.coli進(jìn)行9種毒力基因的檢測(cè)，結(jié)果表明分離菌株的iucD毒力基因檢出率最高，為74.07%(80/108)，其次Iss、tsh和hlyF毒力基因的檢出率為55.56%～62.96%，而papC和vat毒力基因檢出率較低，分別為5.56%和2.78%。盧琴等[16]報(bào)道的湖北部分地區(qū)的33株禽E.coli的fimH毒力基因檢出率最高，為87.88%，iroD、iucD和estA的檢出率為36.37%～57.58%，而ibeA基因檢出率為0%。本研究結(jié)果表明2019年的iutA、iroN、hlyF、ompT、Iss、fimC和Ecs3703的檢出率較高，為83.81%～96.19%，Vat、iutB的檢出率分別為7.62%和34.29%；2020年的hlyF毒力基因檢出率最高為100%；iucD、Iss、ompT和fimC毒力基因檢出率分別為93.42%～98.68%；Vat和iutB毒力基因檢出率較低，分別為2.63%和23.68%，而Ler、eaeA、papC和sfa未檢出。王俊麗等[17]對(duì)聊城地區(qū)的212株E.coli進(jìn)行18種毒力基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分離菌株均攜帶多重毒力基因，155株分離菌攜帶5～9種毒力基因，比例為73.11%。楊娟等[18]對(duì)昆明地區(qū)的140株雞源E.coli進(jìn)行12種毒力基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)140株E.coli均攜帶多種毒力基因，同時(shí)攜帶5種毒力基因的菌株有7株，比例為5%，攜帶8～11種毒力基因的菌株有102株，比例為72.86%。本研究結(jié)果表明分離菌株均攜帶多種毒力基因，2019年的105株E.coli攜帶11種基因的菌株數(shù)最多，高達(dá)20株(19.05%)，2020年的76株E.coli攜帶13種毒力基因的菌株數(shù)最多，高達(dá)16株(21.05%)。以上結(jié)果表明不同地區(qū)E.coli所攜帶的毒力基因種類和數(shù)量差異較大，不同地區(qū)的E.coli均攜帶多重毒力基因。本研究對(duì)該地區(qū)雞源致病性E.coli的血清型和毒力基因的流行趨勢(shì)進(jìn)行研究，為研制該病的疫苗提供了數(shù)據(jù)支持，為防治雞源E.coli病提供了理論依據(jù)。