代國娜，尚明越，王嘉樂，鄭加梅，徐福榮，宋經(jīng)元，段寶忠*

1.大理大學藥學院，云南 大理 671000

2.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650504

3.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193

金釵石斛Dendrobium nobileLindl.是名貴藥材石斛的基原植物之一，藥用部位為新鮮或干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨痿軟[1]?，F(xiàn)代研究表明金釵石斛含有多糖、生物堿等多種化合物[2]，其中生物大分子多糖也是金釵石斛的主要生物活性分子之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等藥理活性[3-6]。近年來，已有學者對金釵石斛的化學成分和藥理作用進行了相關(guān)報道[7-9]，但尚未見對其多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)解析和生物活性進行系統(tǒng)報道。鑒于此，本文對近年來國內(nèi)外金釵石斛多糖提取分離、結(jié)構(gòu)特征和生物活性及其作用機制的研究進行了系統(tǒng)綜述，以期為金釵石斛資源的開發(fā)利用提供科學參考。

1 金釵石斛多糖的提取和分離純化

1.1 金釵石斛多糖的提取

金釵石斛多糖的提取方法主要有水提取法、有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶提取法等[8]?；谏鲜鎏崛」に嚕辔粚W者采用單因素與正交試驗或響應(yīng)面法結(jié)合的方式，以苯酚硫酸法檢測多糖得率，對金釵石斛多糖的提取工藝進行了優(yōu)化[10-13]。研究顯示，微波輔助提取法提取率高、提取時間短、耗能小、成本低，更合適廣泛推廣和普及，該法與傳統(tǒng)水提醇沉法相比可顯著提高金釵石斛多糖的提取率，影響金釵石斛多糖得率的因素依次為料液比、提取時間、微波時間[11]；水提取法操作簡單，成本低，應(yīng)用廣泛，一般考察料液比、提取時間、提取溫度和提取次數(shù)等因素，多采用料液比1∶10～1∶52，溫度在59～100 ℃，提取時間1～2.5 h，反復(fù)提取后，得粗多糖[14-18]。有機溶劑提取法中多以乙醚為提取劑，60～100 ℃加熱回流2～3 h進行提取[13,19]。超聲波輔助提取法利用超聲振動的空化、機械粉碎以及熱學等作用，破壞藥材細胞，加快藥材有效成分的溶出，進而達到高效提取的目的[20]。余芳等[10]通過正交試驗考察超聲輔助提取法各因素對金釵石斛多糖得率的影響，明確影響大小依次為料液比、超聲時間、溫度，并建立了最佳工藝。酶提取法利用酶水解或降解植物細胞壁，增強細胞通透性，從而提高有效成分的提取率[21]。張曉敏等[22]對金釵石斛多糖纖維素酶提取工藝進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該法的多糖得率比熱回流提取法高43.84%。金釵石斛多糖提取方法的相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 金釵石斛多糖提取方法Table 1 Extraction methods of polysaccharides from D.nobile

1.2 金釵石斛多糖的分離純化

金釵石斛粗多糖樣品中一般含有低聚糖、蛋白質(zhì)、色素和脂質(zhì)等雜質(zhì)，需分離去除雜質(zhì)后，再進行純化方可獲得均一多糖[28]。金釵石斛粗多糖中的小分子物質(zhì)通常采用多次醇沉去除[29]；蛋白多采用Savage法和凍融法去除[26,30-31]，脫色方法常采用活性炭吸附法、雙氧水氧化法、吸附樹脂法[30,32]。金釵石斛多糖的分離純化主要采用柱色譜法、分步沉淀法和超濾法等[33]；其中以柱色譜法應(yīng)用最為廣泛，通常采用二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纖維柱聯(lián)合葡聚糖凝膠柱進行分離，首先采用DEAE-52纖維柱按極性大小進行分離，再根據(jù)相對分子質(zhì)量大小，用Sephacryl S和Sephadex G系列柱進行純化[34]。除此之外，還有少數(shù)采用AB-8大孔樹脂吸附法或乙醇梯度醇沉法[17,26]；金釵石斛多糖的相關(guān)純化方法見表2。

表2 金釵石斛多糖的分離純化過程及結(jié)果Table 2 Separation and purification of polysaccharides from D.nobile

2 金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)研究

2.1 金釵石斛多糖相對分子質(zhì)量

相對分子質(zhì)量是多糖重要物理特征之一，可間接反映其純度[40]。多位學者均采用高效凝膠滲透色譜法對金釵石斛中多糖的相對分子質(zhì)量進行了測定，分離得到均一多糖的相對分子質(zhì)量主要分布范圍為817～770 000[17,34-35,39]，見表3。

2.2 金釵石斛多糖的單糖組成

單糖組成通常先通過酸水解的方法將多糖水解成單糖，以標準單糖為對照，水解產(chǎn)物采用柱前衍生高效液相色譜法[46]、陰離子交換色譜安培法[47]、糖醇乙酸酯衍生化后聯(lián)合氣相色譜法[31,36]和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化-高效液相色譜（PMP-HPLC）法[36,41]等進行定性、定量分析。研究結(jié)果顯示，金釵石斛多糖的單糖組成豐富，但主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成，此外還含有鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等，見表3。

2.3 金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)特征

金釵石斛多糖精細結(jié)構(gòu)的研究甚少，仍處于起步階段，目前，有關(guān)其化學結(jié)構(gòu)解析主要通過甲基化、高碘酸鹽氧化、Smith降解及1D/2D核磁共振譜（NMR、COSY、HSQC、HMBC和TOCSY）分析[26,34-36]。金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)信息見表3。

3 金釵石斛多糖的生物活性

3.1 抗炎

炎癥與多種疾病密切相關(guān)[48]。研究顯示，金釵石斛多糖可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠腹腔巨噬細胞腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和一氧化氮（nitric oxide，NO）釋放，顯著抑制炎癥反應(yīng)[49-50]，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，其還可顯著降低大鼠腦缺血-再灌注區(qū)炎癥反應(yīng)[51-52]。此外，金釵石斛多糖可對抗LPS引起的大鼠海馬神經(jīng)元炎癥反應(yīng)，降低TNF-α、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）蛋白及其mRNA表達，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用[53]；另有研究表明，金釵石斛多糖可保護神經(jīng)元免受炎癥因子的損傷，其機制為抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，減少炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的產(chǎn)生[54-55]。

續(xù)表3

3.2 免疫調(diào)節(jié)

機體免疫功能的維持依賴體內(nèi)各種免疫器官及細胞。金釵石斛精制多糖和粗制多糖均能直接促進脾細胞的增殖，并對刀豆蛋白、LPS分別誘導的脾T細胞和B細胞的增殖有促進作用[19]；多項研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖DNP-W1B、DNP-W、DNP-W2、DNP-W3、HDNP-W2等均對脾T細胞和B細胞具增殖作用，且呈劑量相關(guān)性[31,44,56]。此外，金釵石斛多糖DNP-W5的分支和乙?；哂性鰪奣細胞和B細胞免疫活性作用[45]；Fan等[57]研究了含金釵石斛多糖的血清對小鼠巨噬細胞樣細胞系RAW264.7的影響，結(jié)果表明含藥血清可顯著提高其吞噬能力，促進細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1的分泌，并在轉(zhuǎn)錄水平上促進IL-1β的表達。

3.3 抗氧化和抗衰老

金釵石斛多糖對不同的氧化體系均具有抗氧化能力，具有顯著的量效關(guān)系，并對2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸+［2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)+，ABTS+］、二苯基苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、羥基自由基（·OH）、亞硝酸根（NO2?）有較強的清除能力[58-60]，與其他石斛多糖相比，金釵石斛多糖清除·OH、NO2?能力最佳，但無明顯差異[59]；通過對金釵石斛等5種石斛植物多糖的ABTS+、·OH清除能力進行研究，發(fā)現(xiàn)各酸性多糖抗氧化活性與糖醛酸含量呈正相關(guān)，與硫酸糖含量呈負相關(guān)[60]；研究顯示，金釵石斛多糖可抵抗高糖誘導下的氧化應(yīng)激損傷，保護細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，其機制為促進細胞核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor NF-E2-related factor 2，Nrf2）蛋白表達和核移位，上調(diào)醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）mRNA的表達[61]。此外，謝苗苗等[18]采用H2O2誘導的細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖有顯著的抗細胞衰老作用；亦有研究表明，金釵石斛多糖具有抗衰老作用，可拮抗D-半乳糖誘導的衰老小鼠免疫器官及組織的萎縮和病變[62]；還可延緩秀麗隱桿線蟲平均生存時間，其機制與提高線蟲抗應(yīng)激能力有關(guān)[5,63]。

3.4 抗腫瘤

抗腫瘤領(lǐng)域的相關(guān)研究是多糖藥效研究的熱點，從金釵石斛中分離得到的DNP-W1、DNP-W3多糖，對肉瘤S-180細胞和人早幼粒白血病HL-60細胞具有顯著的抑制活性[64]；金釵石斛水提物對人宮頸癌HelaS3細胞和肝癌HepG2細胞有不同程度的抑制作用，其可能機制是抑制原癌基因c-myc的表達[65]；金釵石斛多糖可抑制BALB/c荷瘤鼠皮膚腺癌移植瘤的生長，其機制與促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)[4]；此外，多糖DNP4-2能顯著提高免疫指數(shù)，并促進IL-2、TNF-α和γ干擾素（interferon-γ，IFNγ）的分泌，降低血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度，提示DNP4-2是一個潛在的抗腫瘤藥物[30]；金釵石斛多糖能明顯降低腎母細胞瘤WT1蛋白表達水平，對白血病細胞有一定殺傷作用[66]，亦可直接抑制慢性粒細胞白血病K562細胞增殖并誘導其凋亡，其可能機制與金釵石斛多糖抑制K562細胞中BCR-ABL融合基因的表達有關(guān)[67]。

3.5 抗肝損傷

金釵石斛多糖的抗肝損傷作用主要包括抗酒精性、非酒精性和肝纖維化肝損傷。研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖對亞急性酒精性肝損傷有一定程度的保護作用，其機制可能為通過抑制肝組織氧化和炎性損傷[68]；金釵石斛多糖對肝纖維化大鼠的肝損傷具有明顯的效果，其機制與亞急性酒精性肝損傷相同[69]；進一步研究顯示，金釵石斛多糖抗肝纖維化的作用機制可能與下調(diào)TGF-β1、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1）mRNA表達，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）mRNA表達有關(guān)[70]；此外，金釵石斛多糖可明顯改善高脂高糖飲食誘導的非酒精性脂肪肝病大鼠肝功能和血脂，機制可能與降低炎性小體NOD樣受體蛋白3的蛋白及mRNA的表達，進而調(diào)控IL-1β和IL-18，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)[71]；亦有研究顯示，金釵石斛多糖可以明顯改善非酒精性脂肪肝病的預(yù)后，降低大鼠肝臟中細胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）蛋白及mRNA表達，進而改善肝功能和血脂水平，提高過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力，最終有效緩解非酒精性脂肪肝病[72]。

3.6 抗糖尿病及其并發(fā)癥

糖尿病是臨床最常見的代謝性疾病，多由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙，以高血糖為特征，其病程緩慢，在發(fā)展過程中可導致多種并發(fā)癥，尤其是易引起相關(guān)器官損害，以糖尿病心肌損傷最為常見[73-74]。研究表明，金釵石斛多糖對腎上腺素引起的高血糖小鼠有明顯的降血糖作用，但對正常小鼠血糖無明顯影響，其可能機制為抑制肝糖元分解和肌糖元酵解，促進外周組織對葡萄糖的攝取和利用[75]；趙亨等[76-77]研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖能增加高糖誘導的大鼠胰島細胞瘤細胞的胰島素分泌量；此外，研究表明金釵石斛多糖可降低血糖和升高胰島素含量，可明顯促進糖尿病大鼠心肌細胞中B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-xL分泌，并降低Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和Bad的表達，實現(xiàn)心肌細胞保護作用[78]；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖可提高大鼠抗氧化能力，增加心臟組織中MMP-1和MMP-9的表達，改善2型糖尿病心肌損傷大鼠心功能，且具有明顯的劑量相關(guān)性[74,79]；同時，王軍輝[34]研究證實，金釵石斛粗多糖及各均一多糖組分都對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病性白內(nèi)障有一定的延緩作用，且各多糖處理組之間差異較大，以粗多糖與DNPW1A的效果最好，呈劑量相關(guān)性。

3.7 其他

金釵石斛多糖還具有其他藥效，如多糖乙酰衍生化物可促進腎上腺嗜鉻細胞瘤PC-12細胞神經(jīng)軸突出的生長，硫酸衍生化物可抑制微血管內(nèi)皮細胞HMEC-1的管腔形成、HMEC-1的遷移以及體內(nèi)血管生成[36]；樊小寶等[80]研究表明，金釵石斛多糖可改善多柔比星腎病大鼠的腎功能和腎纖維化。此外，金釵石斛粗多糖通過拮抗晶狀體氧化損傷，發(fā)揮抗白內(nèi)障的作用[81]；多糖JCP-40對預(yù)防胃黏膜具有保護作用[26]。還可增加脂肪的利用，延緩乳酸的積累，起到抗疲勞作用[82]。

金釵石斛多糖的主要生物活性及其作用機制見圖1。

圖1 金釵石斛多糖的主要生物活性及其作用機制Fig.1 Main bioactivities and mechanisms of polysaccharides from D.nobile

4 結(jié)語

石斛入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，在傳統(tǒng)醫(yī)學中應(yīng)用十分廣泛，被稱為“九大仙草”，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，這與現(xiàn)代研究相近；多糖作為金釵石斛中的主要活性物質(zhì)，藥理研究表明具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗糖尿病、保肝等多方面的藥理活性，無疑將會成為開發(fā)健康產(chǎn)品的最佳原料選擇之一，存在巨大的開發(fā)價值。目前，對金釵石斛多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定、活性評價方面的研究已取得一定進展，但其多糖的結(jié)構(gòu)及質(zhì)量和藥效評價尚存在很多問題。一方面，金釵石斛多糖的提取純化和結(jié)構(gòu)表征分析，是金釵石斛多糖產(chǎn)業(yè)化的重要前提，但金釵石斛的提取、分離純化方法仍不成熟，質(zhì)量控制指標和標準建設(shè)尚不完善，以致最終得到的多糖結(jié)構(gòu)及活性均存在一定的差異；其次，金釵石斛多糖結(jié)構(gòu)的研究不少，但是真正得到一級結(jié)構(gòu)的卻很少，其多糖的結(jié)構(gòu)特征與各種活性之間的構(gòu)效關(guān)系尚只是初步探討，探索金釵石斛多糖的質(zhì)控評價方法和高級結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，加深對其結(jié)構(gòu)及生物活性之間關(guān)系的解析，是未來研究金釵石斛多糖的重點，仍需要大量的研究工作進行補充確定；此外，有關(guān)金釵石斛多糖生物活性的研究，尚處于細胞、器官和組織的初級探索階段，許多目標靶點的分子機制仍然需要深入探討。因此，建立高效穩(wěn)定的分離純化方法和質(zhì)量標準，進一步深入研究金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)特征、藥理活性及其構(gòu)效關(guān)系，將為金釵石斛資源綜合開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)鏈延伸具有重要價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突