師立偉，李美玲，崔秀文，栗孟飛*

1.定西市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，甘肅 定西 743000

2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，具有潤肺下氣和止咳化痰功能，主治新久咳嗽、喘咳痰多和勞嗽咳血[1]。研究發(fā)現(xiàn)，款冬花作為清肺排毒湯中一個(gè)主要藥材，在治療新型冠狀病毒感染的肺炎輕型、普通型和重型患者中發(fā)揮重要作用[2-3]。現(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)表明，款冬花含有多種有效成分，包括倍半萜內(nèi)酯（如款冬酮）、酚類（如綠原酸、阿魏酸和3,4-羥基苯甲酸）、類黃酮（如蘆丁、異槲皮苷和山柰酚）、多糖、生物堿和揮發(fā)油等[4-11]，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌和抗痙攣等作用[10,12-14]。

款冬花主要分布于歐洲、亞洲、南美洲和北非[10,15]，在我國西北部廣泛種植，包括甘肅、陜西、四川、青海省和內(nèi)蒙古自治區(qū)[5,11]，其中甘肅省為主要產(chǎn)區(qū)，2020年種植面積達(dá)1300 hm2，產(chǎn)量約1100 t，占全國總產(chǎn)量的70%～80%?？疃ㄏ矝鏊饕L在潮濕的環(huán)境，干燥環(huán)境也有分布[16]。Dobravalskyte等[17-18]報(bào)道稱，款冬花的化學(xué)成分受生長環(huán)境（如降雨、土壤和陽光）、生長時(shí)期和遺傳特性等多因素的影響。Norani等[7]研究發(fā)現(xiàn)，伊朗7個(gè)不同居群（海拔229～2258 m，降雨量305～1081 mm，年氣溫9.0～16.1 ℃），款冬花花蕾和葉片揮發(fā)油成分、總酚類含量、總黃酮含量和抗氧化能力存在顯著差異。

目前，對我國不同省份和區(qū)域的款冬花質(zhì)量（如綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、款冬酮和多糖）之間的差異已有相關(guān)研究報(bào)道，但多數(shù)僅限于對一個(gè)或多個(gè)化合物進(jìn)行評價(jià)[19-21]。然而，款冬花綜合質(zhì)量優(yōu)劣取決于多種成分[4-11]，因此，基于干質(zhì)量、多種活性物質(zhì)積累和抗氧化能力的款冬花綜合質(zhì)量評價(jià)至關(guān)重要。本研究利用電子天平、分光光度計(jì)和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC），對甘肅省39個(gè)不同居群的款冬花干質(zhì)量、生物活性物質(zhì)含量和抗氧化能力進(jìn)行了測定，采用模糊綜合評價(jià)法（fuzzy comprehensive appraisal method，F(xiàn)CAM）對其進(jìn)行綜合評價(jià)，并對綜合質(zhì)量和生長環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)性分析。該研究結(jié)果將為甘肅省款冬花產(chǎn)量和品質(zhì)提升以及種植栽培規(guī)范化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

款冬花花蕾于2020年12月至2021年1月采自甘肅省39個(gè)不同生態(tài)區(qū)域的野生和栽培植株（表1），花蕾于陰涼通風(fēng)處干燥后，室溫保存，不同區(qū)域款冬花形態(tài)特征見圖1。植株樣品由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院楊德龍教授鑒定為菊科植物款冬T.farfaraL.。

圖1 39個(gè)不同居群款冬花的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of T.farfara from 39 different populations

表1 甘肅省39個(gè)不同居群款冬花來源Table 1 Sources of T.farfara from 39 different populations in Gansu province

2 方法

2.1 綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮的測定

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取2.0 g干燥花蕾，粉碎后置于40 mL無水乙醇具塞三角瓶中，黑暗、室溫120 r/min條件下振蕩提取72 h；然后4 ℃、8000 r/min離心10 min；收集上清液，用無水乙醇定容至40 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮對照品適量，用甲醇配制1 mg/mL溶液，混合后采用逐級稀釋法獲得250.0、50.0、20.0、8.0、3.2、1.28、0.512、0.204 8 μg/mL對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量10 μL，體積流量1.0 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫30 ℃，流動相為乙腈（A）-甲醇（B）-0.1%磷酸（C），梯度洗脫（0～30 min，14% A，86% C；30～31 min，18% A，10% B，72%C；31～36 min，100% B；36～38 min，14% A，86%C）?；旌蠈φ掌泛?9個(gè)樣品代表性色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品 (R) 和39個(gè)樣品的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed references (R) and 39 samples

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測定 將“2.1.2”項(xiàng)對照品溶液等比稀釋成系列溶液，以峰面積（X）對綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮質(zhì)量濃度（Y）進(jìn)行回歸計(jì)算，得到線性方程見表2。將“2.1.1”項(xiàng)的供試品溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜濾過，利用HPLC測定綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮含量[22]。綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮含量按照公式計(jì)算。

表2 綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮回歸方程Table 2 Standard curves of chlorogenic acid, rutin,isoquercitrin and tussilagone

W=(C×V)/(M×1000)

C分別為綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮的質(zhì)量濃度，V為提取液的體積，M為材料干質(zhì)量

2.2 可溶性糖、總黃酮和總酚類成分的測定

采用硫酸-苯酚法[23]測定可溶性糖含量。吸取15 μL提取液，加入1.0 mL 9.0%苯酚溶液，振蕩5 min后，加入3.0 mL濃H2SO4，充分混勻后，在室溫下靜置30 min；在485 nm下測定反應(yīng)液的吸光（A）值，可溶性糖含量以蔗糖為對照品標(biāo)定。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[24-25]測定總黃酮含量。吸取80 μL提取液，加入2.0 mL蒸餾水和0.3 mL 5% NaNO2，混合振蕩5 min后，加入0.3 mL 10% AlCl3，混合振蕩1 min后，加入2.0 mL 1.0 mol/L NaOH，充分混合后，在510 nm下測定反應(yīng)液的A值，總黃酮含量以兒茶素為對照品標(biāo)定。采用福林酚試劑法[25-26]測定總酚類化合物含量。吸取15.0 μL 提取液，依次加入 2.0 mL 10%Folin-Ciocalteu和1.0 mL 7.5% Na2CO3，混合振蕩5 min后，置于水浴鍋中37 ℃避光反應(yīng)1 h，在760 nm下測定反應(yīng)液的A值，總酚類含量以沒食子酸為對照品標(biāo)定。以A值（X）對蔗糖、兒茶素和沒食子酸的量（Y）進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表3）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品蔗糖、兒茶素和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 3 Standard curves of sucrose, catechin and gallic acid

可溶性糖、總黃酮和總酚類含量計(jì)算公式為:

W= (C×V2)/(V1×M×1000)C為化合物的量（μg）；V1為檢測樣品溶液體積（mL），V2為提取液體積（mL），M為材料干質(zhì)量（g）

2.3 抗氧化能力的測定

目前，常采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和鐵離子還原/氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定總抗氧化能力，其具有快速檢測的優(yōu)勢[25-27]。

DPPH參考Nencini等[28]的方法。吸取15.0 μL提取液，加入3.0 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，振蕩5 min后，室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min，在515 nm下測定反應(yīng)液的A值，計(jì)算DPPH抑制率（I），公式為：

I= (A0-A)/A0

A為樣品溶液的吸光度值，A0為不加樣品溶液的吸光度值

FRAP參考Benzie等[29]的方法。分別吸取15.0 μL提取液和參比（FeSO4·7H2O），加入3.0 mL FRAP溶液，振蕩5 min后，37 ℃黑暗條件下反應(yīng)4 min，在593 nm下測定反應(yīng)液的A值，以500 μmol/L Fe2+（FeSO4·7H2O）為參比，計(jì)算公式為：

FRAP= [(A-A0)/(A1-A0)]×500

A為樣品溶液的吸光度值，A0為不加樣品溶液的吸光度值，A1為FeSO4·7H2O溶液的吸光度值

2.4 統(tǒng)計(jì)分析與綜合評價(jià)

2.4.1 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，采用ANOVA Duncan數(shù)據(jù)差異顯著性分析（P＜0.05）；采用Origin 2018軟件制圖。

2.4.2 綜合評價(jià) 采用模糊綜合評價(jià)法[30]對39個(gè)不同地區(qū)款冬花綜合質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，具體公式為：

R(xi)=(xi-xmin)/(xmax-xmin)

R(xi)為隸屬函數(shù)值，xi為i的函數(shù)值，xmin為x的最小值，xmax為x的最大值

D(xi)=∑[R(xi)×Ci]

D(xi)為綜合評價(jià)值，Ci為權(quán)重系數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 不同居群干質(zhì)量的比較

由表4可知，39個(gè)不同居群款冬花花蕾干質(zhì)量（0.08～0.19 g/株）存在顯著性差異，其中5號樣品干質(zhì)量最高（0.19 g），依次為8號樣品（0.17 g）和10號樣品（0.16 g）。

3.2 不同居群綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮含量的比較

由表4可知，39個(gè)居群綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和款冬酮含量也存在顯著性差異。其中，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.68～4.01 mg/g，11號樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（4.01 mg/g），依次為33號樣品（2.64 mg/g）和22號樣品（2.45 mg/g）；蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.07～0.49 mg/g，11號樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（0.49 mg/g），依次為34號樣品（0.47 mg/g）和28號樣品（0.46 mg/g）；異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.07～0.70 mg/g，4號樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（0.70 mg/g），依次為22號樣品（0.55 mg/g）和28號樣品（0.53 mg/g）；款冬酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.49～1.47 mg/g，22號樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（1.47 mg/g），依次為26號樣品（1.32 mg/g）和20號樣品（1.28 mg/g）。

3.3 不同居群可溶性糖、總黃酮和總酚類質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

由表4可知，39個(gè)居群可溶性糖、總黃酮和總酚類質(zhì)量分?jǐn)?shù)也存在顯著差異。其中，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.95～92.17 mg/g，12號樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（92.17 mg/g），依次為20號樣品（74.53 mg/g）和25號樣品（63.74 mg/g）；總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.90～32.80 mg/g，36號樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（32.80 mg/g），依次為18號樣品（31.64 mg/g）和19號樣品（29.59 mg/g）；總酚類質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.32～18.22 mg/g，36號樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（18.22 mg/g），依次為19號樣品（17.24 mg/g）和18號樣品（16.33 mg/g）。

3.4 不同居群抗氧化能力的比較

由于39個(gè)居群活性物質(zhì)含量存在較大的差異，使得其DPPH抑制率和FRAP值也存在顯著差異（表4）。其中，DPPH抑制率25.33%～83.08%，18號樣品抑制率最高（83.08%），依次為15號樣品（81.08%）和13號樣品（76.28%）；FRAP值0.98×104～8.96×104μmol/L，28號樣品值最大（8.96×104μmol/L），依次為36號樣品（8.49×104μmol/L）和18號樣品（8.28×104μmol/L）。

表4 不同居群款冬花干質(zhì)量、生物活性物質(zhì)含量和抗氧化能力的比較Table 4 Comparison of dry weight, bioactive compounds contents and antioxidant capacity of T.farfara among different populations

3.5 不同居群干質(zhì)量、活性物質(zhì)含量和抗氧化能力的綜合評價(jià)

采用FCAM對款冬花干質(zhì)量、7個(gè)主要活性物質(zhì)（綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、款冬酮、可溶性糖、總黃酮、總酚類）含量以及抗氧化能力（DPPH抑制率和FRAP值）進(jìn)行綜合質(zhì)量評價(jià)，結(jié)果見表5。綜合質(zhì)量評價(jià)值（D值）為0.10～0.61，其中，22號樣品（莊浪縣水洛鎮(zhèn)）款冬花D值最高（0.61），依次為28號樣品（積石山縣吹麻灘鎮(zhèn)，D值＝0.57）和18號樣品（成縣小川鎮(zhèn)，D值＝0.56）。

表5 不同居群款冬花干質(zhì)量、活性物質(zhì)含量和抗氧化能力的綜合評價(jià)Table 5 Comprehensive appraisal of dry weight, bioactive compounds contents and antioxidant capacity of T.farfara from different populations

3.6 干質(zhì)量、活性物質(zhì)含量和抗氧化能力與環(huán)境因子關(guān)系的相關(guān)性分析

如表6所示，干質(zhì)量與生長環(huán)境因子（海拔、年平均氣溫和降雨量）有一定的相關(guān)性，但沒有達(dá)到顯著水平。蘆丁、異槲皮苷、總黃酮和總酚類含量與DPPH抑制率和FRAP值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；除異槲皮苷含量與海拔呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其它活性物質(zhì)含量和抗氧化能力與海拔相關(guān)性不顯著；活性物質(zhì)含量和抗氧化能力與年平均氣溫和降雨量呈一定程度的負(fù)相關(guān)。

表6 不同居群款冬花干質(zhì)量、活性物質(zhì)含量和抗氧化能力與環(huán)境因子關(guān)系的相關(guān)性分析Table 6 Correlation of dry weight, bioactive compounds contents and antioxidant capacities with environmental factors of T.farfara from different populations

4 討論

在傳統(tǒng)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，款冬花廣泛用于治療呼吸道感染等相關(guān)疾病，不斷擴(kuò)大的市場需求推動了款冬花的大規(guī)模種植[2-3,7]。雖然前人已開展了環(huán)境條件對活性物質(zhì)積累與抗氧化能力影響等方面的研究[7,17-21]，但對綜合質(zhì)量影響的研究鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，甘肅省39個(gè)不同居群款冬花綜合質(zhì)量存在較大的差異，其中，莊浪縣水洛鎮(zhèn)綜合質(zhì)量最高；研究還發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子對活性物質(zhì)積累和抗氧化能力形成具有一定程度的影響。

很多調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，款冬花在不同的地理環(huán)境下均有分布，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力[5,10-11,15-16]。前人通過對我國4個(gè)省份（甘肅、河北、山西省和內(nèi)蒙古自治區(qū)）11個(gè)不同居群款冬花質(zhì)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)單個(gè)花蕾干質(zhì)量變化幅度較大（0.12～0.18 g）[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，39個(gè)不同居群款冬花單個(gè)花蕾干質(zhì)量最大相差約2.4倍（0.08～0.19 g）。以上結(jié)果表明生長環(huán)境對款冬花生長及干物質(zhì)積累具有顯著影響。

研究已證實(shí)，植物初級和次級代謝產(chǎn)物的積累受環(huán)境因素的調(diào)控[19]。前人研究發(fā)現(xiàn)，我國不同居群款冬花中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、款冬酮和可溶性糖的含量最大分別相差約5.9、7.3、27.3、6.6和2.9倍[19,20,32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，39個(gè)不同居群中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、款冬酮、可溶性糖、總黃酮和總酚類含量最大分別相差約5.9、7.2、10.6、3.0、9.3、3.7和4.2倍，DPPH抑制率和FRAP值最大分別相差約3.3和9.1倍。以上結(jié)果表明生長環(huán)境也對款冬花活性物質(zhì)積累具有顯著影響。

前人對款冬花質(zhì)量的評價(jià)，大多基于一個(gè)或多個(gè)化合物[19-21,32-33]；比如，基于綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、款冬酮和可溶性糖含量分析，隴西縣款冬花質(zhì)量最高[19,21,33]；基于蘆丁含量，靈臺縣款冬花質(zhì)量最高[34]。本研究綜合考慮干質(zhì)量、7個(gè)活性物質(zhì)積累量和體外抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)甘肅省39個(gè)不同居群中，莊浪縣水洛鎮(zhèn)款冬花綜合質(zhì)量最高，其次是積石山縣吹麻灘鎮(zhèn)和成縣小川鎮(zhèn)。報(bào)道稱，不同居群款冬花中揮發(fā)性組分和抗氧化能力的差異是由地理和環(huán)境條件（如海拔、年平均氣溫、降雨量、土壤和光照等）引起[7,18]，本研究發(fā)現(xiàn)，活性物質(zhì)含量和抗氧化能力與年平均氣溫和降雨量呈負(fù)相關(guān)，表明適宜冷涼和干旱的生態(tài)環(huán)境可促進(jìn)款冬花綜合質(zhì)量的形成。因此，為了提升款冬花綜合質(zhì)量，建議在甘肅省范圍內(nèi)優(yōu)選綜合質(zhì)量評價(jià)較高的區(qū)域（如莊浪縣、積石山縣和成縣等），同時(shí)具備冷涼和干旱的環(huán)境條件。

此外，本研究中蘆丁、異槲皮苷、總黃酮和總酚類含量與抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，這與前人報(bào)道的黃酮類和酚類化合物是抗氧化能力形成的主要成分的結(jié)果一致[27,35-36]。盡管本研究分析了款冬花質(zhì)量與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，但對環(huán)境因子如何調(diào)控代謝物生物合成與積累等方面的研究還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突