劉 俊 ，李 龍，吳耀松，劉 燕，任閃閃，陳玉龍*

1.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院 河南省中醫(yī)方證信號傳導重點實驗室，河南 鄭州 450046

2.西北農林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100

3.國際竹藤中心 國家林業(yè)和草原局竹藤科學與技術重點開放實驗室，北京 100102

4.國際竹藤中心 安徽太平試驗中心，安徽 黃山 245716

TCP（Teosinte branched 1/Cycloidea/ Proliferating）蛋白一般由60個氨基酸組成，含有一個非典型的基本螺旋（bHLH）結構和R結構域[1]，分為Class I和Class II 2個亞家族，Class I又稱為PCF，Class II進一步劃分為CIN和CYC/TB1亞家族[2]。TCP轉錄因子參與植物胚胎發(fā)育[3]、側枝形成[4-5]、開花調控[6]、脅迫響應[7]以及激素信號[5]等生物學過程。

TB1和TB1-like蛋白屬于CYC/TB1亞家族，抑制擬南芥分枝發(fā)育[8]。AtTCP4通過誘導脂肪氧化酶（LIPOXYGENASE2）基因表達，促進茉莉酸（JA）生物合成和成熟葉片衰老[9]，在花器官中AtTCP4抑制LIPOXYGENASE2基因表達[10]。AtTCP4通過靶向生長素生物合成酶基因YUCCA5調控生長素生物合成[11]，AtTCP14是PCF亞家族成員，在種子萌發(fā)過程中發(fā)揮負調控作用[12]。毛竹PeTCP10通過脫落酸（ABA）依賴信號在抗旱中發(fā)揮正調控作用，以茉莉酮酸甲酯（Me-JA）介導途徑負調控側根生長[13]。OsPCF2通過正調控NHX1影響水稻耐鹽性[14]，OsCP21和OsPCF6是microRNA319的靶基因，在冷脅迫中發(fā)揮正調控作用[15]。在擬南芥中超表達OsTCP19誘導IAA3、ABI3、ABI4上調表達，LOX2下調表達，導致側根數(shù)目減少，提高轉基因植株脅迫耐受性[16]。

杜仲Eucommia ulmoidesOliver是我國特有單科、單屬、單種的多年生第三紀孑遺樹種，雌雄異株，具有橡膠和藥材的雙重性質[17]。廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)，適應能力強，在酸性或鹽堿性的貧瘠土壤中均能生長良好[18]。其樹皮、葉片及種子均可入藥，富含多種活性成分，對多種疾病的預防及提高人體免疫力具有顯著的效果，是我國二級珍稀保護植物。目前，對杜仲的研究與利用多局限于資源收集、藥理學及形態(tài)學研究，分子遺傳學方面的報道相對較少，嚴重制約了杜仲分子育種及相關生物學特性研究。目前TCP轉錄因子已在多個物種中進行了研究，然而杜仲TCP基因家族還未報道，本研究以杜仲基因組數(shù)據(jù)[19]為基礎，從基因組水平對TCP基因家族進行鑒定、理化性質、進化關系、保守基序以及表達模式分析，以期為進一步探索杜仲TCPs基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 杜仲TCP基因家族鑒定及理化性質分析

從杜仲基因組數(shù)據(jù)庫Genome Warehouse（https://bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/13/show）中下載TCP蛋白候選序列，利用NCBI的（Conserved Domain Search Service（CD Search））分析蛋白結構域，保留含有完整bHLH結構域的序列。通過在線軟件ProtParam （http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白理化性質，使用Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/） 預 測EuTCPs蛋白亞細胞定位，利用在線工具ExPASY（https://www.expasy.org/tools）預測EuTCPs氨基酸數(shù)量、相對分子質量、理論等電點，通過Expasy（https://web.expasy.org/protscale/）軟件分析蛋白的親疏水性，利用 SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）和 Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi?id=index)軟件分別預測蛋白的二級結構和三級結構。

1.2 杜仲TCPs蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構建

通過Clustal X1.83軟件對杜仲、水稻、擬南芥和毛竹TCPs氨基酸序列進行多序列比對，利用MEGA 6.0的鄰接法（neighbor-joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復次數(shù)設置為1000次，其他參數(shù)為默認值[20]。

1.3 保守基序及啟動子分析

通過MEME（http://meme-suite.org/）在線軟件對EuTCP基因家族成員進行基序分析（參數(shù)是：any number of Repetitions（anr），maximum number of Motifs＝10，minimum width≥6，and maximum width ≤50）。為了解析EuTCPs啟動子區(qū)域順勢作用元件，對EuTCPs基因ATG上游2000 bp序列進行查找分離，利用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/）軟件進行啟動子順勢作用元件分析。

1.4 杜仲EuTCP基因家族表達模式分析

從NCBI的Short Read Arshive（SRA）數(shù)據(jù)庫中下載杜仲葉片不同發(fā)育時期（葉芽、初生葉、幼葉、老葉）（版本號：SRP218063）[21]及不同膠含量（低含量、高含量）（版本號：SRP158357）[22]轉錄組數(shù)據(jù)，EuTCPs基因相對表達豐度用FPKM值表示，對該數(shù)值取對數(shù)進行統(tǒng)計分析，通過MeV4-9-0工具繪制基因表達圖譜，表達量最高的用綠色方框表示，表達量最低的用黃色方框表示。

1.5 杜仲TCPs蛋白互作網(wǎng)絡預測

利用STRING軟件（https://string-db.org/）上傳EuTCPs蛋白序列，選擇擬南芥數(shù)據(jù)庫進行序列比對，根據(jù)已知擬南芥蛋白互作關系，通過Blast比對杜仲同源蛋白，通過Cytoscape 3.7.0軟件對EuTCP基因家族蛋白互作信息進行評估和預測[23]。

2 結果與分析

2.1 杜仲TCP基因家族鑒定及理化性質分析

通過Genome Warehouse數(shù)據(jù)庫，從杜仲基因組中共鑒定到14個EuTCPs基因（表1），利用Pfam和NCBI的Conserved Domain Search在線分析軟件對EuTCPs蛋白進行結構域驗證。結果顯示，14個EuTCPs蛋白均含有非典型的bHLH（BASIC、HELIX I、LOOP和HELIX II）特征結構域，分別命名為EuTCP1～EuTCP14。使用ExPASy工具，對EuTCP家族成員進行蛋白質理化性質分析，EuTCP14蛋白最長，編碼492個氨基酸，EuTCP13蛋白最短，編碼139個氨基酸，相對分子質量分布區(qū)域為18 880～53 620，等電點范圍是5.54（EuTCP14）到9.72（EuTCP6）。亞細胞定位預測結果顯示，EuTCPs均定位在細胞核中（表1）。

表1 杜仲TCP蛋白序列特征及亞細胞定位預測Table 1 Amino acid sequence characteristics and predicted subcellular location of E.ulmoides TCP proteins

2.2 杜仲TCPs蛋白結構分析

二級結構分析顯示，EuTCPs蛋白主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉角組成，順序均是由無規(guī)則卷曲＞α螺旋＞延伸鏈＞β轉角，具體數(shù)值見表2。α螺旋在DNA結合基序中發(fā)揮重要作用，無規(guī)則卷曲易受側鏈相互作用，構成活性部位和功能部位。EuTCPs蛋白三級結構非常相似，結果如圖1所示，無規(guī)則卷曲所占比例最大，蛋白空間結構不同，決定功能的差異。

圖1 杜仲TCPs三級結構預測Fig.1 Tertiary structure prediction of E.ulmoides TCPs

表2 杜仲TCP基因家族二級結構分析Table 2 Secondary structures analysis of E.ulmoides TCP gene family

2.3 杜仲TCPs蛋白系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 6.0分析軟件，對14個杜仲EuTCPs，22個水稻OsTCPs[24]，24個擬南芥AtTCPs[25]和19個毛竹PheTCPs[26]蛋白進行1000次重復搜索，構建系統(tǒng)進化樹。結果如圖2所示：79個TCPs蛋白分為Class I和Class II 2個大亞家族，其中Class I又稱為PCF亞家族；Class II亞家族進一步劃分為CYC/TB1和CIN亞家族。PCF亞家族所包含TCPs成員數(shù)量最多，含有40個TCPs蛋白，5個EuTCPs，13個AtTCPs，10個OsTCPs和12個PtTCPs，其次是CIN亞家族，由29個TCPs蛋白組成，CYC/TB1亞家族所含蛋白數(shù)量最少，僅包含10個TCPs蛋白，3個AtTCPs，3個EuTCPs，3個OsTCPs，1個PheTCPs。

圖2 杜仲、水稻、擬南芥和毛竹TCPs蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of TCP proteins from E.ulmoides, rice, Arabidopsis and moso bamboo

2.4 杜仲TCPs結構域序列分析

為了分析杜仲TCP轉錄因子家族保守結構域序列特征，利用DNAMAN7.0工具對杜仲、擬南芥和水稻TCP家族成員氨基酸序列進行比對，結果如圖3所示，杜仲TCP結構域氨基酸分布與擬南芥和水稻十分相似，14個杜仲TCP家族成員均含有完整的非典型性bHLH結構域，暗示杜仲TCP結構域高度保守性。BASIC區(qū)域由19個氨基酸組成，其中有9個氨基酸是高度保守的，HLH區(qū)域含有5個高度保守的氨基酸。杜仲TCP轉錄因子家族有5個蛋白（EuTCP1、EuTCP4、EuTCP6、EuTCP10和EuTCP12）BASIC區(qū)域缺少4個氨基酸，圖2系統(tǒng)進化樹結果顯示，他們均屬于Class I亞家族，其余蛋白均屬于Class II亞家族，這與前人研究結果相一致[2]，表明杜仲TCP轉錄因子家族進化的保守性。

圖3 擬南芥、水稻和杜仲TCP蛋白保守結構域氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of amino acid sequences in conserved domains from members of TCP proteins of Arabidopsis, rice, and E.ulmoides

2.5 杜仲TCP轉錄因子家族基序分析

為了解析EuTCPs基因結構多樣性和進化關系，利用MEME在線軟件對EuTCPs轉錄因子家族進行基序分析。結果如圖4所示，EuTCPs轉錄因子分為3個亞家族（PCF、CYC/TB1和CIN），進化關系與圖2結果相一致，20個保守基序，分別命名為Motif 1～Motif 20，14條EuTCPs蛋白均含有Motif 1基序，表明均屬于TCP轉錄因子家族。同一亞家族EuTCPs蛋白基序具有高度相似性，CIN亞家族均含有Motif 1和Motif 2，PCF亞家族成員均含有Motif 1和Motif 19，表明同一亞家族EuTCPs可能具有相似的功能。不同亞家族基序存在顯著差異，有些Motifs只在特定亞家族中存在，例如，Motif 3～Motif 6只存在于PCF亞家族，只有CYC/TB1亞家族含有Motif 7和Motif 9，暗示某些基序在亞家族功能特異性方面發(fā)揮重要作用。

圖4 EuTCPs蛋白保守基序分析Fig.4 Conservative motif analysis of EuTCP proteins

2.6 杜仲TCPs啟動子順式作用元件分析

為了探索EuTCPs基因功能和表達調控模式，利用Plant CARE在線分析軟件對EuTCPs起始密碼子（ATG）上游2000 bp序列進行順式作用元件分析，結果如圖5所示，EuTCPs啟動子中不僅含有基本順式作用元件，還存在4種類型元件：（1）激素調控元件，如赤霉素響應元件ABRE；生長素響應元件 AuxRR-core；水楊酸響應元件CGTCA-motif；（2）光響應元件，如Box 4、G-box、G-Box、GT1-motif、GATA-motif等；（3）脅迫響應元件，如干旱脅迫響應元件MBS，低溫響應元件：LTR和厭氧脅迫相關元件ARE等；（4）生理響應元件，如O2-site、CAT-box等，推測EuTCPs可能在杜仲生長發(fā)育、脅迫響應、激素調節(jié)以及光周期調控中發(fā)揮重要作用。EuTCPs基因中光響應元件數(shù)量最多，共有135個，其中G-box元件有38個，含有28個Box 4元件，暗示EuTCPs基因的轉錄可能受光周期調控。EuTCPs啟動子區(qū)域含有44個ABRE元件和25個ARE元件（圖5-B），表明EuTCPs可能參與ABA調節(jié)和厭氧調控。

圖5 EuTCPs啟動子順式作用元件分布Fig.5 Cis-elements distributed in promoters of EuTCPs

2.7 杜仲TCP基因家族表達模式分析

為了解析EuTCPs基因在杜仲葉片不同發(fā)育時期及膠形成中的功能，根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)，檢測EuTCPs基因的表達模式（圖中顯示基因編號與文章中基因命名一致）。結果如圖6、7所示，不同EuTCPs基因在杜仲葉片不同發(fā)育時期及膠含量中表達豐度存在顯著差異，大部分EuTCPs基因在杜仲葉片發(fā)育時期表達豐度較低，有2個EuTCPs基因（EuTCP11和EuTCP14）在杜仲葉片中未檢測到，推測EuTCP11和EuTCP14在杜仲葉片中不發(fā)揮作用。EuTCPs基因在杜仲葉片不同發(fā)育時期表達趨勢不盡相同，暗示EuTCPs在杜仲葉片發(fā)育中具有不同的功能，5個基因（EuTCP1、EuTCP7、EuTCP8、EuTCP9、EuTCP13）在杜仲葉芽中表達量最高，4個（EuTCP2、EuTCP3、EuTCP6、EuTCP12）基因在初生葉中表達豐度最高，3個基因（EuTCP4、EuTCP5和EuTCP10）在老葉中轉錄水平最高。

圖6 EuTCPs基因在杜仲葉片不同發(fā)育時期的表達模式Fig.6 Expression patterns of EuTCPs genes at different development stages of E.ulmoides leaves.

為了預測EuTCPs在杜仲膠形成中的功能，利用不同膠含量的轉錄組數(shù)據(jù)，檢測EuTCPs基因的轉錄水平。結果如圖7所示，大部分EuTCPs在杜仲不同膠含量中表達水平較低，并且低膠含量葉片中的轉錄水平低于高膠含量葉片，例如：EuTCP10在高膠含量葉片中的FPKM平均值是17.25，在低膠含量葉片中為7.26，EuTCP4在高膠含量中的轉錄水平是24.26，在低膠中為5.05，推測EuTCPs在杜仲膠形成過程中發(fā)揮正調控作用。

圖7 EuTCPs基因在杜仲不同膠含量葉片中的表達模式Fig.7 Expression pattern of EuTCPs genes in leaves with different gum content

2.8 杜仲TCPs蛋白互作網(wǎng)絡預測

表達模式結果顯示，EuTCP3在杜仲葉片不同發(fā)育階段和膠含量中表達量均較高，特別在初生葉中，F(xiàn)PKM值為111，暗示EuTCP3在杜仲葉片發(fā)育和膠形成過程中發(fā)揮重要作用。為了檢測EuTCP3與其他蛋白的互作關系，利用STRING數(shù)據(jù)庫，預測EuTCP3的互作蛋白。結果如圖8所示，EuTCP3可以與10個蛋白發(fā)生相互作用，其中7個屬于EuTCP基因家族，參與種子萌發(fā)、生物鐘調節(jié)、細胞周期以及蛋白轉錄調控。MYB-like轉錄因子，在發(fā)育種子的原花青素積累中發(fā)揮關鍵的決定性作用，LOB轉錄因子AS2，是葉片正面細胞增殖負調控因子，調節(jié)葉片對稱層的形成和脈絡的建立，AN1-like（SAP11）鋅指蛋白，參與植物非生物脅迫響應[27]，推測EuTCP3可能與其他蛋白相互作用共同參與杜仲葉片生長發(fā)育以及脅迫響應。

圖8 EuTCP3蛋白互作網(wǎng)絡Fig.8 Interaction network of EuTCP3

利用Cytoscape 3.7.0軟件，構建EuTCP轉錄因子家族共表達調控網(wǎng)絡。結果如圖9所示，調控網(wǎng)絡中共有11個節(jié)點（代表EuTCPs蛋白）和35條邊（代表蛋白質之間的相互作用），表明14個EuTCPs中有11個蛋白存在互作關系，其中EuTCP3、EuTCP5和EuTCP8蛋白互作數(shù)量最多，均與8個EuTCPs蛋白存在互作關系，暗示EuTCP3、EuTCP5、EuTCP8可能處于EuTCP基因家族核心位置，EuTCP1、EuTCP10、EuTCP11和EuTCP14與7個EuTCPs蛋白互作，EuTCP4和EuTCP6預測與5個EuTCPs蛋白互作，EuTCP7與4個EuTCPs蛋白互作，EuTCP9與2個EuTCPs蛋白發(fā)生互作關系。

圖9 EuTCP基因家族蛋白互作預測Fig.9 Prediction of protein interactions between EuTCP gene family

3 討論

杜仲是絞木目（Garryales）杜仲科（Eucommiaceae）杜仲屬EucommiaL.中唯一現(xiàn)存的一個種，是我國主要天然橡膠樹種，也是重要的木本油料和名貴中藥材[28]，藥理作用廣泛[29]，主要分布于我國的陜西、湖南、貴州、云南、四川、江西等地區(qū)[30]。TCP蛋白是植物特有的參與生長發(fā)育、非生物脅迫、葉片衰老、側枝形成、花粉發(fā)育等多種生物學過程的一類轉錄因子[13,31]。目前為止，TCP基因家族已在多個物種中進行了報道，擬南芥中有24個AtTCPs[25]，水稻含有22個OsTCPs[24]，玉米中存在29個ZmTCPs成員[32]，棉花中包含38個GrTCPs[33]，番茄中有30個SlTCPs[34]，黃瓜中存在22個CsTCPs[35]，柑橘中含有20個CsTCPs[36]，西瓜中有27個ClTCPs[37]，葡萄中包含18個VvTCPs[38]，蘋果中52個MdTCPs[39]，菠蘿中有9個[40]、毛竹中存在19個PheTCPs[26]等。本研究以杜仲基因組數(shù)據(jù)為基礎，利用生物信息學方法，從杜仲基因組中共鑒定到14個EuTCPs基因，分為3個亞家族，這與前人研究結果相一致。PCF亞家族包含5個EuTCPs蛋白，CYC/TB1亞家族含有3個，6個EuTCPs蛋白屬于CIN亞家族。序列比對結果顯示，14個EuTCPs與擬南芥、水稻TCP蛋白結構域具有高度的相似性，N末端均含有非典型的basic-helix-loop-helix結構域（圖3），基序分析發(fā)現(xiàn)，Motif 1基序存在于所有EuTCPs轉錄因子（圖4），表明他們均屬于TCP轉錄因子家族，在基因進化過程中具有較保守性。根據(jù)保守結構域是否含有4種氨基酸殘基，將TCP基因家族分為2個亞家族，Class I亞家族保守結構域含有16個氨基酸殘基，Class II亞家族TCP結構域包含20個氨基酸，保守結構域外含有促進蛋白質相互作用的精氨酸富集R結構域[1]，EuTCP3、EuTCP5、EuTCP7和EuTCP9均含有motif 8（R結構域），與AtTCPs、OsTCPs[24]、BpTCPs[41]、VvTCPs[37]、PmTCPs[42]和FvTCPs[43]等具有相似性，推測EuTCP3、EuTCP5、EuTCP7和EuTCP9可能具有相似的功能。

聚類分析結果顯示，EuTCP4與AtTCP20聚為同一分支，AtTCP20參與調節(jié)擬南芥細胞擴張、分裂和分化，在硝酸鹽誘導的系統(tǒng)信號通路中發(fā)揮重要作用[44]，菊花CmTCP20為AtTCP20的同源基因，超表達CmTCP20增加轉基因菊花和擬南芥的側根數(shù)量和長度[45]。EuTCP10是AtTCP14的同源基因，AtTCP14主要在胚胎維管組織中表達，促進幼嫩節(jié)間細胞增殖，抑制葉片細胞擴增，attcp14突變體提高種子萌發(fā)對外源脫落酸和多效唑的敏感性，AtTCP14參與激活擬南芥胚胎生長[46]，CmTCP14異源轉化擬南芥導致細胞周期相關基因下調表達，抑制器官大小，葉綠素和類胡蘿卜素含量升高，延長花期，延緩葉片衰老[47]。EuTCP6和EuTCP12聚為同一分支的AtTCP7、AtTCP8、AtTCP21、AtTCP22和AtTCP23均在擬南芥幼嫩葉片中表達，與野生型相比，attcp23突變體增加葉片面積，tcp8-1、tcp15-1、tcp22-1、tcp23-1四重突變體和tcp8-1、tcp15-1、tcp22-1、tcp23-1、tcp21-1五重突變體蓮座葉數(shù)目減少，葉片增大[48]。EuTCP14為AtTCP4的同源基因，AtTCP4在幼苗子葉中表達，激活SAUR16和SAUR50的光響應表達，通過光敏色素相互作用因子（PIFs）調節(jié)AtTCP4與SAUR14、SAUR16和SAUR50啟動子的結合，黑暗條件下PIF3抑制AtTCP4與上述啟動子的結合[49]。AtTCP4與CONSTANS（CO）啟動子結合，黃昏前后誘導CO基因表達，AtTCP4與細胞核中另一個開花調節(jié)因子GIGANTEA（GI）結合，誘導CO以GI依賴方式表達，調節(jié)發(fā)育和開花調控[50]。EuTCP3與AtTCP2互為同源基因，超表達AtTCP2導致轉基因擬南芥在光依賴條件下下胚軸矮小，特別是藍光條件下，AtTCP2與隱花色素蛋白（CRY1）互作，正調控HYH和HY5基因表達[51]。AtTCP17與EuTCP3親緣關系最近，AtTCP17在陰暗條件下顯著積累，AtTCP17及其同源基因AtTCP5和AtTCP13通過PIF依賴和獨立途徑誘導生長素生物合成，在介導陰暗誘導下胚軸伸長中發(fā)揮重要作用。白光下，tcp5、tcp13、tcp17三重突變體（3tcp）表現(xiàn)出下胚軸缺陷；陰暗條件顯著降低3tcp下胚軸伸長，TCP17與PIFs和YUCCAs的啟動子結合，誘導生長素表達[52]，推測EuTCPs轉錄因子在杜仲生長發(fā)育、激素調節(jié)和開花調控中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究以杜仲全基因組數(shù)據(jù)為背景，對杜仲TCP轉錄因子家族進行了全面的生物信息學分析，共鑒定出14個EuTCPs，分為Class I與Class II 2大類，進一步劃分為3個亞家族（PCF、CYC/TB1和CIN）。理化性質分析顯示，EuTCPs編碼139～492個氨基酸，理論等電點分布于5.54～9.72，相對分子質量為18 880～53 620，亞細胞定位于細胞核中，均為親水性蛋白，二級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，均含非典型bHLH保守結構域。表達模式分析顯示，EuTCPs基因家族在杜仲葉片發(fā)育中具有不同的表達模式，EuTCPs在高膠含量中的轉錄水平高于低膠含量，推測EuTCPs在杜仲膠形成中發(fā)揮正向調控作用，本研究為深入探索EuTCPs基因功能奠定理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突