邢丙聰 ，蘇立樣 ，萬思琦 ，邵清松 *

1.浙江省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300

2.浙江農(nóng)林大學(xué)中藥學(xué)科，浙江 杭州 311300

金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，全草可入藥，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕等功效[1]。在自然條件下，金線蓮生長緩慢、結(jié)實(shí)率低、種子敗育現(xiàn)象嚴(yán)重、幼苗存活率低等原因?qū)е乱吧鹁€蓮種群規(guī)模急劇收縮，瀕臨滅絕[2-3]。金線蓮種子自然繁殖率極低，種子細(xì)小且種胚形態(tài)結(jié)構(gòu)不健全，并且種子必須與菌根真菌共生，將種子胚細(xì)胞中的淀粉轉(zhuǎn)化為糖，才能萌芽生長[4-6]。近年來，許多學(xué)者對(duì)金線蓮人工栽培進(jìn)行研究，在種苗培育、組培苗移栽、設(shè)施栽培等關(guān)鍵技術(shù)上取得突破性進(jìn)展，但是關(guān)于生殖發(fā)育分子生物學(xué)方面研究較少報(bào)道。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。WRKY轉(zhuǎn)錄因子因具有保守的“WRKYGQK”序列而被簡稱為“WRKY”[7]。WRKY已經(jīng)被證實(shí)在調(diào)控植物種子的形成、發(fā)育及萌發(fā)等方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，AtWRKY34與其同源蛋白AtWRKY2是擬南芥花粉發(fā)育所必需的。若WRKY34在花粉發(fā)育的早期階段沒有被蛋白激酶MPK3和 MPK6磷酸化，擬南芥花粉發(fā)育和花粉管生長等功能都會(huì)受到損害[8]。編碼AtWRKY10的MINI3和編碼LRR受體激酶的IKU2共同正調(diào)控了擬南芥種子的大小和胚乳的發(fā)育[9]。AtWRKY43能促進(jìn)擬南芥種子內(nèi)脂肪物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類從而供給發(fā)芽所需的能量消耗，增強(qiáng)種子的發(fā)芽能力[10]。AtTTG2則能調(diào)控?cái)M南芥種皮的發(fā)育[11]。葡萄中的VvWRKY20對(duì)葡萄胚珠的發(fā)育至關(guān)重要，VvWRKY20的缺失會(huì)導(dǎo)致種子前體——胚珠的敗育[12]。Xiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在谷子中編碼一種第一亞族WRKY轉(zhuǎn)錄因子的lp1基因突變會(huì)導(dǎo)致谷子種子變大。水稻中的OsWRKY78也與水稻種子大小的發(fā)育有關(guān)，抑制OsWRKY78的表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞長度減小從而使種子變小[14]。棉花中GhWRKY22能通過調(diào)節(jié)JAZ基因的表達(dá)來影響雄性花粉的發(fā)育[15]；而GhWRKY17調(diào)控了棉花種子的發(fā)芽能力[16]。人參中的PgWRKY3參與種子的后熟過程[17]。金釵石斛中的DnWRKY11則可增強(qiáng)其種子的抗逆性[18]。目前，在金線蓮中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。

本研究利用Illumina結(jié)合PacBio技術(shù)對(duì)金線蓮轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，首次篩選得到23條ArWRKY序列，分別命名為ArWRKY1～ArWRKY23。通過qRT-PCR檢測分析，發(fā)現(xiàn)ArWRKY5與ArWRKY20在金線蓮花中顯著高表達(dá)，推測兩者在花的發(fā)育過程中扮演了重要的角色。最后，本課題組克隆得到2條基因的CDS序列，為其功能進(jìn)一步驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

材料購自浙江金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)胡潤淮教授鑒定為金線蓮A.roxburghii(Wall.) Lindl.組培苗。

RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；AxyPrepTM DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、pMD19-T載體、PrimeSTAR Max DNA Polymerase試劑盒、DNA Marke均購自TaKaRa公司（日本）；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、氨芐青霉素均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂粉購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 樣品處理

將已馴化過的金線蓮組培苗洗凈培養(yǎng)基，移栽至浙江農(nóng)林大學(xué)百草園試驗(yàn)基地，栽培基質(zhì)為泥炭-河沙-花生殼4∶2∶2（體積比）[19]。待生長穩(wěn)定后隨機(jī)采摘5～6株分為根、莖、葉3部分迅速放入液氮速凍，并送往上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，3次生物學(xué)重復(fù)。

2.2 ArWRKY的生物信息學(xué)分析

利用 MEME在線網(wǎng)站（http://meme-suite.org/tools/meme）預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域，得到結(jié)構(gòu)域蛋白序列，并拼接得到ArWRKY核心序列；利用Clustal W對(duì)核心序列進(jìn)行多序列比對(duì)；使用MEGA7 NJ法（bootstrap 1000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化特性。

2.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

按照TIANGEN的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說明書提取金線蓮總RNA，并檢測RNA的完整性與濃度，合格后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明書合成cDNA第1鏈。

2.4 ArWRKY表達(dá)模式分析

分別收集金線蓮葉芽期和花芽期的花及開花期的花、根、莖和葉提取金線蓮總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用做測量基因表達(dá)量的模板。以金線蓮Actin（ArActin）為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR檢測ArWRKY1、ArWRKY5、ArWRKY6、ArWRKY8、ArWRKY9、ArWRKY11、ArWRKY13、ArWRKY19、ArWRKY20與ArWRKY23的時(shí)空表達(dá)模式（引物序列見表1）。qRT-PCR反應(yīng)體系見表2。

表1 金線蓮ArWRKY和ArActin的qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences of ArWRKY and ArActin

表2 熒光定量PCR反應(yīng)液Table 2 RT-qPCR reaction liquid

以開花期的根為對(duì)照，采用相對(duì)定量法2?△△Ct計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 23軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，Duncan與LSD分析法檢測進(jìn)行顯著性分析，字母標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記。

2.5 ArWRKY5與ArWRKY20基因擴(kuò)增與測序

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Unigenes序列設(shè)計(jì)上下游引物（序列見表3）。以金線蓮cDNA為模板進(jìn)行序列擴(kuò)增。ArWRKY5序列擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃、3min，98 ℃、10 s，55 ℃、5 s，72 ℃、1.2 min，30個(gè)循環(huán)。ArWRKY20序列擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃、3 min，98 ℃、10 s，55 ℃、5 s，72 ℃、0.7 min，30個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，選擇正確大小的凝膠片段進(jìn)行切膠回收。

表3 基因克隆引物Table 3 Cloning primers of genes

將膠回收產(chǎn)物連接為pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，并在含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上倒置培養(yǎng)12～16 h，挑選陽性菌落送往浙江有康生物科技有限公司測序。

2.6 ArWRKY5與ArWRKY20的生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站（https://www.detaibio.com/tools/signal- peptide.html）預(yù)測信號(hào)肽；利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/）預(yù)測蛋白的糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)和蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)；利用ExPasy-ProtScale（https:// web.expasy.org/ protscale/）分析蛋白親/疏水性。分別采用GOR4（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）和SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與分析

3.1 ArWRKY的生物信息學(xué)分析

從金線蓮中篩選得到23條ArWRKY序列，分別命名為ArWRKY1～ArWRKY23。根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白結(jié)構(gòu)特征將23條ArWRKY分為3類：其中ArWRKY6和ArWRKY11具有2個(gè)WRKY域，屬于第I類；ArWRKY8、ArWRKY14和ArWRKY23具有1個(gè)WRKY域，所含的鋅指結(jié)構(gòu)為C2-HC（C-X7-C-X23-H-X-C），屬于第III類；其他18個(gè)家族成員具有一個(gè)WRKY域，所含鋅指結(jié)構(gòu)為C2-H2（C-X4-5-C-X22-23-HXH），屬于第II類（圖1）。ArWRKY蛋白序列氨基酸長度從100個(gè)到623個(gè)不等，蛋白大小最小為11 445.87，最大為66 584.31。ArWRKY所含的保守結(jié)構(gòu)域基序除了常見的WRKYGQK，還含有WRKYGKK、WRKYGRV或WRKYGEK（表4）。

表4 ArWRKY蛋白信息Table 4 ArWRKY protein information

圖1 ArWRKY核心序列比對(duì)圖Fig.1 ArWRKY core sequence alignment diagram

為了解ArWRKY的保守結(jié)構(gòu)域信息，運(yùn)用MEME在線網(wǎng)站預(yù)測保守基序，設(shè)置了5個(gè)保守域（Motif）為條件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。Motif 1與Motif 3雖屬于不同的保守基序，但均含有“WRKY”4個(gè)氨基酸殘基，且所有ArWRKY中均含Motif 1或Motif 3，說明在ArWRKY中，色氨酸（W）、精氨酸（R）、賴氨酸（K）和酪氨酸（Y）是核心序列中必不可少的，這也符合WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征與命名規(guī)則。Motif 1和Motif 3屬于不同結(jié)構(gòu)域暗示著在含有2個(gè)WRKY域的第一類ArWRKY中，2者可能具有不同的功能。通過分析可以發(fā)現(xiàn)Motif 2與Motif 4屬于鋅指結(jié)構(gòu)，大部分ArWRKY中Motif 2與Motif 4共同存在，且Motif 4在Motif 2的下游，也符合WRKY轉(zhuǎn)錄因子中鋅指結(jié)構(gòu)的構(gòu)造。Motif 5同樣是鋅指結(jié)構(gòu)，但只在ArWRKY6與ArWRKY11這2個(gè)第I類WRKY中出現(xiàn)，且分布在Motif 3的下游，說明在ArWRKY中每一段保守序列WRKY的下游可能都存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與之對(duì)應(yīng)。但在ArWRKY2、ArWRKY10、ArWRKY18和ArWRKY21中只存在WRKY保守序列卻沒出現(xiàn)鋅指結(jié)構(gòu)，可能是由于蛋白序列不完整造成的。另外，ArWRKY14所含有的鋅指結(jié)構(gòu)為C-X7-C- X24-H-X-C，與文獻(xiàn)報(bào)道的C2-HC類型為C-X7-C-X23-H-X-C構(gòu)造相差1個(gè)氨基酸殘基。

圖2 ArWRKY保守域預(yù)測Fig.2 ArWRKY conservative domain prediction

為了進(jìn)一步篩選可能參與金線蓮胚胎發(fā)育的ArWRKY，利用NCBI數(shù)據(jù)庫下載得到其他物種中已經(jīng)報(bào)道的對(duì)種子形成、發(fā)育或萌發(fā)等方面具有調(diào)控作用的WRKY蛋白：AtWRKY2（NP_200438.1）、AtWRKY34（NP_194374.1）、AtWRKY43（AEC10646.1）、AtWRKY30（NP_568439.1）、AtWRKY10（NP_175956.1）、TTG_X1（NP_181263.2）、TTG_X2（ NP_001078015.1）、 TTG_X3（NP_001323504.1）；GhWRKY22（AIE43820.1）、GhWRKY17_X1（AIE43818.1）、GhWRKY17_X2（AJT43302.1）、GhWRKY17_X3（ADW82100.1）；VvWRKY20_X1（XP_010647039.1）、VvWRKY20_X2（ XP_019074038.1） 、 VvWRKY20_X3（ XP_019074039.1） 、 VvWRKY20_X4（XP_010647041.1）、VvWRKY30（ALM96663.1）；OsWRKY78（ DAA05640.1）； ThWRKY7（AFS64072.1）；CsWRKY71（NP_001292668.1）；TaWRKY71（ ABN43177.1）； PcWRKY33（AYN74370.1）。

采用MAGA 7.0軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ArWRKY可以聚為3大類，第1大類為ArWRKY2、ArWRKY12、ArWRKY14、ArWRKY18與ArWRKY22；第2大類為ArWRKY3、ArWRKY4、ArWRKY6、ArWRKY8、ArWRKY11、ArWRKY15與ArWRKY20，其余ArWRKY為第3類。同時(shí)大部分ArWRKY與已報(bào)道的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在基因家族的進(jìn)化起源和基因重復(fù)上比較相近，具有相近起源的蛋白往往具有較為相似的結(jié)構(gòu)與較為相近的功能作用，因此，綜合考慮了系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支情況及ArWRKY基因CDS序列的完整性，篩選得到ArWRKY1、ArWRKY5、ArWRKY6、ArWRKY8、ArWRKY9、ArWRKY11、ArWRKY13、ArWRKY19、ArWRKY20與ArWRKY23用于后續(xù)的研究。

圖3 ArWRKY系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 ArWRKY phylogenetic tree

3.2 ArWRKY的時(shí)空表達(dá)分析

利用qRT-PCR對(duì)ArWRKY1、ArWRKY5、ArWRKY6、ArWRKY8、ArWRKY9、ArWRKY11、ArWRKY13、ArWRKY19、ArWRKY20與ArWRKY23基因在金線蓮不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位的表達(dá)量進(jìn)行檢測（圖4），進(jìn)一步確定ArWRKY可能存在的功能，以篩選與金線蓮胚胎發(fā)育相關(guān)的基因。通過時(shí)空特異性表達(dá)分析可以發(fā)現(xiàn)，10條ArWRKY在金線蓮不同部位及不同時(shí)期的花中均有表達(dá)，但表達(dá)模式不盡相同。ArWRKY1、ArWRKY6、ArWRKY9、ArWRKY11與ArWRKY20的表達(dá)量隨著金線蓮花的發(fā)育呈下降趨勢(shì)；ArWRKY5、ArWRKY8與ArWRKY23的表達(dá)量隨著花的發(fā)育先上升后下降；ArWRKY13呈上升趨勢(shì)；ArWRKY19先下降再上升。結(jié)合金線蓮開花期不同組織表達(dá)分析顯示，ArWRKY5與ArWRKY20在不同時(shí)期的花中表達(dá)量均顯著高于開花期的根、莖、葉，而ArWRKY13與ArWRKY23在不同時(shí)期的花中表達(dá)量均低于開花期的根、莖、葉。說明ArWRKY5與ArWRKY20對(duì)金線蓮的花的形成及發(fā)育可能具有重要的調(diào)控作用。ArWRKY13與ArWRKY23與金線蓮開花呈負(fù)相關(guān)，說明它們也可能參與了金線蓮花的形成與發(fā)育。

圖4 ArWRKY基因在不同組織的表達(dá)Fig.4 Expression of ArWRKY gene in different tissues

3.3 ArWRKY5與ArWRKY20基因克隆

時(shí)空表達(dá)模式結(jié)果顯示，ArWRKY5與ArWRKY20在金線蓮花中的表達(dá)量顯著高于根、莖和葉，暗示它們可能參與了金線蓮的花形成及發(fā)育過程。為進(jìn)一步研究ArWRKY5與ArWRKY20的功能，本課題組以金線蓮轉(zhuǎn)錄組測序拼接得到的CDS序列設(shè)計(jì)引物，成功從金線蓮中克隆得到ArWRKY5與ArWRKY20（圖5）。測序結(jié)果顯示ArWRKY5為1149 bp（圖6），與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的序列一致；而ArWRKY20的CDS序列為600 bp（圖7），雖然編碼的蛋白包含了WRKY基本的結(jié)構(gòu)域，但是與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的序列相比中間部分丟失了一段60 bp的核苷酸序列，猜測可能是轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果拼接過程出錯(cuò)或者發(fā)生mRNA可變剪接。

圖5 ArWRKY5和ArWRKY20 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of ArWRKY5 and ArWRKY20 PCR products

圖6 ArWRKY5 CDS序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸圖Fig.6 ArWRKY5 CDS sequence and its corresponding amino acid map

圖7 ArWRKY20 CDS序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸圖Fig.7 ArWRKY20 CDS sequence and its corresponding amino acid map

3.4 ArWRKY5與ArWRKY20的生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站對(duì)ArWRKY5與ArWRKY20信號(hào)肽、蛋白的糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)和蛋白親/疏水性進(jìn)行預(yù)測（圖8、9）。發(fā)現(xiàn)ArWRKY5蛋白不存在信號(hào)肽，雖然預(yù)測圖上出現(xiàn)可能存在的2個(gè)糖基化位點(diǎn)，但是因?yàn)闆]有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)不太可能暴露于N-糖基化機(jī)制下，因此ArWRKY5應(yīng)不存在糖基化位點(diǎn)；ArWRKY5呈親水性，存在37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中27個(gè)是絲氨酸，10個(gè)是酪氨酸。預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)ArWRKY20同樣不存在信號(hào)肽和糖基化位點(diǎn)，且為親水性蛋白，存在18個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中11絲氨酸、3個(gè)酪氨酸、4個(gè)蘇氨酸。

圖8 ArWRKY5蛋白信號(hào)肽 (A)、糖基化位點(diǎn) (B)、親水性/疏水性 (C) 及磷酸化位點(diǎn) (D) 預(yù)測Fig.8 ArWRKY5 protein signal peptide (A), glycosylation site (B), hydrophilicity/hydrophobicity (C) and phosphorylation site (D) prediction

圖9 ArWRKY20蛋白信號(hào)肽 (A)、糖基化位點(diǎn) (B)、親水性/疏水性 (C) 及磷酸化位點(diǎn) (D) 預(yù)測Fig.9 ArWRKY20 protein signal peptide (A), glycosylation site (B), hydrophilicity/hydrophobicity (C) and phosphorylation site (D) prediction

利用GOR4進(jìn)行蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖10、11所示，可以發(fā)現(xiàn)ArWRKY5和ArWRKY20均由α-螺旋（alpha helix）、延伸鏈（extended strand）、無規(guī)則卷曲（random coil）所組成的，并且分布于整個(gè)蛋白。其中ArWRKY5中α-螺旋占30.89%，延伸鏈占14.14%，無規(guī)則卷曲占54.97%；ArWRKY20中α-螺旋占22.16%，延伸鏈占13.07%，無規(guī)則卷曲占64.32%。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測見圖11。

圖10 ArWRKY5和ArWRKY20二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Predicted secondary structure of ArWRKY5 and ArWRKY20

圖11 ArWRKY5和ArWRKY20三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.11 Prediction of tertiary structure of ArWRKY5 and ArWRKY20

4 討論

金線蓮自然結(jié)實(shí)率低、種子敗育率高和幼苗死亡率高等原因是導(dǎo)致野生金線蓮資源匱乏的重要因素。金線蓮的種胚結(jié)構(gòu)不健全且不含胚乳，由于長期的無性繁殖，引起了金線蓮種質(zhì)退化、抗逆性差等現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降，最終影響金線蓮的藥材質(zhì)量[5]。因此解決金線蓮胚胎發(fā)育問題是金線蓮優(yōu)良品種選育的目標(biāo)之一。篩選對(duì)金線蓮胚胎發(fā)育具有調(diào)控作用的ArWRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于明確金線蓮種子胚胎發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。

為從金線蓮中篩選調(diào)控胚胎發(fā)育相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，本研究利用Illumina結(jié)合PacBio技術(shù)對(duì)金線蓮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，首次從金線蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到23條ArWRKY序列。根據(jù)ArWRKY核心序列比對(duì)結(jié)果與WRKY蛋白結(jié)構(gòu)類型將ArWRKY分為3大類[20]。將ArWRKY與其他物種中已知功能的WRKY一同構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)：ArWRKY6與AtWRKY10和AtTTG2_X1相距最近；ArWRKY8與AtTTG2_X1相距最近。已報(bào)道AtWRKY10能促進(jìn)擬南芥種子的胚乳發(fā)育，并且通過調(diào)控種子腔的發(fā)育來影響擬南芥種子的大小[21]；AtTTG2則能調(diào)控?cái)M南芥種子種皮中單寧物質(zhì)和粘液的生成，從而影響種皮發(fā)育[11]。這說明ArWRKY6和ArWRKY8可能與金線蓮種子大小、胚乳發(fā)育和種皮發(fā)育相關(guān)。除此之外，ArWRKY9與ArWRKY13和VvWRKY20_X2相距最近；ArWRKY11與AtWRKY43相距最近。VvWRKY20參與了葡萄胚珠發(fā)育過程，缺少VvWRKY20的調(diào)控作用會(huì)導(dǎo)致葡萄胚珠敗育[12]；AtWRKY43可以調(diào)控?cái)M南芥種子中的脂肪動(dòng)員過程，促進(jìn)糖類的積累，從而增強(qiáng)種子的發(fā)芽能力[10]。這些結(jié)果也暗示ArWRKY9、ArWRKY11和ArWRKY13可能具有同樣或類似的功能。另外，ArWRKY1與GhWRKY17_X2的分支相距最近；ArWRKY5與GhWRKY17_X3相距最近；ArWRKY19與AtWRKY34和GhWRKY22相距較近；ArWRKY20與VvWRKY20_X3相距較近；ArWRKY23與GhWRKY17_X2和ThWRKY7相距最近。聚類越近的蛋白可能在遺傳關(guān)系上越密切，進(jìn)化樹的聚類分析結(jié)果為進(jìn)一步篩選調(diào)控金線蓮胚胎發(fā)育的ArWRKY提供了一定參考依據(jù)。

本研究對(duì)ArWRKY1、ArWRKY5、ArWRKY6、

ArWRKY8、ArWRKY9、ArWRKY11、ArWRKY13、ArWRKY19、ArWRKY20與ArWRKY23在金線蓮的不同組織部位及金線蓮不同時(shí)期花中的表達(dá)量進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)23條ArWRKY在金線蓮的不同組織與不同花期中表達(dá)模式不盡相同。其中，ArWRKY5和ArWRKY20在金線蓮不同時(shí)期的花中都顯著高于根、莖、葉，因此進(jìn)一步確定了ArWRKY5和ArWRKY20可能存在調(diào)控金線蓮花發(fā)育的功能，進(jìn)而影響金線蓮的胚胎形成及種子發(fā)育。為驗(yàn)證ArWRKY5和ArWRKY20的功能，本課題組利用金線蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的Unigenes克隆得到ArWRKY5和ArWRKY20的CDS序列，其中ArWRKY20與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫相比中間減少了60 bp大小的序列，猜測是由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接時(shí)出錯(cuò)，功能上是否存在差異還有待進(jìn)一步研究。本研究首次對(duì)金線蓮ArWRKY蛋白家族的組成、分類、進(jìn)化、基序特點(diǎn)及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，并篩選到在花中顯著高表達(dá)的ArWRKY5和ArWRKY20，成功克隆得到ArWRKY5與ArWRKY20的CDS序列，為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突