朱 菲，吳 梅，孔向軍*，方 莉，馬巧群，陶 益*

1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014

2.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000

3.金華匠康金草生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 金華 321000

糖尿病是一種以血糖升高和代謝紊亂為主要特征的疾病，屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇。其中2型糖尿病占所有糖尿病患者的95%左右，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。2型糖尿病又稱為非胰島素依賴型糖尿病，多發(fā)于肥胖及中老年人群，患者體內(nèi)胰島素分泌相對(duì)不足或作用效果不佳。2型糖尿病可誘發(fā)多種并發(fā)癥，包括糖尿病心血管疾病、糖尿病肝病、糖尿病腎病等。臨床上治療2型糖尿病一般分為注射胰島素和口服降糖藥2種方案。然而，這2種方案的持續(xù)治療通常會(huì)導(dǎo)致耐藥性和明顯的不良反應(yīng)，甚至可引起多種心臟毒性、神經(jīng)毒性等損害患者身體健康[2-3]。中藥及其有效成分在2型糖尿病的防治中具有療效穩(wěn)定、不良反應(yīng)少、可長期使用、通過多靶標(biāo)多途徑調(diào)節(jié)代謝紊亂，起到保護(hù)胰腺結(jié)構(gòu)和功能的作用。因此，一些具有降血糖活性的中藥越來越受到人們的關(guān)注[4]。

金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.是蘭科開唇蘭屬多年生草本藥用植物，營養(yǎng)成分豐富，在民間有“鳥人參”“藥之王”“神草”“金草”等美譽(yù)，是我國名貴的天然藥物[5]。近年來，金線蓮逐漸成為研究熱點(diǎn)[6]。研究表明，金線蓮具有多種生物活性，包括抗腫瘤[7-8]、保肝[9]、降血糖[10]、抗氧化[11]和免疫調(diào)節(jié)作用。目前，關(guān)于金線蓮用于治療2型糖尿病的具體作用機(jī)制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過將多元藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)映射到人類疾病-基因網(wǎng)絡(luò)上而建立起來的。該方法將揭示與疾病相關(guān)的一些重要藥物靶標(biāo)。本研究首先通過文獻(xiàn)檢索的方式查找出金線蓮的化學(xué)成分信息，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建有效成分-疾病-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行生物學(xué)功能分析，初步預(yù)測(cè)金線蓮干預(yù)2型糖尿病可能的信號(hào)通路和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。同時(shí)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的關(guān)鍵作用靶標(biāo)進(jìn)行初步驗(yàn)證，采用造模后給藥治療的方式，檢測(cè)預(yù)測(cè)的相關(guān)蛋白水平，評(píng)價(jià)金線蓮對(duì)2型糖尿病的干預(yù)效果，為金線蓮的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫構(gòu)建及靶標(biāo)預(yù)測(cè) 本研究首先從PubChem和PubMed等數(shù)據(jù)庫中搜集金線蓮所含有的化學(xué)成分，建立金線蓮化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，使用ChemDraw18.0繪制化合物結(jié)構(gòu)，獲取每個(gè)化學(xué)成分的SMILES構(gòu)型，并對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行分類。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫和Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫檢索每個(gè)化學(xué)成分的作用靶標(biāo)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)化學(xué)成分的作用靶標(biāo)的名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.1.2 2型糖尿病作用靶標(biāo)的查詢 GeneCards數(shù)據(jù)庫是人類基因數(shù)據(jù)庫，DisGeNET數(shù)據(jù)庫是綜合性的基因-疾病關(guān)聯(lián)關(guān)系數(shù)據(jù)庫。以“type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞在GeneCards和DisGENET數(shù)據(jù)庫查找2型糖尿病相關(guān)的作用靶標(biāo)，并刪除重復(fù)的靶標(biāo)。為了獲得與2型糖尿病更加相關(guān)的靶標(biāo)，將根據(jù)得分進(jìn)行中位值的篩選并且采用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Venny 2.1獲取金線蓮化學(xué)成分與2型糖尿病的共有靶標(biāo)，并將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.8.0，構(gòu)建可視化的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。并將物種設(shè)定為“Homo sapiens”，可信度＞0.9。

1.1.4 拓?fù)浞治雠cMCODE聚類分析 采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，利用插件Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算節(jié)點(diǎn)自由度、接近中心性等。通過度（degree）排序，選取分值大于2倍平均分的基因作為關(guān)鍵靶標(biāo)，獲得金線蓮治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶標(biāo)及關(guān)鍵通路。通過插件MCODE進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶標(biāo)的篩選。

1.1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集 為了闡明金線蓮在2型糖尿病治療中的作用機(jī)制，將金線蓮與2型糖尿病的共有基因?qū)隓AVID 6.8數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 選取SPF級(jí)6周齡的健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～220 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。將大鼠飼養(yǎng)在具有通風(fēng)設(shè)備的飼養(yǎng)代謝籠中，控制溫度在25～28 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和攝食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20210429036）。

1.2.2 藥材 金線蓮由金華匠康金草生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院王平教授鑒定為蘭科植物金線蓮A.roxburghii(Wall.) Lindl.干燥全草。

1.2.3 藥品與試劑 鹽酸二甲雙胍片（0.5 g/片，國藥準(zhǔn)字H20023370，批號(hào)ABW2015）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司，批號(hào)S0130-1g；檸檬酸鹽緩沖液購自福建飛凈生物科技有限公司，批號(hào)20210602；多聚甲醛購自上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C10232385；高糖高脂飼料（基礎(chǔ)飼料58.8%、豬油20%、糖20%、膽固醇1%、膽鹽0.2%）購自南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。ELISA檢測(cè)試劑盒均購自于赫澎（上海）生物科技有限公司，胰島素試劑盒批號(hào)為202109，靶標(biāo)試劑盒批號(hào)均為202110。

1.2.4 儀器 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；超聲波清洗機(jī)（昆山式超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；GA-3型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀LWC400（深圳藍(lán)韻醫(yī)療器械）；球磨儀（上海凈信科技有限公司）。

1.2.5 2型糖尿病模型的構(gòu)建 高糖、高脂飼料飼養(yǎng)大鼠8周后，禁食12 h，除對(duì)照組外，其他各組大鼠ip 0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.5）配制的40 mg/kg鏈脲佐菌素，同時(shí)，對(duì)照組大鼠ip同等劑量0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.5）[11-13]。1周后禁食12 h，檢測(cè)空腹血糖（fasting blood sugar，F(xiàn)BG），若FBG連續(xù)2次≥11.1 mmol/L，同時(shí)伴有多飲、多食、多尿癥狀的大鼠，即視為造模成功。

1.2.6 溶液的配制

（1）金線蓮提取液的配制：取金線蓮干粉末（過60目篩）50 g，液料比為20∶1，提取溶劑為蒸餾水，于水浴100 ℃的條件下回流提取1 h，減壓抽濾并收集濾液[14]，重復(fù)以上步驟再提取1次，2次的濾液合并后于70 ℃的條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至222 mL，即為金線蓮高濃度提取液；提取液中、低濃度分別為高濃度提取液的1/2和1/4。金線蓮提取液直接ig給藥。通過HPLC-UV測(cè)定，金線蓮高濃度水提液中金線蓮苷、水仙苷、蘆丁、阿魏酸及山柰素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為13.49%、0.30%、0.10%、0.04%和0.02%。

（2）陽性藥物的配制：將去除包衣的鹽酸二甲雙胍片投入球磨儀研磨成粉末，0.70 g鹽酸二甲雙胍粉末溶于80 mL蒸餾水中，振蕩搖勻，制成鹽酸二甲雙胍混懸液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

1.2.7 分組與給藥 健康雄性SD大鼠使用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分6個(gè)組，每組6只，分別為對(duì)照組、模型組、二甲雙胍（陽性對(duì)照，70 mg/kg）組及金線蓮高、中、低劑量組。金線蓮給藥劑量按照人臨床使用劑量0.071 4 g/kg換算為大鼠用量0.45 g/kg，此劑量為金線蓮低劑量組給藥量，金線蓮中、高劑量組給藥劑量分別為0.9、1.8 g/kg。造模成功后按照8 mL/kg的給藥體積連續(xù)ig 3周，對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水，并于第7、14和21天稱體質(zhì)量和測(cè)定FBG。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，每天觀察大鼠的基本狀況。

1.2.8 靶標(biāo)的驗(yàn)證 金線蓮干預(yù)3周后各組大鼠禁食不禁水過夜，ig 10%戊巴比妥鈉（3.5 mL/kg）進(jìn)行麻醉[15]。鈍性分離腹主動(dòng)脈后，用含肝素鈉抗凝劑的采血管采集血液，3000 r/min離心10 min，分離得到血清。按照相應(yīng)ELISA試劑盒要求，檢測(cè)血清中各靶標(biāo)的水平。

1.2.9 胰島素水平的測(cè)定 金線蓮干預(yù)3周后，取大鼠血清適量采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)胰島素水平。

1.2.10 病理學(xué)檢查 取胰腺組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，采用常規(guī)蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡觀察并拍照分析。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均以表示。組間比較滿足方差齊性時(shí)采用單因素方差分析，不滿足方差齊性時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 通過文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫收集整理共獲得金線蓮80種化學(xué)成分，其中黃酮類25個(gè)，有機(jī)酸和揮發(fā)性化合物25個(gè)，三萜類10個(gè)，生物堿和核苷類7個(gè)，甾體類7個(gè)，糖苷類化合物6個(gè)。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫和Similarity ensemble approach數(shù)據(jù)庫篩選獲得金線蓮化學(xué)成分860個(gè)靶標(biāo)。利用GeneCards和DisGENET數(shù)據(jù)庫篩選獲得1323個(gè)2型糖尿病相關(guān)的基因。利用Venny 2.1得到249個(gè)共有靶標(biāo)，見圖1。將得到的249個(gè)共同靶標(biāo)導(dǎo)入STRING平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，選取最低相互作用閾值大于0.9的靶標(biāo)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有249個(gè)節(jié)點(diǎn)和989條邊，平均度值為7.94。

圖1 金線蓮與2型糖尿病靶標(biāo)交集韋恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of A.roxburghii and type 2 diabetic mellitus

圖2 金線蓮治療2型糖尿病靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of A.roxburghii related type 2 diabetic mellitus targets

2.1.2 “化學(xué)成分-疾病-通路-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.0軟件繪制“化學(xué)成分-疾病-通路-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖。如圖3所示，紫色為化學(xué)成分，粉色為2型糖尿病靶標(biāo)，藍(lán)色為最顯著的前20條通路，紅色為疾病即2型糖尿病。通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過度值排序，選取分值大于2倍平均分的基因作為關(guān)鍵靶標(biāo)，總共篩選出32個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，前10個(gè)靶標(biāo)如圖4所示。金線蓮對(duì)2型糖尿病治療作用主要與花生四烯酸-5-脂加氧酶（arachidonic acid-5-lipoxygenase，ALOX5）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、醛糖還原酶（aldose reductase，AR）、細(xì)胞色素P45019A1（cytochrome P45019A1，CYP19A1）、細(xì)胞色素 P4501B1（cytochrome P4501B1，CYP1B1）、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenenase-2，COX-2）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）等作用靶標(biāo)有關(guān)。對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，?jié)點(diǎn)度值排名前5的化合物如圖5所示，分別為槲皮素、異鼠李素、金線蓮苷、齊墩果酸和熊果酸，節(jié)點(diǎn)度較高的化合物是金線蓮發(fā)揮2型糖尿病治療作用的關(guān)鍵成分。

圖3 金線蓮“化學(xué)成分-疾病-通路-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of “composition-disease-pathway-target ” of A.roxburghii

圖4 排名前10的靶標(biāo)及其度值Fig.4 Top 10 targets and their degrees

圖5 排名前10的化合物及其度值Fig.5 Top 10 compounds and their degrees

2.1.3 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析將249個(gè)交集靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO富集分析，篩選P＜0.05的條目，總共富集到349條生物過程相關(guān)、86條細(xì)胞組成相關(guān)和165條分子功能相關(guān)的條目。如圖6所示，生物學(xué)過程相關(guān)的條目主要包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、對(duì)藥物的反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控等。細(xì)胞組成相關(guān)的條目涉及細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)溶膠、胞外外泌體、細(xì)胞膜、細(xì)胞外間隙等。分子功能相關(guān)的條目主要集中于相同蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)激酶活性、血紅素結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等方面。

圖6 GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis

KEGG通路富集分析結(jié)果如圖7所示，具有顯著意義（P＜0.05）的通路共139條，主要與Ras信號(hào)通路、胰島素抵抗信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF-1）信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路等方面有關(guān)。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 一般狀態(tài)觀察 糖尿病的典型癥狀包括多飲、多食和消瘦。造模后，與對(duì)照組相比，其他組大鼠飲水量和進(jìn)食量明顯增加，懶動(dòng)。給藥期間，金線蓮各劑量組飲水量較模型組減少，但比對(duì)照組增多；進(jìn)食量較模型組減少，但與對(duì)照組相比增多；精神狀態(tài)較模型組大有好轉(zhuǎn)。各組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.2 降血糖作用 血糖是衡量金線蓮對(duì)2型糖尿病大鼠治療作用的基礎(chǔ)指標(biāo)。各組大鼠ig 3周后，利用血糖儀測(cè)定每只大鼠的FBG值。如圖8所示，模型組大鼠FBG平均值達(dá)到15.0 mmol/L，表明造模成功；與模型組大鼠相比，二甲雙胍組與金線蓮各劑量組大鼠FBG值均顯著下降（P＜0.05）。

圖8 給藥3周后各組大鼠FBG ()Fig.8 FBG of rats in each group three weeks after administration ()

2.2.3 胰島素水平 如圖9所示，ig 3周后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清胰島素水平顯著性升高（P＜0.05）；與模型組相比，二甲雙胍組與金線蓮各劑量組大鼠胰島素水平均顯著下降（P＜0.05）。

圖9 給藥3周后各組大鼠血清胰島素水平 (±s , n=6)Fig.9 Serum insulin level of rats in each group three weeks after administration (±s , n=6)

2.2.4 胰腺組織病理學(xué)變化 如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的胰腺細(xì)胞排列紊亂，腺泡分布松散，胰島細(xì)胞壞死明顯。然而在二甲雙胍組和金線蓮各劑量組治療3周后，胞漿均勻無空泡，胰島結(jié)構(gòu)變得更為清晰且邊界清楚，細(xì)胞核較清晰，但胰島細(xì)胞輕微壞死，程度較對(duì)照組嚴(yán)重。

圖10 胰腺組織HE染色 (×200)Fig.10 HE staining of pancreatic tissues (× 200)

2.2.5 靶標(biāo)的驗(yàn)證 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，金線蓮對(duì)2型糖尿病的治療作用與ALOX5、AChE、AR、CYP19A1、CYP1B1、PTP1B、COX-2及IL-2等靶標(biāo)有關(guān)。為了驗(yàn)證該預(yù)測(cè)結(jié)果，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠血清中8種預(yù)測(cè)靶標(biāo)水平，結(jié)果如圖11所示。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-2、ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平均顯著降低（P＜0.05），而COX-2、PTP1B和AR水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠血清中IL-2、ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平均顯著升高（P＜0.05），AChE、COX-2和AR水平顯著降低（P＜0.05）。金線蓮低劑量組大鼠血清COX-2和PTP1B水平顯著降低（P＜0.05）；中劑量組大鼠血清IL-2、ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平顯著升高（P＜0.05），COX-2、PTP1B、AChE和AR水平顯著降低（P＜0.05）；高劑量組ALOX5、CYP1B1和CYP19A1水平顯著升高（P＜0.05），AChE水平顯著降低（P＜0.05）。

圖11 各組大鼠血清中8種靶標(biāo)水平 (±s , n=6)Fig.11 Serum levels of eight targets of rat in each group (±s , n=6)

3 討論

2型糖尿病是一種以高血糖和胰島素抵抗為主要特征的復(fù)雜代謝紊亂疾病，對(duì)腎臟和肝臟等器官系統(tǒng)都有影響，嚴(yán)重威脅人類健康與壽命[16]。目前，2型糖尿病多發(fā)、高發(fā)且越來越年輕化，及早干預(yù)是降低并發(fā)癥和致死率的關(guān)鍵。中藥在2型糖尿病的治療方面有著顯著的療效和優(yōu)勢(shì)，亟待守正創(chuàng)新和傳承發(fā)展。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)在藥物與疾病之間的關(guān)系研究以及疾病靶標(biāo)和途徑的預(yù)測(cè)方面應(yīng)用越來越多。在藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不僅可以多維度地闡明藥物的作用機(jī)制、預(yù)測(cè)新的藥理作用的同時(shí)也可以降低藥物發(fā)現(xiàn)的成本[17-18]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，金線蓮治療2型糖尿病的關(guān)鍵活性成分為金線蓮苷、槲皮素、異鼠李素、齊墩果酸、熊果酸等。槲皮素具有促進(jìn)胰腺干細(xì)胞再生和胰島細(xì)胞分化的作用，通過其抗氧化、抗炎和抗凋亡活性來保護(hù)胰腺細(xì)胞免受損傷，并調(diào)節(jié)與葡萄糖代謝相關(guān)的酶活性來降低血糖，增加對(duì)胰島素的敏感性[19-20]。異鼠李素的自由基清除活性，主要通過3種主要的抗氧化途徑實(shí)現(xiàn)：氫原子轉(zhuǎn)移、單電子轉(zhuǎn)移隨后質(zhì)子轉(zhuǎn)移和順序質(zhì)子丟失電子轉(zhuǎn)移[21]。金線蓮苷具有調(diào)節(jié)酶促抗氧化劑的活性、清除自由基和降低NO的含量，減少對(duì)胰島β細(xì)胞的刺激且改善其功能[22]。金線蓮苷通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-組織抑制劑金屬蛋白酶（tissue inhibitor metalloproteinase，TIMP）的平衡來維持血管結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡，恢復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于生物活性物質(zhì)的正常分泌[23]。熊果酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)為α-香樹脂醇型五環(huán)三萜類，可以將血糖酵解為其他糖代謝產(chǎn)物并且減少葡萄糖的吸收，可能的作用途徑為促進(jìn)葡萄糖激酶mRNA表達(dá)、提高糖代謝關(guān)鍵酶葡萄糖激酶的含量和抑制α-葡萄糖苷酶活性等；保護(hù)胰腺β細(xì)胞并刺激胰島分泌胰島素；抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1β和激動(dòng)胰島素受體TGR5，加快體內(nèi)葡萄糖的攝取和利用速率[24-25]。齊墩果酸可以降低細(xì)胞內(nèi)α-葡萄糖苷酶和α-胰腺淀粉酶的活性來調(diào)節(jié)外源葡萄糖的吸收，同時(shí)抑制糖原分解限速酶-糖原磷酸化酶的活性，減少內(nèi)源性葡萄糖的生成和糖原的分解。除此之外，齊墩果酸還可以通過TGR5途徑刺激胰島β細(xì)胞釋放胰島素，從而起到改善胰島素抵抗的作用[26-27]。另有研究顯示，金線蓮多糖也具有降血糖作用[28]。

高血糖可促使細(xì)胞膜糖基化，破壞粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)，限制其免疫功能，吞噬殺菌力減低，延緩淋巴細(xì)胞的分裂，導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞的減少。IL-2主要是由輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生，高血糖導(dǎo)致IL-2分泌減少[29]。金線蓮各劑量組的血糖水平顯著下降，IL-2水平也回歸正常。PTP1B對(duì)胰島素傳導(dǎo)過程具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，PTP1B的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，促使胰島素受體及受體底物酪氨酸磷酸化，阻斷胰島素的降血糖作用[30]。金線蓮給藥后PTP1B水平恢復(fù)正常水平。ALOX5是花生四烯酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。研究表明，花生四烯酸具有降低糖尿病大鼠血糖、提高機(jī)體抗氧化能力的功效[31]。模型組大鼠ALOX5水平降低，花生四烯酸的分解代謝受到抑制，表明模型組大鼠體內(nèi)花生四烯酸的代償性積累。金線蓮給藥后ALOX5水平恢復(fù)正常。COX-2作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，過度表達(dá)能降低機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，減少胰島細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用[32]。金線蓮給藥后能顯著降低血清COX-2水平。AR是體內(nèi)多元醇代謝途徑的主要酶，可以催化葡萄糖產(chǎn)生大量的山梨醇。由于山梨醇不易透過細(xì)胞膜，山梨醇在細(xì)胞間質(zhì)大量堆積，這將對(duì)機(jī)體健康造成嚴(yán)重問題，如糖尿病和腎臟損傷等[33]。因此，抑制AR的活性可以減少山梨醇的產(chǎn)生，降低患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。模型組的AR水平顯著升高，而金線蓮給藥后AR水平回歸正常。

2型糖尿病與氧化應(yīng)激機(jī)制有著密不可分的關(guān)系。CYP1B1具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。抑制CYP1B1的活性能降低氧化應(yīng)激水平和阻礙c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而JNK信號(hào)通路在氧化應(yīng)激中是至關(guān)重要的[34]。模型組CYP1B1水平下降，而金線蓮給藥后CYP1B1水平恢復(fù)正常水平。糖代謝與CYP450酶家族基因的多態(tài)性密切相關(guān)。CYP19A1基因與性激素、雌激素以及芳香化酶的活性有關(guān)，其可能通過影響雌激素水平起到降血糖的作用[35]。模型組CYP19A1水平下降，而金線蓮給藥后恢復(fù)正常。

AChE具有誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴性舒張的作用，然而AChE的過度表達(dá)可使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)胰島素抵抗與內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂相關(guān)，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂時(shí)，機(jī)體內(nèi)游離脂肪酸水平升高，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，胰島素?zé)o法及時(shí)對(duì)葡萄糖分解利用。模型組AChE 水平升高，而金線蓮給藥后AChE 水平恢復(fù)正常。

綜上所述，金線蓮可以通過減少炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵酶的表達(dá)、改善胰島素抵抗從而發(fā)揮降血糖的作用，可用于開發(fā)抗糖尿病新藥。本研究體現(xiàn)了金線蓮多成分、多通路、多靶標(biāo)的作用特征，對(duì)明確金線蓮治療2型糖尿病的作用機(jī)制具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突