梅 凱，蘭 海，李 鑫，李婷婷，郝逗逗，王靈敏，王昕怡，陳佳佳，劉 葭，吳 清

北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488

化療致周圍神經(jīng)病變（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）是指以奧沙利鉑為代表的化療藥對癌癥患者周圍神經(jīng)或自主神經(jīng)損傷產(chǎn)生的神經(jīng)功能紊亂的病變[1]。

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿E.sagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai的干燥葉，性味辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效[2]。中醫(yī)臨床[3-5]和現(xiàn)代藥理研究[6-9]均表明淫羊藿具有治療CIPN的潛力，淫羊藿水提液能夠促進雞胚背根神經(jīng)節(jié)突起的生長以及神經(jīng)節(jié)DNA、RNA的合成；淫羊藿提取物和淫羊藿苷皆能有效促進周圍神經(jīng)再生，改善受損神經(jīng)的功能。實驗室前期工作基礎發(fā)現(xiàn)淫羊藿對奧沙利鉑引起的CIPN具有明顯的保護作用[10]，并且篩選得到50%乙醇洗脫部位是有效部位，液質(zhì)聯(lián)用分析明確其主要化學成分為朝藿定A、B、C及淫羊藿苷，采用大孔吸附樹脂法對有效部位的富集工藝進行了優(yōu)化[11]。同時實驗室對淫羊藿有效部位的理化性質(zhì)進行了研究，根據(jù)生物藥劑學分類系統(tǒng)，有效部位主要成分朝藿定A、B、C及淫羊藿苷屬于III類成分，即具有高溶解性、低滲透性，難以跨越胃腸道生物膜，吸收較差，影響藥效發(fā)揮，因此擬將其制備為磷脂復合物以提高其滲透性，從而提高生物利用度。

磷脂復合物是藥物和磷脂分子通過電荷遷移作用而形成的較為穩(wěn)定的復合物或絡合物，可以改變藥物的理化性質(zhì)[12-13]，具有高度的生物相容性和膜滲透性。本文將淫羊藿有效部位制備成磷脂復合物并進行表征，測定4種主要成分朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的平衡溶解度和油水分配系數(shù)，考察體外釋放行為，為淫羊藿有效部位的劑型設計與進一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；BT 125D型電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SHA-CA水浴恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；MX-S渦旋儀，Dragon Lab；KQ-300V DE雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，北京神泰偉業(yè)儀器設備有限公司；BZF 50型真空干燥箱，上海BOXUN公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，北京科偉永興儀器有限公司；756PC紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Alpha Ⅱ紅外光譜儀，德國Bruker公司；DSC3差示掃描量熱儀，瑞士梅特勒托利多公司。

對照品朝藿定A（批號P10J11F118161，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、朝藿定B（批號P19A11F121806，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、朝藿定C（批號R01J11F117173，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、淫羊藿苷（批號T21S8B40472，質(zhì)量分數(shù)≥98%），磷酸氫二鈉（批號Z29D9Y78929）、大豆卵磷脂（批號T25S11F125782）、15000MWCO再生纖維素透析袋（截留相對分子質(zhì)量為15 000），上海源葉生物有限公司；淫羊藿有效部位，實驗室自制，總黃酮為（62.60±0.26）%，朝藿定A、B、C及淫羊藿苷分別為（2.75±0.07）%、（14.54±0.08）%、（5.79±0.10）%、（14.59±0.20）%；磷酸二氫鉀（批號20131122），國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鉀（批號990315-1），北京市紅星化工廠；磷酸二氫鈉（批號20140212）、丙酮（批號20190401），北京化工廠；甲醇（批號20200920）、無水乙醇（批號20201210），天津市致遠化學試劑有限公司；二氯甲烷（批號20200901）、四氫呋喃（批號20200901），天津市大茂化學試劑廠；正辛醇（批號WXBB1159V）、甲醇、乙腈，色譜純，Sigma公司；液相用水，娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 磷脂復合物的制備工藝及評價方法

淫羊藿有效部位不溶于二氯甲烷，而磷脂和磷脂復合物易溶于二氯甲烷，利用此特性可以將游離的淫羊藿有效部位與磷脂復合物分離。將一定量的淫羊藿有效部位和大豆卵磷脂在一定條件下反應后，蒸去溶劑后加入適量的二氯甲烷溶解，0.45 μm有機系濾膜抽濾，濾膜上的沉淀即為未復合的游離淫羊藿有效部位，干燥稱定質(zhì)量，以復合率為指標考察磷脂復合物制備工藝。

復合率＝(W1-W2)/W1

W1為淫羊藿有效部位初始投入量，W2為淫羊藿有效部位沉淀量

2.2 單因素試驗

分別以反應溶劑為甲醇、無水乙醇、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃，反應時間為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，投料比為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（淫羊藿有效部位/大豆卵磷脂），藥物質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL，反應溫度為20、30、40、50、60 ℃進行單因素試驗，其中固定參數(shù)為投料比為1∶2，藥物質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL，反應溫度為40 ℃，反應時間為2.0 h，反應溶劑為無水乙醇。

結(jié)果不同反應溶劑（甲醇、無水乙醇、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃）的復合率分別為94.73%、92.14%、0、39.63%、96.21%（n＝3），不同反應時間（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h）的復合率分別為89.07%、92.59%、93.90%、93.87%、93.95%（n＝3），不同反應溫度（20、30、40、50、60 ℃）的復合率分別為89.63%、91.53%、94.14%、93.99%、93.81%（n＝3），不同藥物質(zhì)量濃度（2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL）的復合率分別為86.48%、93.42%、93.24%、94.00%、91.74%（n＝3），不同投料比（1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4）的復合率分別為0、83.70%、94.70%、95.74%、94.42%（n＝3），考慮到毒性問題，選擇復合率高的無水乙醇作為反應溶劑；反應時間影響較小，2 h后復合率基本達到穩(wěn)定（94%），因此，確定反應時間為2 h；選擇對復合率影響較大的投料比、藥物質(zhì)量濃度、反應溫度進一步優(yōu)化。

2.3 Box-Behnken效應面優(yōu)化試驗

2.3.1 Box-Behnken試驗設計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對復合率影響較大的投料比（X1）、藥物質(zhì)量濃度（X2）、反應溫度（X3）3個因素，以復合率為指標，采用Box-Behnken設計對淫羊藿有效部位磷脂復合物的制備工藝進行效應面優(yōu)化。設計因素水平及Box-Behnken試驗安排見表1，采用Design Experts 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行擬合分析。

表1 Box-Behnken試驗安排Table 1 Box-Behnken test arrangement

2.3.2 模型擬合及響應面分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對上述實驗結(jié)果進行模型擬合及方差分析，方差分析及影響因素顯著性分析結(jié)果見表2，響應曲面圖見圖1。對復合率結(jié)果進行2項式方程擬合，得模型擬合方程為Y＝96.55+4.85X1+1.25X2+1.18X3-1.40X1X2-2.03X1X3+0.011X2X3-6.03X12-1.68X22+1.47X32，對模型回歸方程進行方差分析，P＝0.001 5＜0.05，表明所建立的回歸方程具有統(tǒng)計學意義。由回歸分析結(jié)果可知，投料比對復合率有顯著性影響，藥物質(zhì)量濃度與反應溫度不具有顯著性影響，各因素的交互作用不具有顯著性影響。各因素對于復合率的影響的順序為X1（投料比）＞X2（藥物質(zhì)量濃度）＞X3（反應溫度）。由響應曲面圖可知，復合率在投料比為1∶1～1∶4內(nèi)先上升后下降，影響較明顯，在藥物質(zhì)量濃度為5～20 mg/mL內(nèi)，復合率也是先上升后下降，但是曲面變化幅度小，影響不顯著。

圖1 投料比、藥物濃度、反應溫度對復合率的影響效應曲面圖 (1024×768)Fig.1 Effect surface diagram of feed ratio, drug concentration and reaction temperature on compound rate (1024 × 768)

表2 2項式回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table 2 Significance test of binomial regression model coefficients

2.3.3 最優(yōu)工藝及驗證 模型預測最佳工藝為無水乙醇為反應溶劑，投料比為1∶2.7，藥物質(zhì)量濃度為13.5 mg/mL，反應溫度為37 ℃，反應時間為2 h。對最優(yōu)工藝進行驗證，重復3次實驗，計算偏差［偏差＝(預測值-實測值)/預測值］。結(jié)果3次實驗中磷脂復合物的復合率分別為95.98%、96.51%、96.14%，平均為96.21%，而預測值為97.34%，二者偏差為1.16%，說明模型比較可靠，證明淫羊藿有效部位磷脂復合物最佳制備工藝穩(wěn)定可行。

2.4 磷脂復合物的表征

2.4.1 紫外光譜法 稱取適量淫羊藿有效部位，大豆卵磷脂、物理混合物、磷脂復合物，適量無水乙醇稀釋，以無水乙醇為對照，于200～800 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知，磷脂在200～800 nm內(nèi)幾乎無吸收，淫羊藿有效部位、物理混合物、磷脂復合物均在290、313、360 nm處有吸收峰，且光譜圖相似，表明淫羊藿有效部位和大豆卵磷脂在復合過程中沒有形成新的發(fā)色團，即藥物的化學結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變。

圖2 紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrogram

2.4.2 紅外光譜法 分別取適量大豆卵磷脂、淫羊藿有效部位、物理混合物、磷脂復合物，在400～4000 cm?1進行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖3。大豆卵磷脂的主要特征吸收峰是2 922.78 cm?1（-OH）、2 853.13 cm?1（-CH）、1 735.31 cm?1（C＝O）、1 246.93 cm?1（P＝O）、1 061.26 cm?1（O-C）、967.24 cm?1（P-O）。與物理混合物的圖譜相比，磷脂復合物圖譜中的峰數(shù)目、峰形狀和寬度等都發(fā)生了一定的變化，吸收峰1 247.78 cm?1（P＝O）遷移至1 234.13 cm?1，且寬度明顯變寬，強度明顯變?nèi)酰f明淫羊藿有效部位某些成分的官能團與大豆卵磷脂分子的P＝O鍵之間發(fā)生了相互作用；此外吸收峰1 089.82 cm?1與1 059.40 cm?1合并為1 054.22 cm?1，吸收峰1 175.24 cm?1遷移至1 178.43 cm?1，以上結(jié)果說明淫羊藿有效部位的某些成分與大豆卵磷脂發(fā)生了相互作用。

圖3 紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrogram

2.4.3 差示掃描量熱（DSC）分析 以空的鋁坩堝作為參比，升溫速度為10 ℃/min，掃描范圍為30～220 ℃，測定淫羊藿有效部位、大豆卵磷脂、物理混合物、磷脂復合物的差示熱曲線，結(jié)果見圖4。有效部位（圖4-A）熔距很寬，沒有確切的熔點，僅在180 ℃有1個不明顯的吸熱峰。而磷脂（圖4-D）在50～200 ℃出現(xiàn)較多不明顯的吸熱峰，可能是磷脂是一種混合物所致。磷脂復合物（圖4-B）與物理混合物（圖4-C）的圖譜明顯不同，物理混合物沒有明顯的吸熱峰，可能是磷脂的存在使藥物的相變點發(fā)生變化，導致吸熱峰變化；磷脂復合物在174.3、189.5 ℃處有2個較明顯的吸熱峰，證明了磷脂復合物是一種不同于有效部位、磷脂或物理混合物的新物相，說明磷脂復合物中藥物與大豆卵磷脂分子之間存在相互作用。

圖4 差示掃描量熱曲線Fig.4 Differential scanning calorimetry curve

2.5 淫羊藿有效部位磷脂復合物的體外評價

2.5.1 磷脂復合物平衡溶解度的測定 以最佳工藝制備淫羊藿有效部位磷脂復合物，參照《中國藥典》2020年版四部附錄的方法[14]，分別配制pH值為1.2、2.0、5.0、5.8、6.8、7.4、7.8的磷酸鹽緩沖液（PBS），精密移取1 mL水和不同pH值PBS至離心管中，分別加入過量的磷脂復合物，配制成相應的飽和溶液，渦旋5 min，超聲10 min，37 ℃、120 r/min恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，保持有固體藥物存在，10 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)甲醇適當稀釋，0.45 μm微孔濾膜濾過，按照以下HPLC條件進行測定，計算各指標成分的平衡溶解度，結(jié)果見表3。色譜條件：LC-20AT高效液相色譜儀；Inertsil?ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水，梯度洗脫：0～34 min，25%乙腈；34～35 min，25%～41%乙腈；35～45 min，41%～25%乙腈；45～60 min，25%乙腈；柱溫為30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長270 nm；理論塔板數(shù)均大于6000。

表3 各指標成分在水及不同pH值PBS中平衡溶解度(n = 3)Table 3 Solubility of each index component of Epimedii Folium in water and phosphate buffer with different pH (n = 3)

磷脂復合物中4種成分平衡溶解度均顯著提高，在水及不同pH PBS中的變化趨勢與原藥物相似，顯著提高了有效部位的溶解性。

2.5.2 磷脂復合物油水分配系數(shù)（lgP）的測定 分別取適量水及不同pH值PBS于離心管中，加入等量正辛醇溶液，充分振搖使兩相相互飽和，3000 r/min離心10 min，上層為水及不同pH值PBS飽和的正辛醇，下層為正辛醇飽和的水及不同pH值PBS，分離，備用。以朝藿定A、B、C及淫羊藿苷為指標，采用經(jīng)典搖瓶法測定磷脂復合物水及不同pH值PBS中的lgP。取適量的磷脂復合物溶解于水飽和的正辛醇溶液中，得到藥物飽和的正辛醇溶液，分別吸取1 mL該溶液和正辛醇飽和的水及不同pH值PBS，渦旋5 min，于37 ℃、120 r/min恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，3000 r/min離心10 min，取下層水相及分配前的藥物正辛醇溶液，經(jīng)甲醇適當稀釋，0.45 μm微孔濾膜濾過，按照“2.5.1”項下液相色譜條件分別測定分配前正辛醇溶液中的藥物質(zhì)量濃度及分配后水相中的藥物質(zhì)量濃度，計算各指標成分的lgP，結(jié)果見表4。

表4 各指標成分在水及不同pH值PBS中的lgP (n = 3)Table 4 lgP of each index component in water and phosphate buffer with different pH (n = 3)

Papp＝(C0V0-CV)/CV

Papp為表觀滲透系數(shù)，C0為分配前正辛醇溶液中指標成分的質(zhì)量濃度，V0為水飽和的正辛醇的體積，C為分配平衡后指標成分在水及不同pH值PBS中的質(zhì)量濃度，V為正辛醇飽和的水及不同pH值PBS的體積

lgP較小的化合物吸收差，lgP＞1表明有較好的膜滲透性，更易吸收[15]。

磷脂復合物中4種成分在水及不同pH值PBS中l(wèi)gP基本大于1，表明藥物制備成磷脂復合物后具有較好的滲透性，有利于口服吸收，且對朝藿定A、B、C的lgP提升幅度更大，說明磷脂復合物技術對親水性物質(zhì)滲透性的提高效果更明顯。

2.5.3 磷脂復合物的體外釋放考察 稱取適量的淫羊藿有效部位和含有相同藥物量的磷脂復合物，分別用5 mL PBS（pH 7.4）分散，裝于透析袋內(nèi)，兩端扎緊，浸入裝有100 mL PBS（pH 7.4）的錐形瓶中。37 ℃下以100 r/min的速率攪拌，分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h時取出1 mL接收液并補加等量的PBS，磷脂復合物樣品接收液和有效部位樣品接收液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按照“2.5.1”項下HPLC條件分別檢測朝藿定A、B、C及淫羊藿苷4種成分的含量，并計算各指標成分的累積釋放率，結(jié)果見圖5。

圖5 磷脂復合物 (I) 與有效部位 (II) 的體外釋放曲線(n = 3)Fig.5 In vitro release curve of phospholipid complex (I) and effective parts (II) (n = 3)

Qn為第n個時間點的累積釋放率，V為接收液體積，Vi為取樣體積，Cn和Ci分別為第n次和第i次取樣時接收液中藥物濃度，W為制劑中所含藥物質(zhì)量

從結(jié)果可知，與有效部位原料藥相比，磷脂復合物中4種成分的釋放均相對緩慢，且差異沒有顯著性，說明磷脂復合物具有緩釋特性?？赡苡?種原因：一是藥物分子與磷脂分子結(jié)合后相對分子質(zhì)量變大，導致分子熱運動變慢；二是藥物分子結(jié)構(gòu)上的部分羥基參與了復合物的形成，使得藥物分子的親水性降低。淫羊藿苷的累積釋放率明顯低于其他3種成分，這可能是因為淫羊藿苷親水性差，在釋放介質(zhì)中的溶解度低。

為探究磷脂復合物中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的釋放動力學，對數(shù)據(jù)分別進行零級、一級動力學模型擬合，結(jié)果見表5。一級動力學擬合的R2均大于零級動力學，說明磷脂復合物對4種成分的釋放以一級動力學為主。

為進一步探究磷脂復合物中4種成分的釋放機制，分別采用Higuchi方程、Ritger-Peppas方程、Hixson-crowell方程對累積釋放曲線進行模型擬合，結(jié)果見表5。Higuchi方程和Hixson-crowell方程相關系數(shù)均很高，說明磷脂復合物的釋藥機制為溶蝕和擴散協(xié)同釋藥。磷脂復合物中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的Ritger-Peppas方程釋放指數(shù)分別為0.675 9、0.711 1、0.669 6、0.691，均在0.45～0.89，進一步說明釋放過程屬于非Fick擴散，即釋藥機制為溶蝕和擴散的共同作用[16]。

表5 磷脂復合物中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的釋放曲線模型擬合Table 5 Fitting of release curve model of epimedin A, B, C and icariin in phospholipid complex

3 討論

藥物具有一定的溶解性和滲透性時才能透過生物膜被吸收。藥物的平衡溶解度與油水分配系數(shù)反映了藥物的溶解性與滲透性，通過測定藥物的平衡溶解度與lgP可以簡便、快捷、準確地預測藥物的吸收情況[17-19]。淫羊藿有效部位主要成分朝藿定A、B、C及淫羊藿苷具有高溶解性和低滲透性，難以吸收。因此有必要對其進行改性研究以增加其滲透性，為其進一步開發(fā)利用提供基礎。

磷脂復合物結(jié)構(gòu)對細胞膜有較好的親和性，可在一定程度上改善藥物的溶解性和滲透性。張文華等[20]通過磷脂復合物技術發(fā)現(xiàn)復合物在水中的表觀溶解度是甘草黃酮原料藥的10.7倍。樊麗雅等[21]通過磷脂復合物技術發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷磷脂復合物的油水分配系數(shù)相比于苦杏仁苷提高了6.6倍。又因其制備工藝簡單、成本低廉，磷脂復合物在藥物制劑方面的研究和應用上逐漸受到關注，特別是在中藥活性成分磷脂復合物的研究與應用上具有較好的前景。淫羊藿有效部位磷脂復合物中4種成分的平衡溶解度和lgP都得到顯著提高，有利于藥物的口服吸收。淫羊藿富集部位微乳凝膠外用對CIPN具有一定的治療作用[22]，而淫羊藿有效部位磷脂復合物對CIPN的治療效果還有待進一步研究。

本實驗采用磷脂復合物技術對淫羊藿有效部位進行改性，改善了有效部位的溶解性和滲透性。但磷脂復合物分散性較差，導致藥物體外溶出速率較慢，溶蝕作用可能是體外釋放的限速環(huán)節(jié)。后續(xù)研究可以考慮將磷脂復合物與固體分散體、納米給藥系統(tǒng)、亞微乳、自微乳、膠束等制劑聯(lián)用以提高磷脂復合物的分散性和穩(wěn)定性，增加藥物溶出度，從而進一步提高藥物的生物利用度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突