朱斐 ，譚善忠，王洪蘭 ，單晨嘯，崔小兵，井山林*，李俊松 *

1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023

2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術研究中心，江蘇 南京 210023

3.南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院，南京市第二醫(yī)院中西醫(yī)結合科，江蘇 南京 210003

隨著社會的進步，慢性肝病在我國發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，由于其病程長、病情復雜、遷延難愈，給社會和患者造成很大負擔[1]。慢性肝病病機復雜，有肝郁氣滯、肝郁脾虛等[2]。患者氣血不暢，肝臟疏泄條達功能下降，各類管道失其通利，瘀熱痰毒阻滯肝絡，肝實質(zhì)長期反復受損，從而形成肝纖維化、肝硬化、肝衰竭等。

益氣健脾顆粒由炙黃芪、太子參、當歸、酒女貞子等九味藥組成，主要用于慢性肝病如肝硬化、肝衰竭等的治療，在臨床應用已有十余年，療效確切。炙黃芪在方中重用，以補益為主；太子參補氣健脾兼可生津，兩者共為君藥。當歸養(yǎng)血活血，酒女貞子滋補肝腎陰精，共為臣藥。炒白術、茯苓、陳皮、酒黃芩進一步健脾，同時理氣、清熱、利濕，補而不滯，為佐藥。炙甘草調(diào)和諸藥，為使藥。全方益氣健脾治本，清熱、利濕、理氣治標，標本兼治，共奏固肝氣血之本，祛濕熱郁之邪之效。將其開發(fā)為新藥，可以更好地造?；颊?。

實驗室前期進行的藥理研究[3]表明，益氣健脾方在動物實驗中能夠有效降低慢加急性肝衰竭模型大鼠的肝損傷相關指標，如谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和總膽紅素等，減輕慢加急性肝衰竭模型大鼠的嚴重程度；在臨床上能夠明顯改善慢加急性肝衰竭患者肝功能指標，如總膽紅素、終末期肝病模型（MELD）評分，提升慢加急性肝衰竭患者免疫功能如外周血淋巴細胞百分百比，改善慢加急性肝衰竭患者預后[4]。

益氣健脾顆粒的藥理作用已有初步研究，但其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎仍不明確，因此，本實驗采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜技術（UPLC-Q-TOF-MS/MS）分別在正、負離子模式下對顆粒劑供試品溶液進行掃描，通過與對照品的保留時間及質(zhì)譜碎片離子進行匹配，并結合文獻報道與自建數(shù)據(jù)庫中對應成分的精確相對分子質(zhì)量、裂解規(guī)律進行比對，對益氣健脾顆粒的化學成分進行定性分析，以期為顆粒劑的工藝優(yōu)化、質(zhì)量控制、作用機制探討及深度開發(fā)等奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Triple Q-TOF 5600 System-MS/MS電噴霧飛行時間高分辨質(zhì)譜儀（配備有電噴霧離子源系統(tǒng)，美國AB SCIEX公司），LC-20ADXR快速液相儀（DGU-20A3脫氣裝置，SIL-20AXR自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，日本 Shimadzu公司）；數(shù)據(jù)采集和處理分別采用Analyst TF 1.6和PeakView1.2軟件；KH-500DE型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；TD6002C型電子天平（天津天馬衡基有限公司）；Sartorius CPA225D型分析天平（南京以馬內(nèi)儀器有限公司）；XP-6型精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Synergy UV系統(tǒng)超純水儀（南京漢隆儀器有限公司）；HH-8型恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；TGL-18C-C型臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥

腺嘌呤（批號S09S10D97125）、煙酸（批號LC15716V）、黃嘌呤（批號AJ0722MA14）、鳥苷（批號AJ0609NA14）、異甘草苷（批號R07D8F50056）、木犀草素（批號YA0408YA13）、蕓香柚皮苷（批號P25J9L66554）、野黃芩苷（批號Z01M10X81701）、異甘草素（批號C03A8Q41092）、川陳皮素（批號H22M8K32109）、白楊素（批號X24O6C4947）、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮（批號C09O8Y45293），質(zhì)量分數(shù)均≥98.0%，購自上海源葉生物科技有限公司；尿苷（批號110887-201803）、腺苷（批號110879-201703）、沒食子酸（批號110831-200302）、紅景天苷（批號110818-201708）、綠原酸（批號110753-201817）、咖啡酸（批號110885-201703）、阿魏酸（批號110773-201915）、甘草苷（批號111610-201908）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201907）、柚皮苷（批號110722-201714）、橙皮苷（批號110721-201617）、黃芩苷（批號110715-201821）、漢黃芩苷（批號112002-201702）、黃芩素（批號111595-201808）、甘草酸銨（批號110731-201619）、藁本內(nèi)酯（批號4431-01-0）、黃芪皂苷IV（批號110781-201717）質(zhì)量分數(shù)均≥96.8%，購于中國食品藥品檢定研究院；槲皮素（批號M216C186）、山柰酚（批號K2452C186）質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，購自上海吉至生化科技有限公司；毛蕊花糖苷（批號JBZ-7883）、洋川芎內(nèi)酯A（批號111826-201806）質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，購自南京金益柏生物科技有限公司；3,5二咖啡?？鼘幩幔ㄅ朌STDY003601）質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，購于成都德思特生物技術有限公司；漢黃芩素（批號64320010）質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，購于上海安譜實驗科技股份有限公司；黃芪皂苷Ⅲ（批號180419）質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，購自南京森貝伽生物科技有限公司。

益氣健脾顆粒（批號20210606，實驗室自制，黃芪甲苷質(zhì)量分數(shù)為0.067 2 mg/g，紅景天苷質(zhì)量分數(shù)為0.228 2 mg/g）；甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（質(zhì)譜級，德國Merck公司）；甲醇（分析純，國藥化試集團）；水（屈臣氏蒸餾水與純水儀自制超純水）；糊精（分析純，羅恩試劑）；阿司帕坦（分析純，批號H10M9A12035，南京景竹生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為YMC-Pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～5 min，5% B；5～14 min，5%～23% B；14～25 min，23%～28% B；25～28 min，28%～30% B；28～44 min，30%～34%B；44～51 min，34%～44% B；51～60 min，44%～46% B；60～70 min，46%～56% B；70～80 min，56%～74% B；80～85 min，74%～90% B；85～90 min，90% B，90～92 min，90%～5% B，92～100 min，5% B；體積流量1.0 mL/min；進樣量8 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用TOF MS-IDA-MS/MS模式；正、負離子檢測模式；霧化氣溫度（TEM）：550 ℃；源內(nèi)氣體積流量（GSl，N2）：379.225 kPa；源內(nèi)氣體積流量（GS2，N2）：275.800 kPa；氣簾氣壓力（CUR）：275.800 kPa；噴霧電壓（IS）4500 eV（ESI?）、5500 eV（ESI+）；去簇電壓（DP）100 eV；碰撞電壓（CE）40 eV；碰撞電壓差15 eV；掃描范圍為m/z50～1500。參數(shù)設置、數(shù)據(jù)采集和分析采用Analyst 1.6 軟件。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液的配制 取紅景天苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪皂苷IV等對照品適量，精密稱定，置于量瓶中，加甲醇制成各對照品儲備液；分別吸取各儲備液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的混合對照品溶液，離心10 min（14 000 r/min），取上清，即得。

2.2.2 供試品溶液的配制 取當歸、炒白術、陳皮加6倍量水，浸泡0.5 h，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油4 h，得揮發(fā)油，放置備用，蒸餾后的水溶液另器收集備用；藥渣與炙黃芪、太子參等加入全部飲片的10倍量水，回流提取3次，每次1.5 h，濾過，濾液合并，與蒸餾后的水溶液合并，并于70 ℃減壓濃縮至相對密度為1.10～1.20（60 ℃），趁熱加入阿司帕坦、糊精適量，干法制粒，制成顆粒，60～70 ℃干燥約1 h，放冷，噴入上述當歸揮發(fā)油等，混勻，即得。取益氣健脾顆粒適量，研細，精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇80 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min（85 ℃），放冷至室溫，補足減失質(zhì)量，搖勻，精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加75%甲醇定容至刻度，搖勻，離心10 min（14 000 r/min），取上清，即得。此外，按照顆粒劑供試品溶液的生藥量，分別取相應比例各單味藥飲片，同法制成單味藥供試品溶液。

2.3 數(shù)據(jù)庫的建立

在TCMSP、CNKI、SciFinder、ChemicalBook等數(shù)據(jù)庫檢索益氣健脾顆粒中各藥味相關的化學成分信息，整理化合物的CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量、名稱、分子結構式（mol格式文件）等，構建益氣健脾顆粒的化學成分數(shù)據(jù)庫。

2.4 數(shù)據(jù)處理、成分鑒別與分析

按“2.1”項下條件檢測益氣健脾顆粒供試品溶液，將所得原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導入PeakView 1.2軟件，得到正、負離子模式下的總離子流圖（TIC），見圖1。對于有對照品進行比對的化合物，將供試品溶液中各成分的相對保留時間、準分子離子、MS/MS碎片離子信息等與對照品圖譜比對確認。無對照品比對的的化合物，通過逐個提取選定化合物的譜圖與本地自建庫中化合物進行匹配，初步比對相對保留時間、相對分子質(zhì)量、分子式、準分子離子，篩選出誤差在5×10?6以內(nèi)的成分，再將二級譜圖中化合物的碎片離子信息與相關文獻資料、不同類別成分MS裂解規(guī)律進行比對分析，以準確推定無對照品比對的化學成分。

圖1 益氣健脾顆粒正離子 (A) 和負離子(B) 模式TIC圖Fig.1 Total ion chromatograms of Yiqi Jianpi Granules in positive (A) and negative (B) mode

結果從益氣健脾顆粒中共鑒定和推測出130個化合物，包括20個含氮化合物類成分、54個黃酮及其苷類成分、22個萜類成分、14個香豆素類成分、12個有機酸類成分和8個其他類成分。其中35個來自黃芪、10個來自太子參、19個來自當歸、18個來自女貞子、3個來自白術、16個來自陳皮、3個來自茯苓、14個來自黃芩、33個來自甘草，具體結果見表1。其中38種化合物為多味藥共有成分，黃酮類黃芩苷、二氫黃酮類橙皮苷、異黃酮類毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苯乙醇苷類紅景天苷、有機酸類阿魏酸36個成分與對照品比對后確認。

續(xù)表1

續(xù)表1

3 主要化合物的鑒定與歸屬、各類化合物的鑒定分析

3.1 含氮化合物

本實驗從益氣健脾顆粒中初步鑒定出20個含氮化合物，主要屬于氨基酸、核苷類、嘌呤及環(huán)肽類，且大多來源于黃芪和太子參。此類化合物的裂解規(guī)律一般為以N原子為中心，沿側鏈朝苯環(huán)方向逐步丟失取代基，進一步脫去氨基，有時也可見苯環(huán)開裂[22,39]。如果含有糖類，則容易先失去與其相連的糖分子。氨基酸是一類既含氨基也含羧基官能團的化合物，因此容易發(fā)生α-裂解掉落氨基或羧基基團，正離子模式下氨基酸類的準分子離子峰 [M+H]+相對豐度較低[7,43]。

峰12在一級質(zhì)譜下檢測到m/z344.043 6的分子離子峰，二級質(zhì)譜下檢測到丟失1分子的2′,3′-環(huán)磷脂基核糖（194）形成的碎片離子m/z150.043 1，在此基礎上失去1分子的氨基形成m/z133.016 5碎片，環(huán)裂解丟失CH2N2形成m/z108.021 2碎片，結合文獻數(shù)據(jù)[10]推測為環(huán)磷酸鳥苷。環(huán)肽是由酰胺鍵或肽鍵形成的一類環(huán)狀肽類化合物，容易丟失水、羰基、氨基等碎片。按以上規(guī)律，結合文獻數(shù)據(jù)[5-10,30-31]及碎片信息，推測出其余含氮化合物，具體見表1。

3.2 黃酮及其苷類

從顆粒劑中初步推定出54個黃酮類成分，主要來源于甘草、陳皮、黃芪、黃芩。黃酮類化合物具有C6-C3-C6的基本骨架，在MS譜中裂解規(guī)律大多相似，在負離子模式下響應較好。黃酮碳苷類成分常發(fā)生糖環(huán)的開環(huán)裂解，產(chǎn)生 [M-H-60]?、[M-H-90]?和 [M-H-120]?等一系列特征性碎片離子；氧苷類化合物的裂解方式主要是糖苷鍵的斷裂，多見各種糖基如鼠李糖基（Rha，146）、葡萄糖基（Glc，162）和蕓香糖基（Rutinose，308）等的掉落。而游離的黃酮苷元則易發(fā)生典型的逆狄爾斯-阿德爾（Retro Diels-Alder reaction，RDA）反應裂解，得到151、135、133等特征碎片離子[7]；以及發(fā)生C環(huán)的重排，可見H2O、C2H2、CH3、OCH3、CO等的掉落[6]。

例如峰40在負離子模式下有m/z285.040 8的準分子離子峰，碎片m/z267.034 2是由其失去1分子水得到，再脫去C2H2得到碎片m/z241.048 5，同時，B環(huán)掉落，形成m/z175.041 4的碎片離子，隨后發(fā)生RDA重排，得到2個互補碎片離子m/z151.003 9與m/z133.030 2，結合文獻報道[8]推測為木犀草素。峰67給出了m/z463.161 6 [M-H]?、301.110 5 [M-H-Glc]?的碎片，隨后黃烷基母核斷裂，形成m/z271.062 1等碎片，依據(jù)文獻報道[6,44]推測為黃芪紫檀烷苷，可能的裂解途徑見圖2。根據(jù)上述相似規(guī)律推定出其余黃酮及其苷類成分，具體見表1。

圖2 黃芪紫檀烷苷可能的裂解途徑Fig.2 Proposed fragmentation pathway of isomucronulatol 7-O-β-D-glucoside

3.3 萜類

在益氣健脾顆粒中共初步推定出22個萜類化合物，萜類為基本碳架多具有2個或2個以上異戊二烯單位（C5單位）結構特征的化合物，有的為游離三萜，有的與糖結合以三萜皂苷的形式存在。環(huán)烯醚萜類成分主要存在于女貞子中，三萜酸類化合物主要來自于女貞子、茯苓，三萜皂苷類成分來自于甘草、黃芪。此類化合物容易發(fā)生糖苷鍵的斷裂，丟失鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸（GlcA）等糖基，在高能量狀態(tài)下，常常丟失H2O、CO等中性基團[45-46]，此外苷元碎片上如果連接有甲基、咖啡?；然鶊F，則容易產(chǎn)生這些基團掉落的碎片。

例如，峰121檢測到m/z785.410 5的分子離子峰，首先丟失1分子葡萄糖基、1分子水，繼續(xù)脫水得到m/z587.410 5，同時也可以掉落木糖形成m/z473.359 0，繼續(xù)脫水形成m/z455.356 1，還有m/z143.106 6、125.096 4等碎片，結合文獻報道[9,29,36]推測為黃芪皂苷IV，可能的裂解途徑見圖3。

圖3 黃芪皂苷IV可能的裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathway of astragaloside Ⅳ

3.4 香豆素類

在益氣健脾顆粒中里共初步推定出14個香豆素類化合物，主要來源于當歸、白術、甘草。這類化合物在正離子模式下響應較高，大多具有強的分子離子峰，其質(zhì)譜經(jīng)常出現(xiàn)一系列連續(xù)失去-CO、-OH或H2O、CH3或OCH3以及烷基鏈的碎片離子峰，其中環(huán)上的CO比酯鍵中的更易失去[27]。

例如，峰110在正離子模式下準分子離子為m/z233.153 5 [M+H]+，二級碎片離子分別為m/z215.142 7 [M+H-H2O]+、m/z187.148 3 [M+HH2O-CO]+，分別為依次脫水、掉落1分子CO形成。根據(jù)此裂解方式，結合文獻報道[26]中碎片信息，推測該化合物為白術內(nèi)酯Ⅱ。

3.5 有機酸類

從益氣健脾顆粒中共初步推定12個有機酸類成分，分別來自當歸、黃芪、女貞子。此類化合物在負離子模式下響應較高，特征碎片為小分子基團COOH，可根據(jù)羧基相連的基團可劃分為脂肪酸和芳香酸2類，芳香酸類一般先產(chǎn)生芳香基團碎片離子，然后掉落H2O、CO2等中性小分子基團；脂肪酸類先丟失H2O、CO2等，隨后逐漸脫落甲基、亞甲基等分子[39]。

以峰26為例，準分子離子丟失1分子CO2得到碎片m/z135.045 3 [M-H-CO2]?，繼續(xù)丟失1分子CO形成碎片m/z107.051 7，最后脫去1分子水得到碎片m/z89.039 5，根據(jù)這些特征碎片結合文獻報道[19]推測為咖啡酸。以此裂解規(guī)律推測其他的有機酸類化合物，具體見表1。

3.6 其他類

此外，在顆粒劑中還推測出蔗糖、醇苷類、鞘脂類等其他成分。其中，紅景天苷為典型的苯乙醇苷類 成分，依次掉落葡萄糖基、水分子等碎片。可能的裂解途徑見圖4。

圖4 紅景天苷可能的裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathway of salidroside

4 討論

中藥復方是中藥的優(yōu)勢所在，也是中醫(yī)藥的主流與精髓，辨證施治、復方合煎、隨方配藥無不體現(xiàn)著其中醫(yī)臨床的用藥特色，益氣健脾顆粒作為醫(yī)院復方制劑，在臨床已應用10余年，療效確切。但全方藥味較多，所含的化學成分非常復雜，本地自建庫就收集了500余種化合物，本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，利用Peakview軟件呈現(xiàn)的碎片離子信息，結合網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫、自建本地數(shù)據(jù)庫、文獻報道等，對益氣健脾顆粒所含化學成分進行了分析與歸屬，為顆粒劑后續(xù)的深度優(yōu)化與開發(fā)及探討其作用機制等研究奠定了理論基礎。

該復方治療慢性肝病的療效離不開多成分、多機制的協(xié)同作用。有文獻觀察到黃芪水溶性黃酮類對細胞免疫功能具有促進作用[47]，還有文獻報道黃芪多糖可升高谷胱甘肽過氧化物酶的活性，具有一定的保護肝臟的療效[48]。現(xiàn)代藥理學研究表明太子參中主要的活性成分是環(huán)肽、多糖、皂苷、氨基酸等，具有改善心功能、調(diào)節(jié)免疫功能、改善腦缺血及抗氧化等功能[49-50]。當歸揮發(fā)油可能通過胰島素相關信號通路等發(fā)揮血壓調(diào)節(jié)作用，當歸多糖可能通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2/Caspase-3等通路，起到保肝作用[51]。已有研究表明[52]，女貞子提取物對肝臟損傷有著顯著保護作用，還可通過抑制因子mRNA等的表達有效調(diào)控炎癥反應。其中齊墩果酸和熊果酸能夠有效地抑制丙型肝炎病毒復制酶的活性，對丙型肝炎具有明確的治療作用。茯苓利水滲濕、健脾健胃等主要功效的發(fā)揮與其三萜類、多糖類或有機酸類成分[53-54]。白術的主要有效成分白術多糖，具有明顯的防治非酒精性脂肪性肝炎的作用，在改善肝損傷指標方面效果明顯[55]，同時，內(nèi)酯類、揮發(fā)油類成分具有抗癌作用[56-57]。陳皮揮發(fā)油能松弛氣管平滑肌，鎮(zhèn)咳作用顯著。橙皮苷對蛋白非酶糖基化具有抑制作用，對于腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥方面具有明顯的抑制作用[58]。黃芩苷為主的黃酮類是黃芩的主要活性物質(zhì)，具有廣譜的抗菌效果，可解釋黃芩具有清熱解毒的作用[59]。炙甘草中的甘草多糖，能夠加快小鼠的生長，提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。此外甘草多糖可增加白細胞介素-2的分泌，能促進T細胞等的活化和增殖，并分泌相關因子，進一步改善腫瘤細胞和病毒感染細胞的損傷[60]。結合傳統(tǒng)認知中各味藥的主要功效及現(xiàn)代藥理學研究，可以初步判定，本實驗推定的100多種成分可能與顆粒劑發(fā)揮益氣健脾的作用密切相關。

本研究仍有不足之處，指認出的來源于白術、茯苓的成分較少，可能是由于多糖等大分子不易檢出。同時本方中白術、當歸、陳皮3味藥中揮發(fā)油作為主要活性成分之一，卻因提取過程中的損失以及LC-MS檢測方式的特殊性未能全面分析，許多光學異構的同分異構體也不能清晰辨別。因此，今后可關注GC-MS聯(lián)用技術指認揮發(fā)性成分，入血成分分析等進一步分析益氣健脾顆粒的藥效物質(zhì)基礎與作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突