陳 良 ，葛朝倫，魏鴻雁，馬曉玲，買迪娜 ，石磊嶺*

1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部 省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000

2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002

3.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830011

4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

分心木Diaphragma Juglandis Fructus是胡桃科植物胡桃JuglansregiaL.果核內(nèi)部的干燥木質(zhì)隔膜，又名胡桃夾、核桃隔膜、胡桃隔、胡桃衣。始載于《山西中藥志》，性平，味苦、澀，具有固腎澀精、止血止帶之效[1]。傳統(tǒng)維醫(yī)多用其泡水代茶飲，治療失眠多夢、腎虛等癥?，F(xiàn)代研究表明，分心木具有抑菌、抗氧化等多種藥理活性[2-3]，并含有多種化學(xué)成分，是具有很大開發(fā)潛力的一味藥材。為了進(jìn)一步研究分心木的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對分心木95%甲醇提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的分離純化，得到16個(gè)化合物，分別鑒定為isosclerone（1）、engelhardione（2）、5-dehydroxy-octahydro-demethoxycur-cumin-A（3）blumenol A（5）、(+)-erythro-7-Oethylguaiacylglycerol（6）、threo-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-3-ethoxypropane-1,2-diol（7）、(6R,9R)-blumenol B（8）、hexahydro-demethoxycurcumin-A（9）、blumenol C（10）、3,4-二羥基苯甲酸乙酯（ethyl 3,4-dihydroxybenzoate，11）、(+)-異落葉松脂醇[(+)-isolariciresinol，12]、胡桃寧 B（juglanin B，13）、heptanoid（14）、4,17-dimethoxy-2-oxatricyclo [13.2.2.13,7] eicosa-3,5,7(20),15,17,18-hexaene-10,16-diol（15）、alternariol 9-methyl ether（16）。以上化合物均為首次從分心木中分離得到。為進(jìn)一步探究分心木的有效成分，本實(shí)驗(yàn)對化合物1～16進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選，結(jié)果顯示，化合物9、13對人子宮頸癌HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用，化合物13對人胃癌HGC-27細(xì)胞細(xì)胞表現(xiàn)出一定的活性，其余化合物尚未表現(xiàn)出明顯對這2種癌細(xì)胞的抑制活性。

1 儀器與材料

BrukerAvanceIII600型核磁共振波譜儀（德國Bruker），賽默飛世爾（Thermo Fisher）LTQ-Obitrap XL液質(zhì)聯(lián)用儀，制備型Agilent高效液相色譜儀（美國Agilent公司），色譜柱YMC-Pack ODS-A（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司），Sephadex LH-20凝膠（Pharmacia公司），MCI填料（日本三菱化學(xué)公司），柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司），薄層色譜用硅膠G、H、GF254（青島海洋化工有限公司），常規(guī)試劑均為分析純。HeLa細(xì)胞、HGC-27細(xì)胞購自sigma-aldrich公司

分心木采購于新疆和田藥材市場，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所賈曉光研究員鑒定為胡桃科植物胡桃J.regiaL.果核內(nèi)部的干燥木質(zhì)隔膜。

2 提取與分離

分心木8.34 kg，粉碎為粗粉，用體積分?jǐn)?shù)95%甲醇加熱回流提取，減壓濃縮得753 g總浸膏?？偨嘤盟稚⑻幚砗螅来斡檬兔?、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取至無色，萃取液減壓濃縮至干，得到石油醚部位總浸膏45.8 g、氯仿部位總浸膏47.6 g、醋酸乙酯部位總浸膏159.8 g、正丁醇部位總浸膏93.5 g。取氯仿部位（47.6 g）經(jīng)硅膠（100～200目）柱色譜，氯仿-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脫得到11個(gè)流分Fr.1～11。

Fr.3（氯仿-甲醇90∶1）經(jīng)過MCI色譜柱，薄層色譜檢測，合并得到5個(gè)組分Fr.3-1～3-5。Fr.3-1經(jīng)半制備液相色譜（46%甲醇）分離純化，得到化合物6（5.7 mg）、7（1.6 mg）、8（1.2 mg）。Fr.3-2經(jīng)半制備液相色譜（53%甲醇）分離純化，得到化合物4（2.2 mg）、5（5.7 mg）。Fr.3-3經(jīng)半制備液相色譜（72%甲醇）分離純化，得到化合物11（1.2 mg）。Fr.3-4經(jīng)半制備液相色譜（78%甲醇）分離純化，得到化合物9（6.9 mg）、10（8.6 mg）。Fr.3-5經(jīng)半制備液相色譜（90%甲醇）分離純化，得到化合物3（5.7 mg）。Fr.5（氯仿-甲醇60∶1）經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠色譜柱，得到5個(gè)組分Fr.5-1～5-5。Fr.5-2經(jīng)半制備液相色譜（52%甲醇）分離純化，得到化合物12（1.9 mg）。Fr.5-5經(jīng)半制備液相色譜（48%甲醇）分離純化，得到化合物1（1.5 mg）、2（1.0 mg）。Fr.6（氯仿-甲醇40∶1）經(jīng)ODS反相色譜柱分離，得到6個(gè)組分Fr.6-1~6-6。Fr.6-3經(jīng)半制備液相色譜（60%甲醇）分離純化，得到化合物13（8.5 mg）。Fr.6-4經(jīng)半制備液相色譜（65%甲醇）分離純化，得到化合物14（1.2 mg）、15（1.1 mg）、16（1.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物2：無色結(jié)晶（甲醇）。mp 73～76 ℃。ESI-MSm/z: 335 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT譜確定分子式為C19H20O4。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 2.84 (2H, m, H-1), 2.32 (2H, m, H-2), 1.87(2H, m, H-4), 1.54 (2H, m, H-5), 1.69 (2H, m, H-6),2.68 (2H, m, H-7), 5.59 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-2′), 6.72(1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.56 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-6′), 6.86 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2′′), 6.84 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-5′′), 6.79 (1H, dd,J= 7.8, 1.8 Hz,H-6′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 28.4 (C-1),42.4 (C-2), 213.3 (C-3), 47.6 (C-4), 20.5 (C-5), 28.4(C-6), 36.8 (C-7), 134.6 (C-1′), 114.1 (C-2′), 149.8(C-3′), 143.2 (C-4′), 117.2 (C-5′), 122.9 (C-6′), 141.4(C-1′′), 119.9 (C-2′′), 145.1 (C-3′′), 141.5 (C-4′′),125.3 (C-5′′), 123.1 (C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5]，故鑒定化合物2為engelhardione。

化合物3：無色油狀物。ESI-MSm/z: 353 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT 譜確定分子式為C20H26O4。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 2.56(2H, m, H-1), 1.84 (2H, m, H-2), 3.62 (1H, m, H-3),1.54 (2H, m, H-4), 1.51 (1H, m, H-5a), 1.37 (1H, m,H-5b), 1.63 (2H, m, H-6), 2.45 (2H, t,J= 7.8 Hz,H-7), 6.63 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-2′), 6.95 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.54 (1H, dd,J= 8.4, 1.2 Hz, H-6′),7.04 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-2′′, 6′′), 6.71 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-3′′, 5′′), 3.72 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 30.6 (C-1), 38.5 (C-2), 68.9 (C-3),37.0 (C-4), 25.1 (C-5), 31.5 (C-6), 34.8 (C-7), 132.5(C-1′), 112.4 (C-2′), 147.3 (C-3′), 155.1 (C-4′), 115.0(C-5′), 120.2 (C-6′), 133.2 (C-1′′), 129.6 (C-2′′, 6′′),115.2 (C-3′′, 5′′), 155.1 (C-4′′), 55.5 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6]，故鑒定化合物3為5-dehydroxy-octahydro-demethoxycurcumin-A。

化合物4：白色結(jié)晶（甲醇）。mp 211～213 ℃。ESI-MSm/z: 295 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT譜確定分子式為C16H16O4。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.20 (2H, d,J= 1.8 Hz, H-2, 2′), 6.86(2H, d,J= 8.4 Hz, H-5, 5′), 7.11 (2H, dd,J= 8.4, 1.8 Hz, H-6, 6′), 6.78 (2H, s, H-7, 7′), 3.73 (6H, s, 3,3′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 130.5(C-1, 1′), 109.4 (C-2, 2′), 147.3 (C-3, 3′), 144.7 (C-4,4′), 115.2 (C-5, 5′), 120.3 (C-6, 6′), 127.6 (C-7, 7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[7]，故鑒定化合物4為(E)-3,3′-dimethoxy-4,4′-dihydroxystilbene。

化合物5：白色粉末（甲醇）。mp 118～122 ℃。ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT 譜確定分子式為C13H20O3。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 2.37 (1H, d,J= 16.8 Hz, H-2a), 2.07(1H, d,J= 16.8 Hz, H-2b), 5.78 (1H, s, H-4), 5.66(1H, d,J= 15.6 Hz, H-7), 5.71 (1H, dd,J= 15.6, 4.8 Hz, H-8), 4.18 (1H, m, H-9), 1.11 (3H, d,J= 6.6 Hz,H-10), 0.91 (3H, s, Me-11), 0.93 (3H, s, Me-12), 1.80(3H, d,J= 1.2 Hz, Me-13)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 40.9 (C-1), 49.4 (C-2), 197.4 (C-3),125.5 (C-4), 164.4 (C-5), 77.8 (C-6), 135.8 (C-7),127.9 (C-8), 66.1 (C-9), 24.1 (C-10), 23.0 (C-11), 23.9(C-12), 19.0 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8]，故鑒定化合物5為blumenol A。

化合物8：無色油狀物。ESI-MSm/z: 249 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT譜確定分子式為C13H22O3。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 2.06(1H, d,J= 18.0 Hz, H-2a), 2.48 (1H, d,J= 18.0 Hz,H-2b), 5.74 (1H, s, H-4), 1.63 (1H, m, H-7a), 1.80(1H, m, H-7b), 1.25 (1H, m, H-8a), 1.52 (1H, m,H-8b), 3.49 (1H, m, H-9), 1.03 (3H, d,J= 6.6 Hz,H-10), 1.93 (3H, d,J= 1.2 Hz, H-11), 1.00 (3H, s,H-12), 0.91 (3H, s, H-13)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 41.4 (C-1), 49.8 (C-2), 196.7 (C-3),125.0 (C-4), 168.5 (C-5), 77.0 (C-6), 34.1 (C-7), 34.0(C-8), 66.4 (C-9), 24.2 (C-10), 21.1 (C-11), 23.5(C-12), 23.6 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]，故鑒定化合物8為 (6R,9R)-blumenol B。

化合物9：無色油狀物。ESI-MSm/z: 351 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT譜確定分子式為C20H24O5。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 2.84(2H, m, H-1), 2.68 (2H, m, H-2), 2.56 (2H, m, H-4),4.06 (1H, m, H-5), 1.78 (1H, m, H-6a), 1.49 (1H, m,H-6b), 2.64 (1H, m, H-7a), 2.47 (1H, m, H-7b), 6.65(1H, d,J= 2.4 Hz, H-2′), 6.97 (1H, d,J= 7.8 Hz,H-5′), 6.55 (1H, dd,J= 7.8, 2.4 Hz, H-6′), 7.17 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-2′′, 6′′), 6.65 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-3′′,5′′), 3.73 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 20.1 (C-1), 44.7 (C-2), 209.2 (C-3), 50.4(C-4), 66.2 (C-5), 40.0 (C-6), 30.9 (C-7), 133.3 (C-1′),112.4 (C-2′), 147.4 (C-3′), 144.4 (C-4′), 115.0 (C-5′),120.3 (C-6′), 132.9 (C-1′′), 129.1 (C-2′′, 6′′), 115.3(C-3′′, 5′′), 155.4 (C-4′′), 55.5 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6]，故鑒定化合物9為hexahydrodemethoxycurcumin-A。

化合物10：淡黃色油狀物。ESI-MSm/z: 233[M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT譜確定分子式為C13H22O2。1H-NMR (600 MHz DMSO-d6)δ: 2.34(1H, d,J= 17.4 Hz, H-2a), 2.00 (1H, d,J= 17.4 Hz,H-2b), 5.71 (1H, s, H-4), 3.53 (1H, m, H-9), 1.04 (1H,d,J= 6.0 Hz, H-10), 0.93 (1H, s, H-11), 0.99 (1H, s,H-12), 1.95 (1H, s, H-13)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 36.4 (C-1), 47.4 (C-2), 198.5 (C-3),124.6 (C-4), 166.4 (C-5), 50.6 (C-6), 26.1 (C-7), 38.9(C-8), 66.3 (C-9), 24.1 (C-10), 27.2 (C-11), 28.9(C-12), 24.5 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物10為blumenol C。

化合物11：白色粉末（甲醇）。mp 132～134 ℃。ESI-MSm/z: 205 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT 譜確定分子式為C9H10O4。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.35 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2), 7.31 (1H,d,J= 7.8 Hz, H-5), 6.80 (1H, dd,J= 7.8, 1.8 Hz,H-6), 4.22 (2H, m, H-2′), 1.27 (3H, t,J= 7.2 Hz,H-3′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 121.7 (C-1),116.2 (C-2), 150.4 (C-3), 145.0 (C-4), 115.3 (C-5),120.7 (C-6), 165.7 (C-1′), 60.0 (C-2′), 14.3 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物11為3,4-二羥基苯甲酸乙酯。

化合物16：黃色針狀結(jié)晶（甲醇）。mp 267～270 ℃。ESI-MSm/z: 295 [M+Na]+，結(jié)合13C-NMR、APT譜確定分子式為C15H12O5。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.71 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-2), 6.62 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-4), 6.56 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-8), 7.29(1H, d,J= 1.8 Hz, H-10), 2.77 (3H, s, 1-CH3), 3.93(3H, s, 9-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ:140.1 (C-1), 118.8 (C-2), 160.2 (C-3), 103.0 (C-4),167.3 (C-6), 99.8 (C-6a), 166.7 (C-7), 100.2 (C-8),168.4 (C-9), 105.1 (C-10), 139.9 (C-10a), 111.0(C-10b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物16為alternariol 9-methyl ether。

4 體外抗腫瘤活性

將對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞分別接種于96孔板上，每孔100 μL，在培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入藥物，使終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，陽性對照組加入等量的順鉑（DDP），對照組加入稀釋250倍的二甲基亞砜（DMSO），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，分別加入MTT（0.5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出吸去上清液，加入DMSO 150 μL震蕩溶解，在酶標(biāo)儀570 nm測定吸光度（A）值，根據(jù)A值計(jì)算半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50）。

實(shí)驗(yàn)以DDP（50 μmol/L）為陽性對照藥，檢測了16個(gè)化合物對HeLa細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞的體外抑制活性。結(jié)果表明化合物9、13可明顯抑制HeLa細(xì)胞，化合物13對HGC-27細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制活性，其余化合物未檢出有抑制活性。其IC50值見表1。

表1 化合物9、13對HeLa細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of compounds 9 and 13 on HeLa and HGC-27 cells

5 討論

分心木為核桃果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜，在民間藥用歷史悠久，維吾爾族百姓素有將其泡水代茶飲的習(xí)慣，有著良好的安眠和益腎的功效，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景[19]。并且其成分豐富，但目前對于分心木的相關(guān)研究仍然不夠透徹。本實(shí)驗(yàn)通過色譜方法結(jié)合波譜法，從分心木中首次分離了16個(gè)化合物，通過MTT法考察了所有化合物對腫瘤細(xì)胞的體外抑制活性，結(jié)果提示分心木具有潛在的抗腫瘤活性，旨在為分心木的新藥開發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突