張夢葩 曹代娣 景帆 李苗 劉艷

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是一種常見的口腔惡性腫瘤，其特征是局部浸潤和頸部轉(zhuǎn)移率高，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后差[1]。在過去幾十年里，OSCC患者的總體生存率并沒有顯著提高， 5 年生存率僅為50%～60%[2-3]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)被報(bào)道在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[4]，以癌基因或腫瘤抑制因子參與多種生理和病理過程，它的異常表達(dá)與癌癥預(yù)后密切相關(guān)[5]。lncRNA可以通過影響RNA聚合酶II的募集或誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)來調(diào)控基因表達(dá)[6]，或者與蛋白質(zhì)相互作用，影響蛋白活性或定位[7]。同源框A11反義RNA(HOXA11-AS)已被證實(shí)參與胃癌[8]、肝癌[9]、肺癌[10]等多種癌癥的進(jìn)展，在OSCC中，HOXA11-AS被報(bào)道參與調(diào)控細(xì)胞增殖[11]和順鉑耐藥[12]。

lncRNA可以通過與多梳復(fù)合體(polycomb repressive complex 2，PRC2)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)沉默基因表達(dá)[13]。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是PRC2的關(guān)鍵催化亞基(EZH2, SUZ12)，增強(qiáng)核小體組蛋白H3亞基27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)從而抑制基因表達(dá)[14-16]。

本研究檢測了HOXA11-AS和TFPI2在OSCC中的表達(dá)，以及沉默HOXA11-AS或過表達(dá)TFPI2后SCC-25細(xì)胞的生物學(xué)功能變化，通過RIP和ChIP等技術(shù)研究HOXA11-AS、EZH2和TFPI2之間的相互關(guān)系，旨在闡釋HOXA11-AS在OSCC進(jìn)展中的作用及調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HOXA11-AS，EZH2和TFPI2的小干擾RNA及陰性對照(北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司); Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，美國); TaqMan RNA Reverse Transcription試劑盒、TaqMan Universal PCR kit(Applied Biosystem，美國)； RNeasy mini kit、 Qproteome Mammalian Protein Prer kit(QIAGEN，德國)； GAPDH、EZH2、SUZ12、TFPI人源單克隆抗體(Upstake，美國)； Transwell小室(Greiner公司，美國)； CCK-8和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD，美國)。

1.2 臨床組織樣本獲取和細(xì)胞培養(yǎng)

西安大興醫(yī)院口腔科38 例OSCC患者的腫瘤組織和癌旁組織，獲取新鮮樣本保存于-80 ℃?；颊咝g(shù)前未接受過放療、化療等手段的干預(yù)。本研究經(jīng)西安大興醫(yī)院倫理研究委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署了知情同意書。

人正?？谇唤琴|(zhì)化細(xì)胞(NHOK)和OSCC細(xì)胞系(SCC-25)購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所(上海)， 置于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清， 100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，在含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將SCC-25細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)到60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)pcDNA3.1-TFPI2的質(zhì)粒(TFPI2)和空質(zhì)粒pcDNA3.1-NC(pcDNA)，轉(zhuǎn)染濃度為300 nmol/L。si-HOXA11-AS、si-EZH2、si-TFPI2等小干擾RNA (siRNA)，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L，陰性對照為si-NC。轉(zhuǎn)染48 h 后，RT-qPCR檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RT-qPCR檢測

使用TRIzol試劑從組織和細(xì)胞中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量PCR儀，以SYBR Green (Roche)在StepOnePlusTM系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，采集熒光并進(jìn)行分析。U6和GAPDH作為內(nèi)參， RNA的相對表達(dá)通過2-ΔΔCt公式計(jì)算。

1.5 蛋白印跡分析

用RIPA裂解液提取OSCC組織和細(xì)胞中的總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。用12%的SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。膜與稀釋后的一抗EZH2(1∶1000)、SUZ12(1∶1000)、TFPI2(1∶1000)4 ℃共孵育過夜；第二天， 將膜與相應(yīng)標(biāo)記的二抗(1∶600)室溫孵育1 h后用ECL試劑在凝膠成像系統(tǒng)中檢測蛋白信號，用Image J 對蛋白條帶定量分析。

1.6 亞細(xì)胞分離定位

使用PARIS 試劑盒分離SCC-25細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分。采用RT-qPCR檢測細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中HOXA11-AS的RNA水平。GAPDH為細(xì)胞質(zhì)對照，U6為細(xì)胞核對照。

1.7 RNA免疫沉淀(RIP)

使用EZ-Magna RIP試劑盒進(jìn)行RIP分析。SCC-25細(xì)胞在10 cm平板中生長，通過離心收集細(xì)胞，并在RIP裂解緩沖液中裂解，使得100 μL的裂解液含有1×107個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞裂解液和抗體EZH2，SUZ12，IgG以及磁珠在4 ℃孵育過夜。然后，洗滌珠子并與蛋白酶K孵育以除去蛋白質(zhì)。最后，使用特異性引物對純化的RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測。

1.8 RNA下拉分析

使用TranscriptAid T7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄HOXA11-AS，用生物素標(biāo)簽標(biāo)記HOXA11-AS序列，然后用RNase-free DNase I處理DNA，用RNeasy Plus Mini試劑盒純化。SCC-25細(xì)胞加入裂解液裂解1 h。隨后，生物素標(biāo)記的RNA與磁珠混合，與細(xì)胞裂解液孵育在4 ℃孵育6 h。最后，將珠子洗凈，用Western blot分析洗脫后的蛋白。

1.9 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)

細(xì)胞與1%甲醛交聯(lián)，收集細(xì)胞，超聲裂解。然后，將細(xì)胞裂解液與針對EZH2、H3K27me3或?qū)φ誌gG的抗體，以及瓊脂糖珠(Anti-Flag)4 ℃孵育過夜。孵育完成后，用預(yù)冷的TBS緩沖液洗滌瓊脂糖珠?；厥粘恋淼娜旧|(zhì)DNA，使用RT-qPCR進(jìn)行檢測。

1.10 細(xì)胞增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染48 h后，將OSCC細(xì)胞接種于96 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)制造商的說明書分別在24、 36、 48、 60和72 h向每孔加入20 μL CCK-8試劑， 37 ℃下孵育2 h， 450 nm波長處檢測吸光度值。

1.11 細(xì)胞侵襲分析

制備Transwell小室基質(zhì)膠，在上室加入100 μL無血清培養(yǎng)基，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL，將1×105的SCC-25細(xì)胞接種于上室，培養(yǎng)24 h后用40%的多聚甲醛固定， 0.1%的結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察穿過小孔細(xì)胞數(shù)目，并拍照記錄。

1.12 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將SCC-25細(xì)胞以1×105接種于6 孔板，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌。之后將細(xì)胞胞分散在1 mL可滲透膜的碘化丙啶(50 μg/mL)中，并在黑暗中于4 ℃孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HOXA11-AS沉默抑制OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

SCC-25細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了si-HOXA11-AS后，HOXA11-AS的表達(dá)顯著降低(圖 1)。沉默HOXA11-AS后會顯著抑制SCC-25細(xì)胞的增殖和侵襲能力(圖 1)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖 1)。

圖 1 沉默HOXA11-AS對OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

2.2 在SCC-25細(xì)胞中HOXA11-AS通過與EZH2結(jié)合抑制TFPI2轉(zhuǎn)錄

亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS主要位于SCC-25細(xì)胞核中，可以直接與EZH2蛋白相互結(jié)合，敲除EZH2后，TFPI2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(圖 2)，TFPI2啟動子區(qū)域EZH2和H3K27me3的富集減少，尤其是EZH2的富集顯著減少(圖 2)。

圖 2 在OSCC-25細(xì)胞中HOXA11-AS通過與EZH2結(jié)合抑制TFPI2的轉(zhuǎn)錄

2.3 過表達(dá)TFPI2對OSCC-25細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡的影響

過表達(dá)TFPI2的SCC-25細(xì)胞中TFPI2的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞增殖能力顯著減弱，侵襲數(shù)顯著減少(圖 3)，細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)(圖 4)。

圖 3 過表達(dá)TFPI2抑制OSCC-25細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.4 HOXA11-AS通過沉默OSCC-25中的TFPI2發(fā)揮致癌活性

si-HOXA11-AS沉默后HOXA11-AS的表達(dá)量顯著降低，而HOXA11-AS沉默誘導(dǎo)的TFPI2表達(dá)增加被TFPI2的敲除所抑制(圖 4)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，沉默HOXA11-AS抑制了SCC-25細(xì)胞的增殖、侵襲，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，但這種作用在沉默TFPI2后消失。

圖 4 HOXA11-AS通過沉默OSCC中的TFPI2發(fā)揮致癌活性

3 討 論

HOXA11-AS是lncRNA的一種新型生物標(biāo)志物，已被報(bào)道在多種癌癥中上調(diào)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。在研究中，OSCC組織和細(xì)胞系中HOXA11-AS的表達(dá)水平顯著上調(diào)，敲除HOXA11-AS可顯著抑制OSCC細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與本研究一致的是Chen等[10]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中HOXA11-AS表達(dá)上調(diào)，預(yù)后不良。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)，HOXA11-AS可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移和侵襲。因此，本研究確定HOXA11-AS是作為一種促癌因子參與了OSCC的調(diào)控，但其調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

亞細(xì)胞分級檢測，發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS主要位于細(xì)胞核部分，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控靶基因。此外，還發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS可以直接與EZH2結(jié)合。而在許多惡性腫瘤中，EZH2的異常表達(dá)被報(bào)道與多種細(xì)胞過程相關(guān)，在舌鱗癌中EZH2的表達(dá)陽性率為77.0%[17]。推測HOXA11-AS參與OSCC發(fā)病過程是通過EZH2實(shí)現(xiàn)的。

本研究將SCC-25細(xì)胞中的HOXA11-AS敲除，TFPI2 的表達(dá)上調(diào)，而沉默EZH2后，TFPI2 的表達(dá)也顯著升高,表明TFPI2是OSCC細(xì)胞中XOXA11-AS的一個(gè)新靶點(diǎn)。而EZH2通過催化核小體組蛋白H3亞基27位懶氨酸的三甲基化(H3K27me3)負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄，HOXA11-AS可以通過介導(dǎo)H3K27me3修飾將EZH2募集到TFPI2啟動子區(qū)域，并抑制其轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)與之前在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌和肝癌[9]中的研究報(bào)道一致，HOXA11-AS通過與表觀遺傳蛋白(如EZH2、LSD1、CBP)相互作用，部分抑制下游靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮致癌作用。

組織因子途徑抑制劑2(TFPI2)作為抑癌因子在膀胱癌[18]、結(jié)腸癌[19]、乳腺癌[20]等多種腫瘤中發(fā)揮活性。本研究中，TFPI2在OSCC組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)，過表達(dá)TFPI2降低OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這與之前的報(bào)道結(jié)果一致，TFPI2在OSCC患者和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)TFPI2能夠延長患者的生存期[21]，降低OSCC的侵襲性，干擾細(xì)胞轉(zhuǎn)移[22]。研究還發(fā)現(xiàn)沉默TFPI2能夠逆轉(zhuǎn)HOXA11-AS敲低誘導(dǎo)的SCC-25細(xì)胞抗增殖、抗侵襲和促凋亡作用。

總之，HOXA11-AS可以通過結(jié)合招募EZH2來沉默TFPI2，從而促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)OSCC的進(jìn)展。HOXA11-AS的發(fā)現(xiàn)為OSCC治療提供了一個(gè)潛在的分子治療靶點(diǎn)。