林詩晗 鄒璐寧 林雪梅 劉熠娟 葛欣婷 李遙遙 傅升 呂紅兵

頭頸癌是最常見的癌癥之一，鱗狀細胞癌占頭頸癌病例的90%以上[1]，口腔則是頭頸部區(qū)域鱗狀細胞癌最常見的部位?？谇击[狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)的病因包括吸煙、飲酒等[2]，研究表明，各期OSCC五年生存率約為50%～60%[3-5]。如果患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移，總生存率更低[6]，在過去的十幾年里沒有明顯的改變。基因(DNA或RNA)甲基化作為表觀遺傳機制之一，在基因穩(wěn)定和基因表達中起重要作用[7]。異常甲基化可能是導(dǎo)致腫瘤基因功能喪失的重要機制[8]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，研究顯示，lncRNA可能是癌癥中表觀遺傳失調(diào)的靶標[9]。鑒于OSCC的發(fā)生發(fā)展受多層面的調(diào)控，因此，多方位闡明OSCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，探討lncRNA異常甲基化及其生物學(xué)作用，是為OSCC診斷和預(yù)后判斷提供潛在生物標志物的臨床新策略。

1 材料與方法

1.1 甲基化數(shù)據(jù)的收集及處理

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載OSCC腫瘤組織和癌旁正常組織的甲基化數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息，Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片用于獲得基因甲基化數(shù)據(jù)。從GEO數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE87053芯片對基因甲基化數(shù)據(jù)進行進一步驗證和篩選。通過R軟件的ChAMP包篩選差異甲基化位點(|Δβ|> 0.10,P<0.05,adj.P<0.05)。

1.2 差異表達lncRNA和mRNA的篩選

從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取OSCC的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)和臨床信息，該數(shù)據(jù)由mRNA和lncRNA表達譜組成。使用R3.6.0的DeSeq2軟件包(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)篩選差異表達lncRNA和mRNA(P<0.05,adj.P<0.05,倍數(shù)>2)。

1.3 差異甲基化基因的篩選

通過 GENCODE 28V 探針對TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)進行甲基化注釋，包括轉(zhuǎn)錄起始點(TSS)和基因編碼區(qū)(body)。將差異表達的lncRNA和甲基化數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，選擇甲基化與表達相反的lncRNA為候選基因： (1)低甲基化、高表達； (2)高甲基化、低表達。對lncRNA和差異甲基化位點進行Cox回歸分析及GSE52793芯片驗證，獲得與預(yù)后相關(guān)lncRNA(P<0.05)。使用X-tile software version 3.6.1(耶魯大學(xué)，康涅狄格州紐黑文，美國)確定最佳臨界值，將患者分為高甲基化組和低甲基化組。

1.4 差異甲基化基因與預(yù)后的關(guān)系

使用 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(https://km-plot.com/analysis)預(yù)測高甲基化組和低甲基化組的總生存期(OS)。單因素和多因素分析用于識別潛在的生物標志物。繪制3 年和5 年ROC曲線評估預(yù)后相關(guān)lncRNA的生物學(xué)性能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析和繪圖使用R(v.3.6.0)軟件。Kaplan-Meier用于生存分析；在3年和5年的生存數(shù)據(jù)中，通過區(qū)分曲線所產(chǎn)生的曲線下面積(AUC)，從而評估基因的預(yù)后相關(guān)性；Cox回歸模型用于單因素和多因素分析。對于所有統(tǒng)計方法，P<0.05被認為具有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 差異甲基化位點及差異表達的lncRNA和mRNA

研究從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得346 例腫瘤組織和50 例癌旁正常組織的數(shù)據(jù)，從GEO數(shù)據(jù)庫獲得11 例腫瘤組織和10 例癌旁正常組織的數(shù)據(jù)?；跀?shù)據(jù)庫分析，篩選出OSCC中93 746 個(TCGA)和60 885 個(GEO)差異甲基化位點(圖 1)。另外，與正常組織相比，OSCC中總共有13 964 個lncRNA和mRNA具有顯著差異表。

2.2 差異甲基化基因：SFTA1P，AL049775.2，AL445250.1和KCNMB2-AS1

通過檢測位于轉(zhuǎn)錄起始點(TSS)和基因編碼區(qū)(body)的位點，TSS有5 213 個， body有14 233 個差異甲基化位點，將重復(fù)數(shù)據(jù)刪除后共獲得3 696 個獨立位點。將3 696 個位點與GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的60 885 個位點進行比對，獲得1 522 個差異甲基化位點，其中1 521 個位點在兩個數(shù)據(jù)庫中顯示出一致的趨勢。甲基化與表達相反的lncRNA為1 282 個。單變量Cox回歸分析顯示， 53 個lncRNA具有預(yù)后意義?；?3 個lncRNA的多變量Cox回歸分析及GSE52793芯片的預(yù)后信息，確認4 個lncRNA具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：SFTA1P，AL049775.2，AL445250.1和KCNMB2-AS1(圖 2)。

圖 1 口腔鱗狀細胞癌與正常組織的差異甲基化位點

圖 2 SFTA1P，AL049775.2，AL445250.1和KCNMB2-AS1在癌組織和正常組織中的甲基化水平

2.3 與患者診斷和預(yù)后相關(guān)性

Kaplan-Meier生存分析顯示，基于TCGA數(shù)據(jù)庫，SFTA1P，AL049775.2，AL445250.1和KCNMB2-AS1甲基化水平較高的患者(high expression)比較低的患者(low expression)具有更好的生存率，使用GEO數(shù)據(jù)庫驗證出現(xiàn)相同的情況(圖 3)。ROC曲線顯示，在3 年生存分析中AL445250.1的敏感性和特異性最高，在5 年中SFTA1P最高(圖 4)。單因素分析顯示這4 個lncRNA與患者生存率顯著相關(guān)。

圖 3 口腔鱗狀細胞癌患者總生存期

圖 4 SFTA1P，AL049775.2，AL445250.1和KCNMB2-AS1甲基化判斷口腔鱗狀細胞癌3年和5年生存率的ROC曲線分析

多因素分析發(fā)現(xiàn)，AL049775.2、TNM分期和年齡是獨立的預(yù)后指標，與患者生存率顯著相關(guān)(表 1)。

表 1 影響口腔鱗狀細胞癌預(yù)后單因素和多因素分析

3 討 論

OSCC患者長期生存不佳及有效判斷預(yù)后工具的匱乏，迫切需要具有理想預(yù)測能力的新型標志物以幫助癌癥的治療和預(yù)后的管理。近年來，越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在癌癥中發(fā)揮著重要作用[10]。lncRNA甲基化通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性等修飾DNA序列，進一步控制基因表達，參與各類癌癥的發(fā)生發(fā)展[11]。有研究表明，MEG3高甲基化通過影響細胞遷移和增殖促進胃癌的發(fā)展[12]。Wang等也通過表觀遺傳數(shù)據(jù)成功驗證了在癌癥中差異表達的lncRNA受基因甲基化水平調(diào)控[13]。

本研究通過分析基因甲基化芯片和表達譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)4個基因的甲基化水平對OSCC有重要的影響：SFTA1P，AL049775.2，AL445250.1和KCNMB2-AS1。它們可能成為評估OSCC患者預(yù)后的新型生物標志物。

目前，有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00475，LINC01352，MIR503HG和LINC01143共同組成風(fēng)險評估模型時，可以作為生物標志物指導(dǎo)患者的個性化治療，為當(dāng)前的臨床策略增加預(yù)后評估價值[14]。AL049775.2，AL445250.1，KCNMB2-AS1和SFTA1P似乎也可以一起作為OSCC臨床預(yù)后評估系統(tǒng)，但尚需進一步證實。

在本研究中，與正常組織相比，OSCC中SFTA1P的甲基化水平明顯降低，SFTA1P高甲基化組患者的總生存期顯著高于低甲基化組。另外，SFTA1P的異常甲基化區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點，其可能與OSCC具有更好的相關(guān)性。研究表明，在OSCC中，P15和P16這兩個抑癌基因的啟動子甲基化狀態(tài)可能是早期癌變的標志物[15]；MEG3的過表達受DNA甲基化影響，抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。然而，目前尚未見報道SFTA1P的甲基化水平是否影響OSCC的進展。

綜上，這4個lncRNA的甲基化水平可能成為生物標志物，為OSCC的預(yù)后提供一個新的搜索平臺。然而，本研究還存在一定的局限性。首先，數(shù)據(jù)來自TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，樣本僅限于某些種族；其次，本研究未經(jīng)臨床樣本和實驗研究的驗證，以上所有結(jié)果還需通過一系列分子生物學(xué)實驗驗證。