張薇 王偉 蘇少晨

重金屬污染對人體健康的影響是全球最為嚴(yán)重的環(huán)境問題之一[1]。由于這些重金屬有不可降解的特性，經(jīng)口、經(jīng)皮膚從土壤、水中攝入，通過食物鏈途徑進入人體[2]。當(dāng)環(huán)境中的重金屬儲集過量造成污染時，對人體多器官造成危害，同時引發(fā)過敏反應(yīng)，造成神經(jīng)變性，甚至引發(fā)癌癥[3-4]。

牙周疾病屬于內(nèi)源性感染性疾病，從微生物、環(huán)境等因素綜合研究其發(fā)病機制，是口腔生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。有研究發(fā)現(xiàn)，血液中鉛和汞含量是牙周炎的潛在危險因素之一，可導(dǎo)致牙周組織附著喪失[5]，環(huán)境中鎘的暴露，也會增加牙周病患病的機率[6]。可見重金屬與牙周炎有密切相關(guān)性，但是潛在的生物學(xué)機制仍需要大量的研究來證明。

中國甘肅省金昌市被譽為“鎳都”，在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，大量的金屬釋放到環(huán)境中，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)鼐用竦慕】礫7]。本文通過高通量測序方法，以冶煉區(qū)為實驗區(qū)，以金昌市區(qū)和甘肅省武威地區(qū)作為第一、第二對照區(qū)，研究重金屬累積對口腔微生物菌群結(jié)構(gòu)及牙周病發(fā)生情況的影響，揭示重金屬累積與口腔微生物之間的相互關(guān)系，為金昌冶煉區(qū)人群口腔保健及疾病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象的選擇及分組

選取對象：武威市人民醫(yī)院和金昌市八冶醫(yī)院口腔科進行體檢的患者(均為附近常駐居民)，金昌市鎳冶煉廠的工作人員，年齡范圍32～56 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無全身系統(tǒng)性疾病； (2)過去3 個月未服用抗生素； (3)無飲酒史； (4)無懷孕和哺乳的婦女; (5) 6 個月之內(nèi)未進行任何牙周治療; (6)無齲病; (7)口腔內(nèi)無任何修復(fù)體。根據(jù)文獻[8]，選取的牙周炎標(biāo)準(zhǔn)為：全口至少 4 顆牙有 1 個或多個位點 PD≥4 mm，CAL≥1 mm，并有探診出血。

對受測人群進行口腔檢查，根據(jù)地區(qū)和是否為牙周炎兩個條件，分為4 組，(1)武威地區(qū)非牙周病組9 人(正常WWC組)； (2)武威地區(qū)牙周病組9 人(WWP組)； (3)金昌礦區(qū)非牙周病組7 人(JCP組); (4)金昌礦區(qū)牙周病組9 人(KP組)。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)進行(批號： 2018A-100)，所有參與實驗人群均知曉實驗內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 唾液采樣

采集受檢者的唾液樣本，防止血液污染。采集前30 min，未進食、飲水、吸煙或嚼口香糖等，用飲用水將口腔內(nèi)的雜物洗漱干凈。讓受檢者對準(zhǔn)唾液收集漏斗，在30 min內(nèi)自然排出唾液共4 mL，打開DNA保存液管，倒入唾液采集器內(nèi)，擰掉漏洞，擰緊管帽，上下混勻管內(nèi)液體，完成樣本采集，放入-80 ℃冰箱保存。

1.3 DNA提取和建庫測序

采用MOBIO和MN試劑盒的使用說明操作，提取樣品總DNA，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，質(zhì)檢合格的文庫用高通量測序儀(Illumina， HiSeq 2500，美國)進行測序。Illumina HiSeq測序平臺得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Sequenced Reads)。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

高通量測序數(shù)據(jù)用百邁克計算平臺進行分析。根據(jù)PE reads之間Overlap關(guān)系，將Hiseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(Merge)成一條序列Tags，同時對Reads的質(zhì)量和Merge的效果進行質(zhì)控過濾。主要有3 個步驟： (1)PE reads拼接：使用 FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的 reads 進行拼接，得到 的拼接序列即原始 Tags 數(shù)據(jù)(Raw Tags)； (2)Tags過濾：使用 Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags進行過濾，得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)(Clean Tags)； (3)去除嵌合體：使用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù) (Effective Tags)。

1.5 統(tǒng)計分析

使用方差分析(ANOVA)評估4 組菌群相對豐度差異。使用Wilcoxon檢驗對各組之間的Alpha多樣性指數(shù)進行比較。相關(guān)性熱圖是在屬水平上，用SparCC算法，閾值>0.1，P<0.05計算得出。功能預(yù)測工具使用Picrust2，統(tǒng)計分析使用SPSS版本22.0。

2 結(jié) 果

2.1 樣本的細(xì)菌組成

所有2 279 667 個高質(zhì)量序列都以97%的相似度聚類到OTU中。從樣本中總共檢測到12 個細(xì)菌門，19 個綱，34 個目， 59 個科和109 屬。圖 1顯示了所有樣本在門和屬水平上的口腔唾液菌群組成。在門水平上(圖 1)， 4 個組的唾液微生物優(yōu)勢菌群分別為：擬桿菌門(Bacteroidetes)(24.03%，24.58%，23.44%，25.95%)；厚壁菌門(Firmicutes)(17.01%，15.99%，25.78%，27.54%)；梭桿菌門(Fusobacteria)(19.89%，19.60%，19.15%，25.06%)，變形菌門(Proteobacteria)(23.95%，26.23%，17.38%，8.16%)，放線菌門(Actinobacteria)(9.30%，9.04%，8.41%，5.87%)；Patescibacteria菌門(1.84%，2.09%，2.55%，2.75%)，ANOVA分析(圖 2)，F(xiàn)irmicutes的含量在KP組高于其他3 組(P=0.0054)，Proteobacteria的含量在WWP組最高(P=0.009 8)。在屬水平上(圖 1)， 4 個組的唾液微生物優(yōu)勢菌群分別為：纖毛菌屬(Leptotrichia)(10.84%, 11.33%, 11.88%,14.92%)；梭桿菌屬(Fusobacterium)(9.05%, 8.27%, 7.25%, 10.14%)，奈瑟氏球菌屬(Neisseria)(10.40%, 13.65%, 7.08%, 3.28%)，二氧化碳噬纖維菌屬(capnocytophaga)(9.91%, 9.79%, 5.88%, 3.26%)，韋榮球菌屬(Veillonella)(2.73%, 3.73%, 10.48%, 9.22%)棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(7.15%, 6.04%, 5.19%, 3.92%)，通過方差分析(圖2)，在4 個分組中，顯著差異的有2 個菌屬， KP組的韋氏球菌屬(Anaeroglobus)(P=0.003 1)，新月形單胞菌屬(Selenomonas)(P=0.002 2)含量高。

圖 1 細(xì)菌種類的相對豐度柱形圖

圖 2 4 組菌群含量差異分析

2.2 4 個分組的唾液微生物Alpha多樣性分析

Simpson， Chao指數(shù)和ACE指數(shù)(表 1)在四組之間無顯著差異，可見將四組菌群的相對豐度進行比較時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義； Shannon指數(shù)反映樣品中微生物多樣性，可見KP組的物種多樣性最高，與WWP組存在差異,P<0.05)。

表 1 樣品Alpha多樣性分析

2.3 相關(guān)性熱圖分析

圖 3顯示了口腔唾液微生物與環(huán)境之間的相關(guān)性。屬水平上，相關(guān)系數(shù)閾值0.1。Capnocytophaga,Neisseria,Streptococcus與PH呈正相關(guān)，Capnocytophaga,Neisseria,Aggregatibacter,Streptococcus與Cr, Ni, Cu均呈正相關(guān)，Treponema_2,Alloprevotella,Fusobacterium,Prevotella_7,Prevotella_2,Prevotella,Selenomonas_3與PH呈負(fù)相關(guān)，Campylobacter,Selenomonas,Prevotella_2,Prevotella,Selenomonas_3與Cr, Ni, Cu均呈負(fù)相關(guān)。Lachnoanaerobaculum,Leptotrichia,Porphyromonas,uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae,Veillonella,Actinomyces,Corynebacterium與環(huán)境因子變化無顯著相關(guān)性。

圖 3 相關(guān)性熱圖分析

2.4 WWC組與KP組和WWP組與KP組的KGEE功能預(yù)測分析

通過KEGG代謝途徑的差異分析，可以觀測兩兩分組的樣品之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化(圖 4)。

圖 4 第二層級下KEGG代謝途徑的差異分析圖

3 討 論

本實驗結(jié)果表明，實驗組與對照組在門水平上，優(yōu)勢菌群組成類似，這與其他研究結(jié)果一致[9-11]。但是，四組優(yōu)勢菌群相對豐度比例不同，在重金屬含量高地區(qū)排列前三的優(yōu)勢菌門占比較高， 尤以厚壁菌門的相對豐度明顯高于其他三組；后壁菌門下的菌屬較多，如：乳桿菌屬(Lactobacillus)， 新月形單胞菌屬(Selenomonas)、真桿菌屬(Eubacterium)等，與齲病和牙周病均有相關(guān)性[12-13]。Spirochaetes是牙周致病菌， 雖然它并不是優(yōu)勢菌群，但它的的平均相對豐度在武威非牙周患者群中最高。因此，本文中牙周致病菌豐度差異不同可能與地域和環(huán)境不同有關(guān)[14]。在Alpha多樣性分析得出：KP組的物種多樣性最高，說明礦區(qū)牙周炎患者口腔微生物多樣性是增加的，之前的研究也已證實，患牙周炎的人群口腔的菌群豐度和多樣性明顯大于健康人群[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)， Cr, Ni, Cu與Capnocytophaga,Neisseria,Aggregatibacter,Streptococcus、Campylobacter,Selenomonas,Prevotella等細(xì)菌具有相關(guān)性，是引起菌群結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子。即使在低濃度下，唾液中的重金屬含量也可能會影響口腔健康，會使微生物的組成發(fā)生變化[16]，基于鈷鉻(Co-Cr)合金上的微生物細(xì)胞數(shù)量和生物膜上的密度比基于鈦合金上的高，金屬腐蝕，離子析出，也會造成微生物群落結(jié)構(gòu)變化[17]。土壤重金屬污染可能會導(dǎo)致土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，再通過食物鏈進入人體[18]，因此，在金昌冶煉廠中，土壤中重金屬含量可能會通過影響口腔菌群相對豐度和多樣性來加快牙周炎的發(fā)生發(fā)展。

微生物群的組成和代謝活性取決于宿主和環(huán)境因素[19]。本研究顯示，KP組與WWC組人群和WWP組人群的細(xì)菌基因功能有差異，礦區(qū)牙周炎患者的唾液微生物基因表達(dá)特征及功能代謝的不同反映了微生物對環(huán)境的適應(yīng)性和應(yīng)激性，KP組的細(xì)菌脂質(zhì)代謝和其他氨基酸代謝功能降低，可能是由于重金屬離子污染了微生物可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，對細(xì)菌蛋白質(zhì)的生物合成和次生代謝物的形成有一定的抑制作用[20]。同時，重金屬離子可能還參與到細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，翻譯，核苷酸代謝等方面，加快了細(xì)菌的生長和死亡周期，有助于提高微生物對重金屬離子引起的口腔唾液微環(huán)境改變的適應(yīng)能力[21]。綜上所述，長期暴露在重金屬環(huán)境中可能會改變細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。