陳婉紅 蔡世雄 蘇江凌

在正畸治療中牙齒移動是一個受外部拉伸應力刺激和維持的過程，牙周組織改建在這一過程中發(fā)揮重要作用[1-2]，因此探究能有效加快牙齒移動、促進牙周組織改建的藥物仍是近年來的研究熱點。雙磷酸鈉是用于各類鈣代謝、骨類疾患的一類新型藥物，能與骨中的羥磷灰石結合，常用于骨質疏松、高鈣血癥、骨痛癥等疾病的治療[3]，曾婧等[4]研究發(fā)現給正畸牙大鼠模型第一磨牙近中腭側粘骨膜下注射第二代雙磷酸鈉(帕米膦酸鈉)可減少牙周組織壓力側破骨牙質細胞數量，對正畸治療效果具有較好的作用。利塞膦酸鈉是第三代雙磷酸鈉，常用于類風濕性關節(jié)炎[5]、絕經后骨質疏松癥[6]的預防和治療，其與正畸牙治療的影響尚未見報道，本研究通過建立正畸牙移動大鼠模型，探究利塞膦酸鈉對模型大鼠牙齒移動及牙周組織改建的影響，為臨床改進正畸牙治療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

60 只SPF級SD雄性大鼠[廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK(粵)2018-0002]。所有大鼠均于本院動物房中飼養(yǎng)，晝夜交替(12 h/12 h)，實驗期間自由飲食、飲水，動物房環(huán)境保持清潔、透氣，溫度約25 ℃，相對濕度約50%。本研究經動物倫理委員會批準同意，在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑及儀器

利塞膦酸鈉、HE染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(貨號：IR0520、G1120、DA1010)(北京索萊寶科技有限公司)； 兔源抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)一抗、羊抗兔二抗(貨號： ab65854、ab150077)(Abcam， 美國)；HY-1070自動組織脫水機(浙江金華惠友儀器)； MA752組織切片機(Campden公司, 英國)； BioScope Resolve倒置光學顯微鏡(BRUKER, 美國)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥 按照隨機數字表法將SD大鼠分為對照組、利塞膦酸鈉低劑量組、利塞膦酸鈉中劑量組、利塞膦酸鈉高劑量組，每組15 只。正畸牙移動大鼠模型的構建參考文獻[7]，腹腔注射1%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后持仰臥位固定，撐開大鼠口腔并消毒，將直徑約為0.2 mm的結扎絲從大鼠上頜左側第一、二磨牙接觸點穿過，與正畸用的鎳鈦螺旋拉簧相連，將鎳鈦螺旋拉簧拉開(加載正畸負荷力0.49 N)，固定于兩個中切牙牙頸部，安裝矯治器后將大鼠置于溫暖的環(huán)境中，待其蘇醒，每日檢查結扎絲、拉簧情況，每周加力一次。

利塞膦酸鈉給藥劑量參照人體表法計算，成年人標準體重60 kg，對應給藥劑量為成人的6.3 倍，成人利塞膦酸鈉每日用量為5 mg/d[8]，則設置利塞膦酸鈉低、中、高劑量組大鼠每日給藥劑量分別為0.25、 0.5、1 mg/kg·d。 對照組用生理鹽水替代，分別在安裝鎳鈦螺旋拉簧矯治器前3 d給藥處理，連續(xù)灌胃21 d。

1.3.2 大鼠牙周組織標本獲取 分別在第7、 14、 21 天分批麻醉處死大鼠，每批處死5 只，將大鼠呈仰臥位固定，剪開大鼠胸腹部皮膚，打開胸腔暴露心臟，分離大鼠主動脈，用0.9%生理鹽水進行心臟灌注，觀察到大鼠肝臟變白后灌注4%的多聚甲醛，待大鼠四肢僵硬、尾部末端彎起停止灌注。分離大鼠上頜骨，保留第一、二磨牙剪去多余軟硬組織。

1.3.3 大鼠正畸牙移動距離測定 用游標卡尺測定各批次各組大鼠第一、二磨牙之間的間隙，每個標本測定3 次，取平均值為正畸牙移動距離。

1.4 大鼠牙周組織HE染色觀察

取大鼠牙周組織，用預冷的生理鹽水沖洗干凈后進行修剪，于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，用10%EDTA溶液4 ℃脫鈣處理12周，用蒸餾水沖去殘留在牙周組織上的溶劑，用梯度酒精進行脫水處理，二甲苯溶液進行透明處理，將脫水透明的組織塊浸于融化的石蠟中進行包埋處理，待其凝固后進行修剪并切成厚度約3 μm的切片。將石蠟切片攤附在載玻片上，經烤片機烤片2 h，經過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、蘇木素染色5 min、返藍、伊紅染色10 s、中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察并分析，具體操作參考HE染色試劑盒說明書。

1.5 大鼠牙周組織TRAP免疫組化染色

取2.4中大鼠常規(guī)石蠟切片， 56 ℃恒溫箱中烘片6 h，經梯度二甲苯脫蠟處理，梯度乙醇脫水處理，用10%的檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，用3%的甲醇過氧化氫浸泡10 min后用PBS緩沖液沖洗3 次，加入兔源TRAP一抗(1∶100)， 27 ℃孵育60 min，PBS緩沖液沖洗后加入羊抗兔二抗，經過DAB顯色、自來水沖洗、蘇木素復染、稀鹽酸分化、脫水、透明封片后于顯微鏡下觀察。同時對陽性破骨細胞進行計數，陽性表達為棕黃色。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 利塞膦酸鈉對大鼠正畸牙移動距離的影響

正畸牙移動距離與加力時間之間存在交互作用(P<0.05)；隨著加力時間的延長，各組大鼠正畸牙移動距離逐漸增加(P<0.05)。第7 d，與對照組相比，利塞膦酸鈉低劑量組大鼠正畸牙移動距離無顯著差異(P>0.05)，利塞膦酸鈉中、高劑量組大鼠正畸牙移動距離顯著增高(P<0.05)；第14、 21 天，與對照組相比，利塞膦酸鈉各劑量組大鼠正畸牙移動距離顯著高于對照組(P<0.05)，且呈現一定的劑量效應關系，其中利塞膦酸鈉高劑量組效果較好(表 1)。

表 1 各組大鼠正畸牙移動距離比較

2.2 利塞膦酸鈉對大鼠牙周組織病理學變化的影響

不同時間點各組大鼠牙周組織HE染色圖(圖 1)中均可見張力側牙周韌帶受牽拉；第7 天，各組大鼠壓力側可見大量破骨細胞及蠶食的Howship陷窩，利塞膦酸鈉各劑量組比對照組明顯，其中利塞膦酸鈉高劑量效果較明顯；第14、 21 天，破骨細胞、Howship陷窩數目顯著減少，其中利塞膦酸鈉高劑量組降低效果較明顯。

圖 1 各組大鼠牙周組織病理學觀察(HE)

2.3 利塞膦酸鈉對大鼠TRAP染色結果的影響

由圖 2可觀察到破骨細胞多分布于牙周膜、牙槽窩、 Howship陷窩內，部分位于牙槽骨內，第7 天，破骨細胞數目增多，第14、 21 天，破骨細胞數目減少。

2.4 利塞膦酸鈉對大鼠破骨細胞數量的影響

第7 天，各組大鼠牙周組織中破骨細胞數量顯著高于第14、 21 天。 第14、 21 天，各組大鼠牙周組織中破骨細胞數量逐漸減少(P<0.05)； 第7、 14、 21 天，與對照組相比，利塞膦酸鈉各劑量組大鼠牙周組織中破骨細胞數量顯著升高(P<0.05)，且呈現一定的劑量效應關系，其中利塞膦酸鈉高劑量組效果較優(yōu)(表 2)。

表 2 各組大鼠牙周組織中破骨細胞數目

3 討 論

正畸治療是通過各種矯正裝置調節(jié)面部骨骼、牙齒、神經、肌肉之間的協調性，達到口頜系統的平衡、穩(wěn)定、 美觀， 許多患者因為矯正時間過長、 牙周組織病變等原因放棄矯正[9]。正畸過程中牙齒被移動到新的位置，牙周組織功能發(fā)生一定的改變，同時可能并發(fā)牙周炎、牙齒變色、釉質脫鈣等不良表現，因此，如何安全有效的促進牙齒移動、有效維持牙周組織的健康是牙科醫(yī)師關心的重要問題之一[10-11]。

正畸牙移動的生物學基礎是正畸力作用下牙周組織的重建，牙受力后，牙槽骨、牙周膜等牙周組織會將這種壓力刺激信號轉化為生物學信號進行傳遞，引起相關細胞(破骨細胞、成骨細胞)的生物化學反應，促使牙周組織重建[12-13]。正畸牙移動過程中，破骨細胞的活性和數量決定了牙齒移動的速率，正畸牙移動前期破骨細胞來自于局部的牙槽骨、牙周膜，后期來源于破骨前體細胞，破骨細胞是一類惰性細胞，主要通過成骨細胞誘導活化，活化的破骨細胞可促進骨吸收，進而促進牙齒的移動[13-14]。二膦酸鹽類藥物是一類抗骨吸收的藥物，能緊緊吸附在骨中羥磷灰石的表面并與之緊密結合，可選擇性進入成熟破骨細胞中，抑制成骨細胞活性進而引起破骨細胞凋亡、減弱骨吸收能力[15-16]。李向宇等[17]研究發(fā)現第3 代膦酸鹽(阿侖膦酸鈉)可加速正畸牙移動后保持期破骨細胞的分化，增加牙周組織的改建速度，有利于正畸牙移動后盡快穩(wěn)定在新的位置上。鄒亞楠等[18]研究發(fā)現局部注射第2 代膦酸鹽(帕米膦酸鈉)、第3 代膦酸鹽(伊班膦酸鈉)可減輕正畸牙大鼠牙根吸收程度，對于正畸治療過程中牙根吸收具有一定的預防作用。利塞膦酸鈉是第3 代二膦酸鹽類藥物，是治療骨質疏松癥、骨腫瘤和骨轉移的常用藥物[19-20]，本研究結果顯示，灌胃利塞膦酸鈉后大鼠正畸牙移動距離逐漸增加，正畸牙移動前期(第7 天)，各組大鼠牙周組織中破骨細胞數量顯著高于第14、 21 天， Howship陷窩較多，骨吸收程度加深，牙齒移動速度較快；后期(第14、 21 天)破骨細胞數量呈現下降趨勢，其中利塞膦酸鈉各劑量組大鼠牙周組織中破骨細胞數量顯著高于對照組，提示利塞膦酸鈉能加速大鼠正畸牙移動，增加牙周組織中破骨細胞數量，加速牙周組織改建，其中高劑量的利塞膦酸鈉效果較優(yōu)。

綜上所述，利塞膦酸鈉能促進大鼠正畸牙移動，增加大鼠牙周組織中破骨細胞數量，促進牙周組織改建，但在長期正畸治療過程中利塞膦酸鈉的有效性和安全性還有待研究。