梁思怡，紀(jì)勝男，田璐肖，智靜驛，李麗麗，哈婧

(1.河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北御芝林藥業(yè)有限公司，河北 邢臺(tái) 054400)

艾葉(Artemisiaargyi)為菊科多年生草本植物，又名冰臺(tái)、炙草等[1].夏季花未開時(shí)采摘其干燥葉，可全草入藥，味辛、苦，對(duì)慢性支氣管炎、肺氣腫、肝炎、哮喘等疾病都有療效[2-4].艾葉主要含有揮發(fā)油、酚類、鞣質(zhì)、苯丙素類等活性物質(zhì)[5-6]，具有抗真菌、細(xì)菌、病毒感染、各種炎癥等作用[7-8].中藥配方顆粒，是將單味中藥飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒、包裝等過程制成的純中藥產(chǎn)品，是傳統(tǒng)中藥的一種新的用藥形式[9-10]，有方便攜帶、無需煎煮、便于醫(yī)生調(diào)劑等優(yōu)點(diǎn)[11-13].配方顆粒在制備過程中以“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”為參照物，制備過程中經(jīng)高溫煎煮后，揮發(fā)油成分會(huì)隨水蒸氣蒸餾，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油為主要成分的藥物有效成分散失[14].β-CD是由淀粉在微生物酶作用下產(chǎn)生的環(huán)狀低聚糖，在現(xiàn)代的制劑生產(chǎn)中一般使用β-CD與揮發(fā)油制成包合物[15-16].鄒新成[17]通過對(duì)揮發(fā)油的包合率、收得率及綜合評(píng)分進(jìn)行考查，用氣相色譜儀對(duì)制得的包合物進(jìn)行含量測(cè)定，以桉油精和龍腦的總含量計(jì)算，3批包合物的包合率分別為81.99%、76.11%、87.14%.周瑤、沈德鳳等[18-19]提出飽和水溶液包合法，操作簡單，但容易受人為和儀器等不可控因素的影響造成實(shí)驗(yàn)差異.本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化揮發(fā)油與β-CD包合工藝，得到最佳包合條件，在此條件下進(jìn)行配方工藝制備，大大提高了制備艾葉配方顆粒過程中指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率，增加了藥物的穩(wěn)定性[20-21]，為指導(dǎo)企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)提供一定科學(xué)依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

艾葉飲片(批號(hào)20201211，河南，樂仁堂大藥房提供)；桉油精(PS020020，中國食品藥品檢定研究院)；龍腦(PS2103326，中國食品藥品檢定研究院)；乙酸乙酯、無水乙醇、正己烷(均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；β-環(huán)糊精(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；純凈水(石家莊山中純凈水有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；SQP十萬分之一電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；SP SCIENTIFIC冷凍干燥機(jī)；GC Smart(GC-2018)氣相色譜儀；HT-1色譜柱(上海星銥色譜科技).

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 飲片含量測(cè)定方法

以2020版《中國藥典》[22]為依據(jù)，按照氣相色譜法通則(0521)測(cè)定.取艾葉飲片2.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水300 mL，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯2.5 mL，連接回流冷凝管.加熱至沸騰5 h，放冷，分取乙酸乙酯，置10 mL量瓶中，用乙酸乙酯分次洗滌測(cè)定器及冷凝管，轉(zhuǎn)入同一量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得.精密吸取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行含量測(cè)定，氣相色譜條件見表1，測(cè)定結(jié)果見表2.

表1 含量測(cè)定程序升溫Tab.1 Content determination by temperature programming

表2 飲片含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of decoction pieces

2.2 揮發(fā)油提取

2.2.1 飲片粉碎對(duì)揮發(fā)油提取的影響

取同一批藥材4份，每份60 g，2份粉碎，2份不粉碎，每份加10倍量水，浸泡1 h，加熱回流4.5 h，讀取揮發(fā)油量，結(jié)果見表3.

表3 飲片粉碎對(duì)揮發(fā)油提取的影響Tab.3 Effect of decoction pieces crushing on extraction of volatile oil

未粉碎飲片出油量較高，可能是由于艾葉粉碎后碎片過多，揮發(fā)油不能夠完全外逸，因此在后續(xù)揮發(fā)油提取中對(duì)艾葉飲片不進(jìn)行粉碎工藝.

通過對(duì)加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，提取揮發(fā)油的最佳工藝為艾葉飲片100 g，不粉碎，12倍水浸泡1.5 h，按2020版《中國藥典》第四部項(xiàng)下通則(2204)揮發(fā)油測(cè)定法安裝冷凝回流裝置，冷凝回流5 h，靜置1 h后收集提取的揮發(fā)油，放入冰箱冷藏24 h后用于包合.

2.2.2 揮發(fā)油空白回收實(shí)驗(yàn)

揮發(fā)油具有不穩(wěn)定性，加熱條件下易隨水蒸氣蒸餾，在加熱回流提取揮發(fā)油的過程中，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油有損失，為消除包合率計(jì)算誤差，故對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行空白回收實(shí)驗(yàn).

精密量取艾葉揮發(fā)油1 mL，至圓底燒瓶中，加300 mL水，回流提取5 h，靜置1 h后讀取回收的揮發(fā)油體積，平行3組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4.

表4 揮發(fā)油空白回收率(n=3)Tab.4 Blank recovery of volatile oil(n=3)

揮發(fā)油空白回收率[23]公式為

(1)

2.3 揮發(fā)油包合工藝

參考文獻(xiàn)[17-19,24]的揮發(fā)油包合工藝，初定工藝為V(揮發(fā)油)∶V(β-CD)∶V(水)=1∶8∶10，V(揮發(fā)油)∶V(乙醇)=1∶1，包合溫度60 ℃，包合時(shí)間2 h，平行測(cè)定3次，所得包合率分別為81.99%、76.11%、87.14%，包合率較低，在此條件下對(duì)包合工藝進(jìn)行優(yōu)化.

通過對(duì)包合溫度、包合時(shí)間、揮發(fā)油與水和β-CD的比例進(jìn)行考查，以包合率作考查指標(biāo)，結(jié)果得最佳包合工藝為V(揮發(fā)油)∶V(β-CD)∶V(水)=1∶10∶12，將適量β-CD與水置于圓底燒瓶中，65 ℃下恒溫?cái)嚢? h，緩慢滴加揮發(fā)油與無水乙醇體積比1∶2混合的稀釋液，約10 s 1滴，繼續(xù)恒溫磁力攪拌1 h，放冷，得揮發(fā)油包合物水溶液，冰箱預(yù)凍，冷凍干燥即得.冷凍干燥參數(shù)見表5.

表5 冷凍干燥參數(shù)Tab.5 Freeze drying parameters

2.4 包合率的測(cè)定

揮發(fā)油供試品的制備：取0.5 mL揮發(fā)油，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，加入300 mL水，按照2.1項(xiàng)下供試品制備方法冷凝回流提取，靜置1 h后將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，稀釋至刻度.

對(duì)照品溶液制備：取桉油精和龍腦適量溶于乙酸乙酯，制成含桉油精0.2 mg/mL，龍腦0.1 mg/mL的混合對(duì)照溶液.

包合物供試品的制備：稱取包合物適量，精密稱定，按照2.1項(xiàng)下方法提取供試品溶液，精密吸取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行含量測(cè)定，共測(cè)試5組包合物.結(jié)果見表6.

表6 包合率測(cè)定結(jié)果(n=5)Tab.6 Result of inclusion rate determination(n=5)

(2)

優(yōu)化后的包合工藝所制得包合物的包合率有明顯提高，通過平行實(shí)驗(yàn)可知該包合工藝穩(wěn)定可行，可用于后續(xù)配方顆粒制備過程中揮發(fā)油的包合.

2.5 艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”制備工藝優(yōu)化

取未進(jìn)行包合工藝制備的艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”2.5 g，按《中國藥典》艾葉項(xiàng)下含量測(cè)定提取供試品，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入正己烷25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用正己烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得.精密吸取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，未檢出指標(biāo)成分，結(jié)果見圖1.

圖1 艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”含量測(cè)定色譜Fig.1 Chromatogram of artemisia argyi “standard decoction” for content determination

優(yōu)化后的制備工藝為：取艾葉飲片100 g，12倍量水浸泡1.5 h，安裝冷凝回流裝置提取揮發(fā)油，將提取的揮發(fā)油制成包合物.藥液過濾放冷待用，藥渣煎煮2次，第1煎加12倍量水，煮沸后煎煮30 min，300目(孔徑48 μm)濾布趁熱濾過；第2煎加10倍量水，煮沸后煎煮20 min，300目(孔徑48 μm)濾布趁熱濾過，3次濾液合并，減壓濃縮(溫度60 ℃)至約1∶2(投料量∶浸膏體積=1 g∶2 mL)的浸膏，噴霧干燥，將包合物與干燥粉混合，即得.

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑0.7 g，精密稱定，按2.1項(xiàng)下供試品制備方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行含量測(cè)定，并計(jì)算桉油精及龍腦的轉(zhuǎn)移率.結(jié)果見表7.

表7 “標(biāo)準(zhǔn)湯劑”含量測(cè)定結(jié)果Tab.7 Determination results of “standard decoction”

(3)

由數(shù)據(jù)可知，桉油精、龍腦的平均轉(zhuǎn)移率為33.71%、29.61%，按均值的30%上下浮動(dòng)，得桉油精轉(zhuǎn)移率為23.60%～43.82%，龍腦的轉(zhuǎn)移率為20.73%～38.49%.

2.6 艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”指紋圖譜

為了考查從艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”到配方顆粒制備過程中化學(xué)成分的變化，加強(qiáng)專屬性鑒別，進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，并建立“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”指紋圖譜對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià).將12批艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”色譜圖導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中”，選出10個(gè)共有峰，并將桉油精色譜峰定為參照峰.指紋圖譜氣相條件見表8，“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”特征圖譜見圖2，疊加圖譜見圖3.

表8 指紋圖譜程序升溫Tab.8 Temperature programming of fingerprint

圖2 艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”特征圖譜Fig.2 Characteristic spectrum of Artemisia argyi “standard decoction”

圖3 12批艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”疊加圖譜Fig.3 12 Batches of artemisiae argyi “standard decoction” overlay mapping

2.7 艾葉配方顆粒制備工藝

取艾葉飲片100 g，12倍量水浸泡1.5 h，安裝冷凝回流裝置提取揮發(fā)油，將提取的揮發(fā)油制成包合物.藥液過濾放冷待用，藥渣煎煮2次，12倍水，每次1 h，300目(孔徑48 μm)濾布趁熱濾過，3次濾液合并，減壓濃縮(溫度60 ℃)至約1∶2(投料量(1 g)∶浸膏體積(2 mL))的浸膏，噴霧干燥，將制得的包合物與干燥粉、適量輔料混合制粒，即得.

取配方顆粒0.7 g，精密稱定，按照2.1項(xiàng)下供試品制備方法制備配方顆粒供試品，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表9.

表9 配方顆粒含量測(cè)定結(jié)果Tab.9 Determination results of formula granule

2.8 飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒中指標(biāo)成分的相關(guān)性

2.8.1 指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率數(shù)據(jù)

將艾葉飲片、“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”和配方顆粒含量測(cè)定結(jié)果及出膏率進(jìn)行匯總，比較桉油精和龍腦在三者間的傳遞情況.具體見表10，由匯總結(jié)果可知，桉油精和龍腦在“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”和配方顆粒中的轉(zhuǎn)移率相近.

表10 指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率結(jié)果Tab.10 Index component tromsfer results

標(biāo)準(zhǔn)湯劑中桉油精的平均轉(zhuǎn)移率為33.71%，龍腦的平均轉(zhuǎn)移率為29.61%.配方顆粒中桉油精的平均轉(zhuǎn)移率為33.48%，龍腦的平均轉(zhuǎn)移率為25.41%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明此方法制得的配方顆粒和標(biāo)準(zhǔn)湯劑成分含量并無顯著差異.

2.8.2 配方顆粒與“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”特征圖譜對(duì)比

稱量12批艾葉配方顆粒，按2.1項(xiàng)下供試品制備過程，配制樣品溶液；根據(jù)指紋圖譜檢測(cè)條件測(cè)定，記錄色譜圖.以艾葉“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”的色譜圖為對(duì)照?qǐng)D譜，將每批配方顆粒的特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度比較.由結(jié)果可知，配方顆粒與“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”具有較高的相似性，且艾葉配方顆粒的化學(xué)成分與“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”基本一致，結(jié)果見表11、圖4.

表11 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.11 Similarity evaluation results

圖4 配方顆粒與“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”、飲片特征圖譜對(duì)比Fig.4 Comparison of characteristic spectrum between formula granule and “standard decoction” and decoction pieces

3 討論

艾葉的主要活性成分是揮發(fā)油類，包括醚類、醇類、半萜類、芳香族化合物等化學(xué)結(jié)構(gòu)[25].其中桉油精、龍腦在揮發(fā)油類中占比較大，桉油精具有抗炎、抗菌等作用，龍腦也具有一定的抗菌和鎮(zhèn)痛作用[26-28].2020版《中國藥典》以2種化合物為艾葉的質(zhì)量控制成分，要求飲片中桉油精含量不得低于0.05%，龍腦含量不得低于0.02%.將飲片直接進(jìn)行水提工藝，在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中并未檢測(cè)到桉油精和龍腦，說明揮發(fā)油類在飲片煎煮過程中大多流失.進(jìn)行揮發(fā)油提取包合后，在標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測(cè)定中，桉油精和龍腦的平均含量分別為0.738 4、0.334 1 mg/g，減少了有效成分的揮發(fā)損失.

4 結(jié)語

根據(jù)傳統(tǒng)中藥煎煮操作規(guī)范對(duì)艾葉飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)艾葉飲片含量測(cè)定合格，但在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中未檢測(cè)出桉油精及龍腦.二者都屬于揮發(fā)油類，具有不穩(wěn)定性，為保證有效成分的轉(zhuǎn)移，在煎煮艾葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑時(shí)，需將揮發(fā)油類成分進(jìn)行提取，與β-CD形成包合物后再與噴霧干燥粉混合制成配方顆粒.水溶液飽和法相較于其他包合方法操作簡單，包合率高，且適用于大生產(chǎn)，利用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的包合工藝對(duì)艾葉揮發(fā)油進(jìn)行包合，測(cè)得的平均包合率為96.40%，配方顆粒中桉油精和龍腦的平均轉(zhuǎn)移率為33.48%，25.41%.數(shù)據(jù)表明利用該工藝有效減少了揮發(fā)油類成分在煎煮過程中的流失，工藝穩(wěn)定可行，為艾葉配方顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考.在本實(shí)驗(yàn)揮發(fā)油的提取工藝中，浸泡時(shí)間和提取時(shí)間相對(duì)較長，延長了含量測(cè)定和配方顆粒制備的前期工作，后續(xù)將對(duì)此部分進(jìn)行深一步的考查優(yōu)化.