饒靜秋 魏平凡 楊 云 藍(lán)俊麟 劉小龍 袁智勇

（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校極小種群野生動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2.文山市國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)分局，云南 文山 663099；3.云南文山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局，云南 文山 663099）

長(zhǎng)吻臭蛙（Odorrana nasica）隸屬于兩棲綱（Amphibia）無(wú)尾目（Anura）蛙科（Ranidae）臭蛙屬，模式產(chǎn)地為越南諒山省母山（海拔范圍915～1 220 m）[1]。根據(jù)Frost 等的研究表明，在越南河靜?。?05°14′38″ E,18°20′53″ N,海拔范圍900～1 200 m）也有該蛙分布[2]。長(zhǎng)吻臭蛙是一種小型臭蛙，體背薦椎之后皮膚粗糙，腹面皮膚光滑，吻部極突出，頰部深凹。活體背面為棕色或具灰橄欖綠色相間，具一條窄的腺狀背側(cè)褶，部分個(gè)體具有深色斑；腹面黃白色，具不太明顯的棕色點(diǎn)；吻端及大腿后皮膚為黃色及橄欖綠相間的不規(guī)則斑紋。

目前，該物種在國(guó)外分布于泰國(guó)西北部和越南北部[3]。盡管該種被認(rèn)為在中國(guó)也有分布[3]，但目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)。該物種在國(guó)內(nèi)的具體分布地點(diǎn)、形態(tài)特征以及相應(yīng)的生境均不清楚。本研究在2018 年7 月和2021 年2 月，分別在云南省文山壯族苗族自治州馬關(guān)縣及西疇縣采集到3 只臭蛙屬標(biāo)本，根據(jù)上述主要鑒別特征對(duì)比及分子生物學(xué)鑒定，確定采集物種為長(zhǎng)吻臭蛙。通過(guò)對(duì)新采集的3 號(hào)長(zhǎng)吻臭蛙標(biāo)本進(jìn)行了相應(yīng)的形態(tài)特征測(cè)量及描述，并對(duì)2 個(gè)采集地的生境進(jìn)行了描述，證實(shí)該物種在國(guó)內(nèi)的分布記錄，并補(bǔ)充了具體分布情況及相應(yīng)的生境介紹。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2018 年7 月和2021 年2 月，分別在云南省文山州馬關(guān)縣都龍鎮(zhèn)四臺(tái)坡（104°33′47″ E,22°55′12″ N,海拔1 417 m）附近采集到雌性臭蛙標(biāo)本2 號(hào)（標(biāo)本號(hào)SWFU 0048,SWFU 0049）；在西疇縣法斗鄉(xiāng)文山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)小橋溝片區(qū)（104°45′45″ E,23°21′36″ N,海拔1 518 m）采集到雄性標(biāo)本1 號(hào)（SWFU 006976），并收集腳趾樣品3 號(hào)（組織號(hào)Yuan 10161、Yuan 10162、Yuan 10185）。所采集的標(biāo)本取出肌肉及腳趾樣品均儲(chǔ)存在95 %乙醇中以用于后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)。整體標(biāo)本固定保存于75 %乙醇中，并保存于西南林業(yè)大學(xué)。

1.2 形態(tài)學(xué)測(cè)量

依據(jù)文獻(xiàn)[4?5] 的測(cè)量方法，用數(shù)顯卡尺對(duì)2 個(gè)成年雌性及一只雄性標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量，精確到0.1 mm。測(cè)量指標(biāo)：體長(zhǎng)（SVL），自吻端至體后端的長(zhǎng)度；頭長(zhǎng)（HL），自吻端至上、下頜關(guān)節(jié)后緣的長(zhǎng)度；頭寬（HW），最大頭部寬度；吻長(zhǎng)（SL），自鼻間到眼孔前角的長(zhǎng)度；鼻間距（INS），左右鼻孔內(nèi)緣之間的距離；眼間距（IOS），左、右上眼瞼內(nèi)側(cè)緣之間的最窄距離；眼徑（ED），與體軸平行的眼球外露部分的直徑；上眼瞼寬（UEW），上眼瞼最大寬度；鼓膜徑（TD），鼓膜的水平直徑，測(cè)量到鼓膜邊緣的外緣；鼓膜到眼睛距離（TEY），自眼孔的后緣至鼓膜邊緣的前緣；手長(zhǎng)（HND），自手掌結(jié)節(jié)基部至Ⅲ指指尖；股骨長(zhǎng)度（FEM）；脛骨長(zhǎng)度（TIB）；跗足長(zhǎng)（LFT），從脛骨跗骨關(guān)節(jié)到IV 趾趾尖；足長(zhǎng)（FL），從跖骨內(nèi)結(jié)節(jié)基部至IV 趾趾尖；第III 指指吸盤的水平直徑（F3DSC）。

1.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究采集了2 號(hào)標(biāo)本的肌肉組織（標(biāo)本號(hào)SWFU 571、SWFU 572）及3 號(hào)腳趾樣品（Yuan 10161、Yuan 10162、Yuan 10185），采 用ThermoFisher Scientific 公司所提供的DNA 提取試劑盒的提取方案來(lái)提取該物種DNA，然后 ?20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂靡?6SAR（5′?CGC CTG TTT ACC AAA AAC AT?3′）和16SBR（5′?CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T?3′），對(duì)其16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增[6]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）程序?yàn)?5 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min；PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物最后送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序后得到的結(jié)果使用DNASTAR Lasergene.v7.1 軟件包中的Seqman程序進(jìn)行比對(duì)[7]。將已比對(duì)16S rRNA 序列數(shù)據(jù)上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù) （GenBank 號(hào)：OK464876-OK464880）

基于已比對(duì)的16S 序列數(shù)據(jù)，本研究采集的臭蛙標(biāo)本屬于Liu[5]和Chen 等[8]揭示的臭蛙屬7 個(gè)進(jìn)化支（A?G）中F 支系內(nèi)的物種。因此，從GenBank 下載臭蛙屬該支系的全部7 個(gè)物種，共7 條序列，并采用F 支系的最近姐妹支系中的大綠臭蛙（Odorrana graminea,Boulenger 1899）的序列作為外群[8]。本研究同時(shí)使用了貝葉斯法（BI）和最大似然法（ML）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。運(yùn)用JModelTest 2 選擇最合適的模型構(gòu)建ML 樹和BI 樹[9?10]，為GTR+G。使用RAxML 8.2.4 版本運(yùn)行最大似然估計(jì)（ML）[11]，在ML 分析下使用非參數(shù)自助重取樣重復(fù)1 000 次來(lái)評(píng)估自引支持度，采用MrBayes 3.2 進(jìn)行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析[12]。使用4 條馬爾科夫鏈運(yùn)行2 000萬(wàn)代，每1 000 代進(jìn)行1 次抽樣，基于收斂的情況，前25 % 代數(shù)舍棄掉。使用Tracer v 1.5[13]來(lái)檢測(cè)有效樣本量（ESS200）以檢查各運(yùn)行參數(shù)值是否收斂，應(yīng)用MEGA X 計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離（p?distance）[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述

本次采集的2 只雌性長(zhǎng)吻臭蛙成體體長(zhǎng)分別為75.7 mm 及71.3 mm，雄性長(zhǎng)吻臭蛙成體長(zhǎng)為49.3 mm，其余各部位量度數(shù)據(jù)見表1。頭部寬度小于頭部長(zhǎng)度；吻部較扁平，吻端在背視圖中稍鈍圓，突出于下頜外；鼻部深凹，鼻孔背外側(cè)到眼睛及吻端距離相等；吻棱明顯；鼻間距大于眼間距；吻長(zhǎng)大于眼徑；鼓膜非常清晰，鼓膜邊緣相對(duì)于鼓膜稍高；鼓膜徑明顯小于眼徑；眼間距略小于上眼瞼寬；松果體可見；犁骨齒略呈傾斜，位于內(nèi)鼻孔之間；內(nèi)鼻孔呈橢圓形，接近犁骨齒；舌后端缺刻深，呈“U 形”（圖1～3）。

表1 云南馬關(guān)縣及西疇縣長(zhǎng)吻臭蛙雌性及雄性成體量度Table 1 Measurements of the adult specimens of O.nasica

圖1 長(zhǎng)吻臭蛙（云南省西疇縣法斗鄉(xiāng)，雄性）Fig.1 O.nasica (Fadou Town of Xichou County,Yunnan Province,male)

雄性成蛙體背薦椎之后包括背側(cè)褶之下的體側(cè)面密布圓錐狀刺（圖1），雌性成蛙該區(qū)域布稀疏疣粒（圖2）?；铙w背面為棕色或具灰橄欖綠色相間，部分個(gè)體具有深色斑，具一條窄的腺狀背側(cè)褶。吻棱及腺狀側(cè)褶外邊緣呈黑色；鼻孔下方至上唇白色，鼓膜微紅；四肢具數(shù)條規(guī)則的黑色橫條紋；腹面黃白色，具不太明顯的棕色點(diǎn)；吻端及大腿后皮膚為黃色及橄欖綠相間的不規(guī)則斑紋（圖2～3）。標(biāo)本浸泡后背部呈棕紅色，體側(cè)顏色略深于體背呈棕黑色，腹面呈白色。

圖2 長(zhǎng)吻臭蛙（云南省馬關(guān)縣都龍鎮(zhèn)，SWFU 0048，雌性）Fig.2 O.nasica (Dulong Town of Maguan County,Yunnan Province,SWFU 0048,female)

圖3 長(zhǎng)吻臭蛙手部及足部形態(tài)（云南省馬關(guān)縣都龍鎮(zhèn)，SWFU 0048，雌性）Fig.3 Hands and foots of O.nasica (Dulong Town of Maguan County,Yunnan Province,SWFU 0048,female)

長(zhǎng)吻臭蛙雌雄差異較大，雄性體型小于雌性，且體長(zhǎng)約為雌性體長(zhǎng)的70 %；雄性肱腺缺失，具有一對(duì)咽側(cè)下外聲囊；雄性成體第一指基部粗大，婚墊發(fā)達(dá)；體背薦椎之后包括背側(cè)褶之下的體側(cè)面密布圓錐狀刺。

2.2 生境描述

本研究中所采集的長(zhǎng)吻臭蛙樣本序列與已有長(zhǎng)吻臭蛙序列[4]聚在同一支系，與安子山臭蛙（Odorrana yentuensis）形成姐妹群關(guān)系。種內(nèi)遺傳距離（p-distance）為1.1 %，與姐妹種間遺傳距離為2.8 %，系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果顯示采集于馬關(guān)縣和西疇縣的臭蛙標(biāo)本為長(zhǎng)吻臭蛙（圖4）。

圖4 基于線粒體16s rRNA 構(gòu)建臭蛙屬F 支系的貝葉斯樹Fig.4 Bayesian inference tree of Odorrana derived from 16s rRNA sequences

3 結(jié)論與討論

本研究在云南文山州采集到的長(zhǎng)吻臭蛙標(biāo)本與該蛙模式產(chǎn)地越南諒山省母山（Mau Son Mountains,Lang Son province,Vietnam）的標(biāo)本在外部形態(tài)描述上基本一致。馬關(guān)縣采集到的長(zhǎng)吻臭蛙標(biāo)本均為雌性，與西疇縣采集到的雄性標(biāo)本相比雌性體長(zhǎng)明顯大于雄性（馬關(guān)縣長(zhǎng)吻臭蛙雌性體長(zhǎng)：71.32～75.7 mm；西疇縣長(zhǎng)吻臭蛙雌性體長(zhǎng)：49.3 mm），雄性成蛙體長(zhǎng)約為雌性的70 %。西疇縣采集到的雄蛙與模式標(biāo)本記錄的4 只雄性相比體長(zhǎng)及形態(tài)特征描述均一致。系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果顯示，采集于馬關(guān)縣和西疇縣的臭蛙標(biāo)本均為長(zhǎng)吻臭蛙?；谝陨辖Y(jié)果，本研究證實(shí)了長(zhǎng)吻臭蛙在中國(guó)云南省文山州的分布。

長(zhǎng)吻臭蛙的繁殖季節(jié)推測(cè)應(yīng)該在2—4 月。研究人員于2016—2018 年的4、6、8 月在西疇縣監(jiān)測(cè)期間均沒有見到該蛙的成體，也沒有聽到該蛙的叫聲。僅于2017 年4 月初監(jiān)測(cè)期間發(fā)現(xiàn)有雌性成體（未采集），而在2021 年2 月初考察期間見到大量雄性個(gè)體及少量雌性個(gè)體，叫聲頗多，但未見到抱對(duì)個(gè)體或卵團(tuán)，推測(cè)應(yīng)該是在繁殖早期，后續(xù)更多的考察研究可豐富該物種的生物學(xué)資料。

致謝：本研究得到了以下項(xiàng)目支持：云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（專項(xiàng)）優(yōu)秀青年項(xiàng)目（202001 AW070016），云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目（202005AC160046），中國(guó)科協(xié)青年人才托舉工程（2019?2021QNRC001），生態(tài)環(huán)境部生物多樣性調(diào)查、觀測(cè)和評(píng)估項(xiàng)目（2019—2023 年），第二次青藏高原綜合科學(xué)考察研究（2019QZKK0501）。感謝西南林業(yè)大學(xué)吳東益、賀艷紅和黃佳玥同學(xué)在分子實(shí)驗(yàn)及鑒定方面給予的幫助。