蘇 宏 何遠山 馮 霖 黃用豪

(1 青海省第五人民醫(yī)院普通外科，西寧市 810000，電子郵箱：liu520bing@aliyun.com；2 海南醫(yī)學院臨床學院，?？谑?571199)

結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，具有較高的病死率[1]。2019年全國癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015年我國結直腸癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中位居第3位，病死率位居第5位[2]，這表明結直腸癌的防治形勢嚴峻，而早診斷、早治療的患者的5年生存率可達90%[3]。目前，結直腸癌的早期診斷方法分為侵入性檢查和非侵入性檢查。非侵入性檢查包括糞便檢查、血液檢查及放射檢查，例如糞便潛血試驗和腫瘤標志物檢測，但這兩種方法的檢測敏感性和特異性均較差[4]。侵入性檢查包括內窺鏡檢查等，可直接觀察結直腸病變，并獲得病理標本[5]。在許多國家(包括美國、德國、波蘭、奧地利和意大利)，內窺鏡檢查是結直腸癌篩查的主要方法[5]。但由于內窺鏡很難在形態(tài)學上對病灶異型程度和是否發(fā)生浸潤作出判斷，因此內窺鏡診斷早期癌的準確性受到影響[6]。微小RNA是一類小的單鏈非編碼RNA，在多種生物學過程(包括細胞增殖、凋亡和器官發(fā)育)中發(fā)揮重要作用，可以用作人類疾病診斷和預后評估的重要工具[7]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(例如微小RNA-21和微小RNA-92a)可作為結直腸癌的診斷標志物[8]。此外，有研究表明，微小RNA-107(microRNA-107,miR-107)和微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)可影響結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。本研究探討結直腸癌患者血清miR-107和miR-34a的表達情況及二者診斷結直腸癌的價值，以期為結直腸癌的早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2018年12月青海省第五人民醫(yī)院收治的50例結直腸癌患者為結直腸癌組，50例健康人群為對照組。納入標準：(1)結直腸癌患者均接受結直腸內窺鏡活檢，且經(jīng)病理確診；(2)參照第8版美國癌癥聯(lián)合委員會癌癥分期手冊[11]，結直腸癌為Ⅰ～Ⅳ期；(3)未接受其他手術治療或放化療；(4)病例資料記錄完整。排除標準：(1)伴有嚴重并發(fā)癥；(2)病例資料記錄缺失。結直腸癌組中男性27例、女性23例，年齡32～80(51.14±6.18)歲；腫瘤呈高分化15例，中分化24例，低分化11例；TNM分期Ⅰ期3例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期12例；有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移19例。對照組中男性29例、女性21例，年齡30～75(50.97±3.28)歲。兩組研究對象的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。本研究獲青海省第五人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 微小RNA檢測方法

1.2.1 主要儀器與試劑：超微量紫外分光光度計(型號：DS11)購自美國DeNovix公司；熒光定量PCR儀(型號：CFX96)和普通PCR儀(型號：C1000)均購自美國Bio-Rad公司；血清miRNA提取試劑盒(Lot#O3330)、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR211，Lot#T9998)、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(FP411，產品編號：4992887)均購自天根生化科技(北京)有限公司；所有引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 血清標本的制備：抽取所有受試者清晨空腹狀態(tài)下的外周靜脈血5 mL，室溫靜置30 min后，在4℃條件下，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總RNA的提取與反轉錄：使用血清微小RNA提取試劑盒提取血清中的總RNA，使用超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，A260/280值在1.8～2.2之間為合格。使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將樣本總RNA反轉錄成單鏈cDNA。上述操作均嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.4 血清miR-107、miR-34a相對表達水平的檢測：使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒，以U6作為內參基因，檢測血清miR-107、miR-34a的相對表達水平。miR-107上游引物(5′-3′)為ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGТACAG，下游引物(5′-3′)為CTCAACTGGTGTCGTGGA；miR-34a上游引物(5′-3′)為GGCAGTGTCTTAGCTGGTTG，下游引物(5′-3′)為GCGAGCACAGAATTAATACGAC；內參基因U6上游引物(5′-3′)為CTCGCTTCGGCAGCACATATACT，下游引物(5′-3′)為CGAATTTGCGTGTCATССTTGCG。熒光定量反應體系共20 μL，包括10 μL 2×miRcute miRNA Premix，1.6 μL 50×ROX參比染料，0.5 μL 10 μmol/L的正向引物，0.5 μL 10 μmol/L的反向引物，1.5 μL cDNA，5.9 μL ddH2O。反應條件為94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔，并重復3次平行實驗，最終取平均值進行計算。采用2-ΔΔCt法計算miR-107和miR-34a基因的相對表達量，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt結直腸癌組-ΔCt對照組。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗或Mann-Whitneyu檢驗。采用Spearman秩相關檢驗分析結直腸癌患者的血清微小RNA相對表達水平與臨床病理特征的相關性。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評估血清miR-107和miR-34a單獨診斷及二者聯(lián)合診斷結直腸癌的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組血清miR-107和miR-34a的表達情況 結直腸癌組、對照組血清中miR-107的相對表達量分別為(13.65±4.26)、(5.82±1.96)，miR-34a的相對表達量分別為(1.98±0.49)、(16.70±4.29)。其中，結直腸癌組miR-107的相對表達量高于對照組(t=11.807，P<0.001)，miR-34a的相對表達量低于對照組(t=24.106，P<0.001)。

2.2 不同臨床病理特征結直腸癌患者miR-107和miR-34a的表達情況 Ⅰ期結直腸癌患者的血清miR-107相對表達量低于Ⅳ期患者，而血清miR-34a相對表達量高于Ⅳ期患者(均P<0.05)；高分化結直腸癌患者的血清miR-34a相對表達量高于低分化患者(P<0.05)；有淋巴結轉移的結直腸癌患者的血清miR-34a相對表達量低于無淋巴結轉移患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征結直腸癌患者miR-107和miR-34a相對表達量的比較[M(P25，P75)]

進一步行相關性分析，結果顯示結直腸癌患者的血清miR-107相對表達量與TNM分期呈正相關，血清miR-34a相對表達量與分化程度呈正相關，與TNM分期和淋巴結轉移情況呈負相關(均P<0.05)。見表2。

表2 結直腸癌患者血清miR-107和miR-34a相對表達量與臨床病理特征的相關性

2.3 ROC曲線分析結果 以病理診斷結果為金標準，采用ROC曲線分析血清miR-107和miR-34a相對表達量對結直腸癌的診斷效能。結果顯示，miR-107相對表達量診斷結直腸癌的曲線下面積為0.849(95%CI:0.793～0.905,P<0.001)，診斷靈敏度和特異度分別為83.7%和81.5%；miR-34a相對表達量診斷結直腸癌的曲線下面積為0.959(95%CI:0.932～0.986,P<0.001)，診斷靈敏度和特異度分別為92.9%和91.3%；二者聯(lián)合診斷結直腸癌的曲線下面積為0.983(95%CI:0.977～0.991,P<0.001)，診斷靈敏度和特異度分別為98.7%和97.4%。見圖1。

圖1 血清miR-107、miR-34a相對表達量單獨及聯(lián)合診斷結直腸癌的ROC曲線

3 討 論

結直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，患者的病死率較高。微小RNA在結直腸癌中具有抑癌或致癌作用，因此，微小RNA對結直腸癌具有一定的診斷價值[12]。相關研究表明，miR-107對結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用[13-14]。例如，Chen等[13]報告，在結直腸癌細胞模型中，miR-103/107通過靶向轉移抑制因子死亡相關蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)和Kruppel 樣因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)來促進結直腸癌細胞轉移；此外，miR-103/107高表達、DAPK和KLF4低表達與結直腸癌患者淋巴結轉移和遠處轉移相關。Molina-Pinelo等[14]報告，miR-107可評估結直腸癌患者對氟尿嘧啶標準化療的反應。此外，miR-34a也與結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關。miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c組成，其參與細胞周期和細胞凋亡過程，具有抑制腫瘤的特性[15]。miR-34a可通過靶向原癌基因Fra-1抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲；結腸癌組織中缺乏miR-34a也會導致P53突變和缺乏，從而加速癌癥的發(fā)展[16]。因此，本研究探討miR-107和miR-34a在結直腸癌患者血清中的表達及其診斷結直腸癌的價值。

Liu等[17]的研究表明，miR-107在結直腸癌的癌組織和細胞株中均呈高表達。另外，鄒德勝等[18]報告，結直腸癌患者血清miR-107的表達量高于正常人群，miR-107的表達量與結直腸癌患者的TNM分期有關。本研究中，結直腸癌患者血清miR-107的相對表達量高于正常人群，且血清miR-107的相對表達量與結直腸癌患者的TNM分期呈正相關(均P<0.05)，這與鄒德勝等[18]的研究結果相似。這表明miR-107與直腸癌的發(fā)生和發(fā)展相關。另外，張肖麗等[19]發(fā)現(xiàn)，除了TNM分期，miR-107的表達量還與結直腸癌患者的腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關。但本研究中，結直腸癌患者的血清miR-107的相對表達量與腫瘤分化程度、淋巴結轉移并無相關性(均P>0.05)，這可能與本研究收集的結直腸癌樣本腫瘤分化程度及淋巴結轉移的占比與上述研究不同有關。

Badr等[20]報告，與健康對照者相比，結直腸癌患者miR-34a的表達量顯著降低，且TNM分期Ⅰ期結直腸癌患者miR-34a的表達量最高，Ⅲ期結直腸癌患者miR-34a的表達量最低。Ma等[10]也報告，與健康對照者相比，結直腸癌患者miR-34a的表達量顯著降低。這些研究均表明，miR-34a基因也與結直腸癌的發(fā)生密切相關。本研究中，結直腸癌患者血清miR-34a的相對表達量低于正常人群，且miR-34a 相對表達量與結直腸癌患者的TNM分期、分化程度和淋巴結轉移均相關(均P<0.05)，這與雒亞蒙等[21]的研究結果相似。以上研究結果提示，miR-34a低表達不僅與結直腸癌的發(fā)生有關，還能反映腫瘤的進展情況。

目前，還沒有公認的診斷結直腸癌靈敏度和特異度均較高的微小RNA，因此，多個標志物的聯(lián)合檢測對疾病的診斷有更大的參考價值。本研究的ROC曲線分析結果顯示，血清miR-107和miR-34a相對表達量診斷結直腸癌的曲線下面積分別為0.849、0.959，靈敏度分別為83.7%、92.9%，特異度分別為81.5%、91.3%，提示兩者對結直腸癌具有較好的診斷效能；而二者聯(lián)合診斷時，ROC曲線下面積可達0.983，診斷靈敏度和特異度可提高至98.7%和97.4%，提示聯(lián)合檢測血清miR-107和miR-34a的相對表達量，可進一步提高對結直腸癌的診斷效能。此外，血清微小RNA的檢測不具有創(chuàng)傷性，有利于重復檢測，可用于疾病的監(jiān)控和評估。

綜上所述，結直腸癌患者血清中miR-107的表達上調，而miR-34a的表達下調，二者均可反映腫瘤的進展情況且均可用于結直腸癌的輔助診斷，二者聯(lián)合應用時的診斷效能更高。