籍玉青 尹永波 邱金霞

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院 1耳鼻咽喉科，河北 邢臺(tái) 054001；2放射科)

鼻咽癌是東南亞和華南地區(qū)最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤，放療是其有效治療手段，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)仍是治療失敗的主要原因，靶向治療具有高效、低毒的特性，是鼻咽癌研究熱點(diǎn)之一〔1,2〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA與鼻咽癌的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)，例如，下調(diào)lncRNA LINC01420抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔3〕；lncRNA DGCR5通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB途徑促進(jìn)鼻咽癌進(jìn)展〔4〕。DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因(DGCR)5被發(fā)現(xiàn)在許多癌癥中低表達(dá)，與患者不良預(yù)后相關(guān)，如肝癌〔5〕和膀胱癌，DGCR5通過(guò)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)P21表達(dá)抑制膀胱癌進(jìn)展〔6〕。DGCR5還通過(guò)抑制miR-22-3p促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展〔7〕。然而DGCR5在鼻咽癌中作用及其機(jī)制尚不清楚。此外，miR-21已被證實(shí)作為一個(gè)致癌基因在多種癌癥中異常表達(dá)，如miR-21通過(guò)靶向抑制腫瘤抑制基因受磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔8〕。miR-21通過(guò)PTEN/PDCD4誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖〔9〕。據(jù)報(bào)道，miR-21在鼻咽癌組織中高表達(dá)，信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)3激活miR-21通過(guò)靶向PTEN促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡〔10〕；miR-21抑制劑通過(guò)下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移〔11〕。然而DGCR5和miR-21在鼻咽癌中的相互關(guān)系還不確定，本實(shí)驗(yàn)旨在研究DGCR5可能通過(guò)調(diào)控miR-21對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞SUNE-1、CNE-2、CNE-1、HNE-1、HONE-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒、凋亡試劑盒、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。收集邢臺(tái)市人民醫(yī)院確診為鼻咽癌患者24例，然后將患者癌旁組織、鼻咽癌組織冷凍保存在液氮罐內(nèi)，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞SUNE-1、CNE-2、CNE-1、HNE-1、HONE-1，于37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞CNE-1、HNE-1接種于96孔板中，細(xì)胞融合至80%，將si-NC、si-DGCR5、pcDNA-NC、pcDNA-DGCR5、anti-miR-NC、anti-miR-21質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至CNE-1、HNE-1細(xì)胞中，記為si-NC組、si-DGCR5組、pcDNA-NC組、pcDNA-DGCR5組、anti-miR-NC組、anti-miR-21組；將pcDNA-DGCR5分別與mimic-NC、mimic-miR-21共轉(zhuǎn)染至CNE-1、HNE-1細(xì)胞中，記為pcDNA-DGCR5+mimic-NC組、pcDNA-DGCR5+mimic-miR-21組；轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)DGCR5和miR-21表達(dá)水平 提取鼻咽癌組織、癌旁組織和各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。DGCR5和miR-21相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.4MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，加20 μl MTT溶液，孵育4 h；棄去培養(yǎng)基，加150 μl DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 各組細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(2×104個(gè)/ml)。細(xì)胞遷移：取200 μl細(xì)胞懸液接種Transwell上室，培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，加4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲：以1∶5比例稀釋基質(zhì)膠，鋪于Transwell上室，干燥后，按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟操作。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示DGCR5與miR-21結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建DGCR5野生型(Wt)、突變型(Mut)熒光素酶表達(dá)載體DGCR5-Wt和DGCR5-Mut。將DGCR5-Wt和DGCR5-Mut分別與mimic-NC、mimic-miR-21共轉(zhuǎn)染至CNE-1、HNE-1細(xì)胞中，使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA DGCR5、miR-21在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)量 鼻咽癌組織DGCR5表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，miR-21表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)表1；鼻咽癌細(xì)胞SUNE-1、CNE-2、CNE-1、HNE-1、HONE-1中DGCR5的表達(dá)水平均顯著低于人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69，miR-21表達(dá)水平均顯著高于人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 lncRNA DGCR5、miR-21在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

表2 lncRNA DGCR5、miR-21在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖凋亡的影響 pcDNA-DGCR5組鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1中DGCR5的表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率均顯著高于pcDNA-NC組(P<0.05)，24 h后細(xì)胞活力均顯著低于pcDNA-NC組(P<0.05)，見(jiàn)表3、表4。

表3 過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖凋亡的影響

表4 過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)HNE-1細(xì)胞增殖凋亡的影響

2.3過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 pcDNA-DGCR5組鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1中遷移和侵襲數(shù)量均顯著低于pcDNA-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表5。

圖1 過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫，×200)

2.4lncRNA DGCR5可以與miR-21靶向結(jié)合 圖2通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)到DGCR5與miR-21存在結(jié)合位點(diǎn)。mimic-miR-21組DGCR5-Wt鼻炎癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1的熒光素酶活性顯著低于mimic-NC組(P<0.05)；而DGCR5-Mut鼻炎癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1的熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表6。si-DGCR5組鼻炎癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1中miR-21的表達(dá)水平顯著高于si-NC組(P<0.05)；pcDNA-DGCR5組鼻炎癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1中miR-21的表達(dá)水平顯著低于pcDNA-NC組(P<0.05)，見(jiàn)表7。

圖2 DGCR5與miR-21結(jié)合位點(diǎn)

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表7 lncRNA DGCR5靶向調(diào)控

2.5抑制miR-21表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 anti-miR-21組CNE-1、HNE-1細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平、24 h后細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)量均顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)表8、表9。

表8 抑制miR-21表達(dá)對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

表9 抑制miR-21表達(dá)對(duì)HNE-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.6過(guò)表達(dá)miR-21逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡 pcDNA-DGCR5+mimic-miR-21組鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、HNE-1中miR-21表達(dá)水平、24 h后細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)均顯著高于pcDNA-DGCR5+mimic-NC組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著低于pcDNA-DGCR5+mimic-NC組(P<0.05)，見(jiàn)表10、表11。

表10 過(guò)表達(dá)miR-21逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡

表11 過(guò)表達(dá)miR-21逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)lncRNA DGCR5對(duì)HNE-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡

3 討 論

據(jù)報(bào)道，lncRNA在多種腫瘤中起關(guān)鍵作用，可作為腫瘤生物標(biāo)志物。lncRNA DGCR5作為一種腫瘤抑制因子在癌癥中起作用，如過(guò)表達(dá)DGCR5抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲〔12〕。此外，DGCR5在胃癌患者癌組織及血漿中表達(dá)均顯著降低，DGCR5上調(diào)能抑制胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡〔13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明DGCR5可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這與DGCR5在其他腫瘤中的作用相符。研究證實(shí)DGCR5可能作為miRNA的ceRNA，調(diào)節(jié)miRNA內(nèi)源性靶標(biāo)的表達(dá)，從而在許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如DGCR5通過(guò)靶向miR-1180調(diào)節(jié)肺癌的增殖、遷移和侵襲〔14〕。DGCR5通過(guò)海綿miR-2861抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和遷移〔15〕。

miRNA可以作為抑癌基因或致癌基因在腫瘤中起作用。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-21在鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展中可能作為腫瘤促進(jìn)因子，提示抑制miR-21可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Zhou等〔16〕發(fā)現(xiàn)miR-21下調(diào)減弱鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。miR-21下調(diào)增強(qiáng)鼻咽癌的放射敏感性〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-MEG3通過(guò)調(diào)控miR-21的表達(dá)抑制胃癌增殖和轉(zhuǎn)移〔18〕；miR-21高表達(dá)通過(guò)調(diào)控PTEN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖〔19〕；miR-21通過(guò)沉默LATS1促進(jìn)腎癌細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞表型的增殖和轉(zhuǎn)移〔20〕。

綜上，lncRNA DGCR5過(guò)表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡；可能與靶向調(diào)控miR-21有關(guān)，可作為鼻咽癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。