田美媛 侯靜 黃登亮 張耀剛 江源 孫莉 張濤 李志琴 童思賢 馬艷艷,2

(青海大學(xué) 1附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810000；2醫(yī)學(xué)院；3附屬醫(yī)院科研管理部)

缺血性腦卒中急性期可出現(xiàn)多臟器功能損傷，嚴(yán)重時可引發(fā)多器官功能衰竭而增加致殘率和死亡率〔1〕。腦損傷和肝臟應(yīng)激性損傷是常見的受累臟器，并被認(rèn)為是全身應(yīng)激性炎癥反應(yīng)的始動和擴(kuò)大器官〔2～4〕。因此，積極探索腦卒中的發(fā)病機(jī)制，降低腦卒中的發(fā)病率是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和前沿。研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者機(jī)體細(xì)胞可表現(xiàn)為能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、活性氧(ROS)的生成、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等〔5〕。能量代謝中的關(guān)鍵蛋白表現(xiàn)出對缺血性神經(jīng)重要的保護(hù)作用，雖然它們的機(jī)制還不甚明確，需要進(jìn)一步探索。蛋白磷酸酶(PP)4是PP2A家族的重要成員之一，是調(diào)節(jié)糖和脂質(zhì)代謝的新因子〔6〕；PP4基因也被證明參與了許多重要的細(xì)胞過程的調(diào)控〔7〕；作為位于中心體的蛋白，PP4參與中心體的成熟和微管的生長〔8〕；PP4還通過去磷酸化復(fù)制蛋白(RP)A2和組蛋白家族成員(H2A)X參與DNA損傷修復(fù)〔9,10〕。

然而，考慮到缺血性腦卒中能量代謝的關(guān)系，很少有研究探討PP4在缺血性腦卒中最常受影響的肝和腦組織中的作用。本研究通過線栓法建立大鼠缺血性腦卒中模型，進(jìn)一步探討在缺血性腦卒中大鼠模型中肝組織和腦組織中PP4的表達(dá)水平，為PP4參與缺血性腦卒中提供線索。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動物分組 45只健康雄性SD大鼠(體重：250～280 g),購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場(許可證號：3201111979),隨機(jī)將SD大鼠分為正常(NORMAL)組、假手術(shù)(SHAM)組、大腦中動脈阻塞(MCAO)組，每組15只，MCAO組再分為MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組3個亞組，每個亞組5只。

1.1.2主要儀器和試劑 OLYMPUS立體顯微鏡，熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ)，數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司，編號：0004)，超微量核酸蛋白濃度測定儀(Nanodrop2000C)，全景組織定量分析系統(tǒng)(TG：ZEISS Axio Imager Z2)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(AI600QC)，SYBR Green(Roche)，Trizol(TaKaRa)，蛋白酶抑制劑PMSF(BOSTER)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen)，PP4調(diào)節(jié)亞基(PP4R)2抗體(ab70631)和PPX抗體(ab16475)購自Abcam，PP4催化亞基(PP4C)和內(nèi)參β-actin引物(上海生工有限公司合成)，線栓(購于北京西農(nóng)科技有限公司，型號：2436-A5)

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠造模 術(shù)前1 d禁食不禁水，用Nagasawa等〔11〕的改良線栓法制成MCAO模型，用5%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,仰臥固定；在顯微鏡下分離右側(cè)頸總動脈、迷走神經(jīng)、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈，在頸總動脈處掛線；用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端后,距動脈分叉4 mm剪一斜行切口,將線栓由頸總動脈插入頸內(nèi)動脈,取下動脈夾，插入深度(18.5±0.5)mm,稍遇阻力感即停；固定線栓，剪斷栓尾，縫合皮膚，碘伏消毒，術(shù)中及術(shù)后注意保暖。SHAM組只分離血管和神經(jīng)。

1.2.2神經(jīng)功能損傷評分 參考Longa等〔12〕的4級評分法在大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分。0分:無神經(jīng)損傷癥狀；1分:不能伸展對側(cè)前爪；2分：向一側(cè)轉(zhuǎn)圈追尾；3分:向?qū)?cè)傾倒；4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。1～3分納入研究，0分和4分予以排除。

1.2.3切片制作及尼氏染色方法 各組大鼠在預(yù)定時間點(diǎn)麻醉處死,迅速斷頭取腦,在-20℃冷凍30 min,置腦模具中由額極到枕極切成2 mm厚的冠狀切片,放于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫蠟水化后將切片浸入1%甲苯胺藍(lán)溶液染色6 min，蒸餾水浸5 min去除浮色，依次放入70%乙醇2 min，95% 乙醇5 min，100%乙醇浸泡 3 min；然后用透明劑(二甲苯)透明2次，5 min/次，中性樹膠封片。每只大鼠隨機(jī)選擇2張經(jīng)尼氏染色的大腦切片進(jìn)行觀察。將切片置于20倍全景組織定量分析系統(tǒng)顯微鏡下觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體的染色情況，觀察其病理改變。

1.2.4各組大鼠腦組織及肝組織中PP4 mRNA水平檢測 取各組-80℃保存的大鼠腦組織和肝組織標(biāo)本約0.2 g，液氮快速研磨，并根據(jù)Trizol法提組織RNA；測濃度及純度，取1.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍，取2 μl作為模板進(jìn)行qPCR。PP4C上游引物：5′-TGGCTGACTATTTCCTGTGAC-3′，下游引物：5′-CAACCTCTCCAGAGCAAGTC-3′，內(nèi)參β-actin上游引物:5′-CACTTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游引物:5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。以滅菌純水為無模板對照，使用不經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的總RNA作為模板檢測基因組DNA污染。qPCR 數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法,利用Graph pad8.0作圖。

1.2.5各組大鼠腦組織及肝組織中PP4 蛋白水平檢測 取100 mg -80℃保存的腦組織，液氮充分研磨后加入0.5 ml RIPA(含PMSF)充分裂解組織提取蛋白，用Bradford法測濃度。各組取相同量總蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含5%脫脂牛奶的PBST溶液封閉 PVDF 膜，山羊抗小鼠PP4抗體(1∶1 000)與封閉的PVDF膜室溫孵2 h，PBST 洗膜，二抗(1∶5 000) 室溫孵育PVDF膜2 h，PBST洗膜，最后采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法進(jìn)行顯色。利用圖像處理軟件Image J對蛋白電泳圖進(jìn)行灰度分析，并以目的蛋白和內(nèi)參蛋白的比值作為目的蛋白的相對定量值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評分分析 MCAO組〔MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組神經(jīng)功能損傷評分分別為：(1.145±0.363 6)分、(2.170±0.574 5)分、(2.950±0.463 0)分〕動物出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀,主要表現(xiàn)為活動減少、精神萎靡、行走時向左側(cè)傾倒或是不停地轉(zhuǎn)圈追尾，MCAO-6 h組、MCAO-12 h組神經(jīng)功能損傷評分顯著高于MCAO-2 h組(P<0.01，n=5)。NORMAL組及SHAM組動物肢體活動自如,無神經(jīng)功能損傷癥狀。

2.2各組腦組織形態(tài)學(xué)分析 尼氏染色顯示,NORMAL組及SHAM組神經(jīng)細(xì)胞未見明顯異常，MCAO組梗死區(qū)尼氏小體數(shù)量減少，隨時間延長，尼氏小體數(shù)量遞減，見圖1。

圖1 各組腦組織尼氏染色(×20)

2.3肝、腦組織中PP4 mRNA水平分析 MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組腦組織PP4C mRNA水平較NORMAL組顯著降低(P<0.05,P<0.001)；MCAO-2 h組肝組織PP4C mRNA水平較NORMAL組顯著升高(P<0.001)；MCAO-6 h組、MCAO-12 h組肝組織PP4C mRNA水平與NORMAL組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4腦卒中肝、腦組織中PP4蛋白的表達(dá) MCAO-2 h、MCAO-6 h組腦肝組織PP4R2蛋白水平較NORMAL組顯著降低(P<0.001,P<0.01)；MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組肝組織PP4R2蛋白水平較NORMAL組顯著升高(P<0.01)；除MCAO-12 h組肝組織PPX蛋白水平較NORMAL組顯著降低(P<0.01)外，各組腦組織、肝組織PPX蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

1～4：NORMAL組、MCAO-2 h組、MCAO-6 h組、MCAO-12 h組圖2 PP4R2和 PPX蛋白在大鼠腦、肝組織中的表達(dá)

3 討 論

缺血性腦卒中與其他缺血性疾病類似，其發(fā)病過程是一個多步驟、多途徑、多階段相互作用和相互影響的復(fù)雜過程，這是導(dǎo)致該病治療困難，致殘率高、復(fù)發(fā)率高的重要原因〔13〕。研究表明，其致病機(jī)制極為復(fù)雜，腦缺血過程中，能量代謝障礙是腦缺血損傷的首要環(huán)節(jié)，而炎癥和氧化應(yīng)激損傷在腦缺血損傷過程中也扮演著重要的角色〔14,15〕。因此，從分子水平揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，成為該病治療的研究熱點(diǎn)。

本研究從分子水平驗(yàn)證PP4在缺血性腦卒中腦、肝組織的表達(dá)是否存在差異。因?yàn)槟X缺血損傷是一個復(fù)雜的病理級聯(lián)反應(yīng)，包括能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血腦屏障、炎癥反應(yīng)及炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞因黏附分子表達(dá)增加促進(jìn)的炎癥細(xì)胞浸潤〔16〕。DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中會產(chǎn)生Ser-140位點(diǎn)磷酸化的H2AFX蛋白(γ-H2AFX)，而PP4C-PP4R2-PP4R3A PP4復(fù)合物可特異性使該位點(diǎn)脫磷酸，這是DNA修復(fù)的重要步驟。 研究表明，PP4作用的增加主要?dú)w因于PP4R2的增加，該亞基增強(qiáng)了磷酸IKKα/βS176/180與PP4C的締合，導(dǎo)致磷酸化 IKKα/βS176/180〔17〕。本研究結(jié)果表明缺血性腦卒中大鼠機(jī)體內(nèi)PP4 處于低表達(dá)狀態(tài)，因?yàn)轶w內(nèi)能量代謝紊亂和供能降低在多種神經(jīng)病理性損傷中起重要作用，能量供應(yīng)在有效治療缺血性疾病中至關(guān)重要〔18〕。缺血性腦卒中導(dǎo)致腦部缺血缺氧，進(jìn)而引起能量代謝降低，而腦部屬于缺血性腦卒中直接影響部位，并且腦是機(jī)體中耗能最高的器官。本研究中MCAO-2 h組肝組織PP4C mRNA表達(dá)水平較NORMAL組高，6 h和12 h與NORMAL組無差異，可能與腦卒中患者血脂異常發(fā)生率較高，且總膽固醇增高明顯有關(guān)〔19〕。隨著總膽固醇增高，脂代謝增強(qiáng)，而肝臟是脂代謝的主要器官，因而在肝組織PP4表達(dá)增強(qiáng)；而6 h和12 h mRNA表達(dá)水平可能是隨時間延長，肝臟通過代償使PP4表達(dá)與NORMAL組一致〔20〕。肝組織蛋白水平和基因水平在6 h和12 h稍存在差異，可能是當(dāng)機(jī)體發(fā)生急性缺血性腦卒中時，肝細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)刺激機(jī)體快速將PP4C mRNA水平翻譯成蛋白，短時間內(nèi)提高了PP4C基因的翻譯效率，但機(jī)體PP4C基因瞬時轉(zhuǎn)錄水平有限，不足以修復(fù)肝損傷區(qū)和缺血區(qū)肝細(xì)胞內(nèi)大量已損傷DNA分子，尚無法逆轉(zhuǎn)急性缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展〔21〕。

綜上所述，在缺血性腦卒中發(fā)病前后的肝、腦組織中PP4的表達(dá)差異明顯，而腦組織和肝臟呈現(xiàn)不同的表達(dá)變化模式，提示PP4與缺血性腦卒中存在一定關(guān)聯(lián)性，并且腦卒中過程中PP4在腦組織和肝臟中的功能因組織種類而可能具有差異，為今后對缺血性腦卒中靶向用藥和進(jìn)一步研究提供了思路和方向。