羅思敏，葉菱秀，郝 茜

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025

抗體是由漿細(xì)胞分泌的免疫球蛋白，擁有2 條完全相同的重鏈和輕鏈。重鏈蛋白由可變（variable，V）、多樣（diversity，D）、連接（joining，J）、恒定（constant，C）區(qū)的基因編碼構(gòu)成，其中胚系基因眾多的V、D、J 片段需通過(guò)V（D）J 重排方可行使功能，如形成由低親和力、單一類型抗體組成的初級(jí)抗體庫(kù)。當(dāng)初始B細(xì)胞受到外界抗原刺激時(shí)，其可從骨髓遷出進(jìn)入脾臟、淋巴結(jié)和扁桃體等次級(jí)淋巴組織，經(jīng)歷體細(xì)胞高頻突變（somatic hypermutation，SHM）和類別轉(zhuǎn)換（class switch recombination，CSR），進(jìn)一步產(chǎn)生由高親和力、不同類型抗體組成的次級(jí)抗體庫(kù)［1-2］。在SHM 過(guò)程中，激活誘導(dǎo)胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）可作用于抗體可變區(qū)的基因序列，將序列中的胞苷殘基脫氨變成尿苷，引發(fā)突變事件。研究［3］發(fā)現(xiàn)，AID 傾向于作用在RGYW（R=A/G，Y=C/T，W=A/T）基序上，特別是AGCT基序。與此同時(shí)，機(jī)體可通過(guò)堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）和錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）途徑對(duì)DNA 進(jìn)行修復(fù)，而此過(guò)程中一些損傷修復(fù)因子可能會(huì)使DNA 斷裂末端非模板堿基發(fā)生插入或缺失，從而使抗體基因產(chǎn)生更多的插入和缺失片段。

廣譜中和抗體（broadly neutralizing antibodies，bnAbs）是由B 細(xì)胞產(chǎn)生的能夠中和多種病毒毒株的抗體［4］；和普通中和抗體相比，bnAbs具有較長(zhǎng)的抗體重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining regions，CDRs），大量的點(diǎn)突變、抗體基因片段插入 和 缺 失（insertions and deletions，indels） 等 特征［5-6］。雖然基因片段的插入和缺失是抗體親和力成熟過(guò)程中的小概率事件，但其對(duì)抗體的廣譜中和能力發(fā)揮著關(guān)鍵作用［7-8］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，在已報(bào)道的人類免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的廣譜中和抗體中，約有40%存在indels。目前，由于缺乏合適的研究體系，這些indels 的產(chǎn)生機(jī)制尚不明確；且本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度為1 bp 和大于1 bp 的indels 的產(chǎn)生來(lái)源亦不盡相同。

有研究［9-10］顯示，眾多的細(xì)胞作用因子參與了由AID 介導(dǎo)的SHM 過(guò)程中的DNA 損傷修復(fù)。其中，DNA 聚合酶β（polymerase β，Polβ）由基因Polb編碼（小鼠中），參與了填補(bǔ)單個(gè)堿基的短片段BER、引入多個(gè)堿基的長(zhǎng)片段BER 過(guò)程，被認(rèn)為可能是AID 介導(dǎo)SHM 過(guò)程中影響抗體基因突變事件（包括點(diǎn)突變、插入和缺失）的重要因子［11］。由于Polβ 在DNA 復(fù)制中發(fā)揮了重要作用，完全敲除Polb基因會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡［12］，因此可考慮利用Polβ 抑制劑來(lái)分析Polβ 對(duì)抗體基因點(diǎn)突變、插入和缺失的影響。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，扎西他濱（2'，3'-dideoxycytidine，DDC）［13］和5- 甲 氧 基 黃 酮（5-methoxyflavone，5-MF）［14］為Polβ 的抑制劑，能有效抑制Polβ 的功能。因此，本研究猜測(cè)，是否可使用DDC 和5-MF來(lái)觀察AID 介導(dǎo)SHM 過(guò)程中Polβ 對(duì)抗體基因突變事件的發(fā)生頻率存在的影響，目前此類研究尚未見報(bào)道。

在小鼠B 淋巴瘤細(xì)胞CH12F3 中，抗體重鏈（heavy chain，H）由2 條等位基因編碼，一條為有功能等位基因，另一條為無(wú)功能等位基因，其中有功能等位基因中的VDJ 序列由VH1-53、DH1-1、JH2 組成［15-16］，且固定該序列有利于建庫(kù)測(cè)序過(guò)程中的PCR引物設(shè)計(jì)。本研究利用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)，在過(guò)表達(dá)AID 的CH12F3 細(xì)胞中建立體外檢測(cè)抗體基因突變的方法，并利用該方法初步探究Polβ抑制劑對(duì)抗體基因突變頻率的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 小鼠B 淋巴瘤細(xì)胞株CH12F3、慢病毒包裝質(zhì)粒pCL-10A1、表達(dá)質(zhì)粒pMX-AID 均由中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心孟飛龍課題組饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 DDC、0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液、β-巰基乙醇（Sigma，美國(guó)），5-MF（MCE，美國(guó)），Polβ 抗 體（Abcam，美 國(guó)），AICDA （activationinduced cytidine deaminase）抗體、β 微管蛋白（βtubulin）抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司），山羊抗兔IgG（Proteintech，美國(guó)），DMEM 培養(yǎng)基（Corning，美國(guó)），RPMI-1640 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、L-谷氨酰胺、嘌呤霉素（Gibco，美國(guó)），胎牛血清（上海吉泰依科賽生物科技有限公司），DNA 純化回收試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CH12F3 細(xì)胞（懸浮細(xì)胞）采用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺以及5×10-5mol/L β-巰基乙醇的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。293T 細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞的培養(yǎng)條件均為37 ℃、5%CO2，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒包裝 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化293T 細(xì)胞；隨后，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將該細(xì)胞密度調(diào)整為8×105/mL，并將其接種于10 cm培養(yǎng)皿中；轉(zhuǎn)染前2 h 進(jìn)行細(xì)胞換液。將30 μg pMXAID 質(zhì) 粒、6 μg pCL-10A1 質(zhì) 粒、62 μL 2 mol/L CaCl2、500 μL 2×4-羥 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸 緩 沖 鹽 水（HEPES buffer saline，HBS）、雙蒸水制成1 mL 轉(zhuǎn)染混合液，靜置20 min 后將該混合液均勻滴加至上述培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行細(xì)胞換液，加入5.5 mL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染后48 h，用10 mL 注射器和0.45 μm 過(guò)濾器收集慢病毒上清液，再次加入5.5 mL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染后72 h再次過(guò)濾并收集慢病毒上清液，混合后立即使用或于4 ℃存放備用。

1.2.3 慢病毒感染 將CH12F3細(xì)胞（5×105/mL）接種于24 孔板中，每孔加入1 mL 慢病毒上清液（“1.2.2”中獲得），混勻后靜置20 min。將細(xì)胞培養(yǎng)板用封口膜密封后，于32 ℃、1 200×g條件下離心1.5 h，取出培養(yǎng)板并去除封口膜后，將其置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換為“1.2.1”中培養(yǎng)CH12F3 細(xì)胞的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次進(jìn)行慢病毒感染（步驟同前）。每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，于第2 次感染36 h 后，加入1 μg/mL 嘌呤霉素進(jìn)行48 h篩選。收集經(jīng)慢病毒感染的CH12F3 細(xì)胞（處理組）和感染前的CH12F3 細(xì)胞（對(duì)照組），于300 ×g離心5 min 后棄去上清液，用于后續(xù)蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)和高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。

1.2.4 Western blotting檢測(cè) 分別向“1.2.3”收集的處理組和對(duì)照組細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min 后于4 ℃、15 000×g離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2×SDS 上樣緩沖液，于100 ℃下加熱10 min 獲得總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、硝酸纖維素膜印跡后，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗，包括AID抗體（1∶1 000）、Polβ 抗體（1∶1 000）、β-tubulin 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜后用PBST洗膜3次，再加入二抗（1∶5 000）。室溫孵育1 h，經(jīng)PBST 洗膜3 次后，加入化學(xué)發(fā)光顯影液進(jìn)行曝光。

1.2.5 高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建、數(shù)據(jù)處理及分析從“1.2.3”收集的處理組和對(duì)照組CH12F3 細(xì)胞中提取基因組DNA，通過(guò)3 輪PCR 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建（圖1）。第1 輪PCR 反應(yīng)中，以抽提的基因組DNA 為模板，使用抗體基因VDJ 片段的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：基因組DNA 2 μg、dNTP 200 μmol/L、正向/反向引物各0.2 μmol/L、Q5 反應(yīng)液10 μL、Q5?高保真DNA 聚合酶1 U，反應(yīng)條件為：98 ℃30 s，98 ℃10 s、62 ℃30 s、72 ℃30 s （20 個(gè)循環(huán)），72 ℃2 min。第2 輪PCR 反應(yīng)中，以2 μL 第1 輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，引物擴(kuò)增片段覆蓋VDJ 區(qū)的CDR2 和CDR3，反應(yīng)體系與第一輪PCR 相同（模板除外），反應(yīng)條件亦與第一輪PCR 相同（除需將循環(huán)數(shù)降至16）。第3 輪PCR 反應(yīng)中，以1 μL 第2 輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以Illumina P5 和P7 作為引物，反應(yīng)體系與第一輪PCR 相同（模板除外），反應(yīng)條件亦與第一輪PCR 相同（除需將循環(huán)數(shù)降至15）。將最終的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（350～450 bp）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再使用DNA 純化回收試劑盒回收DNA 片段，于Illumina Hiseq 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序模式為2×150。3輪PCR所用的引物序列參照文獻(xiàn)［17］。

圖1 高通量測(cè)序樣品準(zhǔn)備流程圖及PCR策略Fig 1 Flowchart of preparation for high-throughput sequencing and PCR strategies

隨后，我們對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。使用課題組自定義腳本拆解數(shù)據(jù)，并用Bowtie2 軟件［18］將其與參考序列進(jìn)行比對(duì)。同時(shí)，使用SHM 流程代碼［3］對(duì)點(diǎn)突變、缺失和插入進(jìn)行定義：如果1 個(gè)核苷酸與參考序列不同，且其Illumina 測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于20，則將其視為點(diǎn)突變；如果相對(duì)于參考序列，缺口兩側(cè)的4 個(gè)連續(xù)核苷酸的Illumina 測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于20，則該缺口被定義為缺失；如果相對(duì)于參考序列，僅存在單個(gè)插入且插入序列中2 個(gè)連續(xù)核苷酸的Illumina 測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于20，則被定義為插入。

而后，我們對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，具體如下：①點(diǎn)突變分析。繪制單堿基突變圖譜（即由每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸所含點(diǎn)突變的讀長(zhǎng)占總測(cè)序讀長(zhǎng)的百分比構(gòu)成）、總體突變頻率圖（即由包含點(diǎn)突變的序列讀長(zhǎng)占所有測(cè)序讀長(zhǎng)的百分比構(gòu)成），以觀察突變模式和發(fā)生頻率。②indels 分析。繪制indels 發(fā)生的頻率圖（即由indels 總數(shù)占所有測(cè)序讀長(zhǎng)的百分比構(gòu)成）和indels 的分布圖（即由每20 個(gè)堿基中缺失的起點(diǎn)或插入的位點(diǎn)總數(shù)占所有測(cè)序讀長(zhǎng)的百分比構(gòu)成），以觀察indels的發(fā)生頻率和分布情況。

1.2.6 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè) 取“1.2.1”中培養(yǎng)的CH12F3細(xì)胞（5×105/mL）接種于24孔板中，每孔接種的細(xì)胞總量為106，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用不同濃度的DDC（12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L）和等體積的0.9%NaCl分別處理CH12F3細(xì)胞，采用不同濃度的5-MF（12.5、25、50、100、200 μmol/L）和等體積的DMSO分別處理CH12F3細(xì)胞，經(jīng)24、48、72 h后分別將上述細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液以1∶1的比例均勻混合。取10 μL細(xì)胞混合液加入計(jì)數(shù)板中，于顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)存活（未染色）的細(xì)胞數(shù)量及活細(xì)胞率。最終，分別選擇該2種抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖影響較小的最大濃度作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)濃度。

1.2.7 DDC 和5-MF 對(duì)抗體基因VDJ 片段點(diǎn)突變、插入和缺失的檢測(cè) 分別以“1.2.6”中獲得的DDC濃度、5-MF 濃度處理CH12F3 細(xì)胞（即實(shí)驗(yàn)組），以等體積的0.9%NaCl處理的細(xì)胞、等體積的DMSO 處理的細(xì)胞依次記為上述實(shí)驗(yàn)組的對(duì)照組，每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)樣品。將上述4 組細(xì)胞分別由慢病毒包裝和感染后，收集感染前、后的細(xì)胞行Western blotting，檢測(cè)其AID 和Polβ 的表達(dá)；同時(shí)，提取細(xì)胞的基因組DNA，并行高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建及分析。具體方法同“1.2.2”—“1.2.5”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以±s表示，組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CH12F3 細(xì)胞處理組和對(duì)照組中抗體基因VDJ片段的突變分析

采用Western blotting 檢測(cè)CH12F3 處理組和對(duì)照組中AID的表達(dá)，結(jié)果（圖2A）顯示，CH12F3細(xì)胞處理組中AID的表達(dá)較對(duì)照組有顯著增加，即慢病毒感染成功。

通過(guò)對(duì)高通量測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)CH12F3 細(xì)胞處理組抗體基因VDJ 片段上存在大量的點(diǎn)突變，這些點(diǎn)突變主要集中在CDR2 和CDR3 區(qū)且突變的頻率均較高（圖2B），同時(shí)該突變模式與體內(nèi)生發(fā)中心B 細(xì)胞的突變模式［3］相一致。此外，通過(guò)對(duì)indels 的發(fā)生頻率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，CH12F3 細(xì)胞處理組的indels 的發(fā)生頻率較高（均P=0.000，圖2C、2D）；且該組中片段長(zhǎng)度大于1 bp 的indels 的發(fā)生頻率亦較高（均P=0.000，圖2F、2G）。通過(guò)對(duì)上述indels 事件在抗體基因上的分布進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2E、2H）顯示，CDR2和CDR3區(qū)域的突變頻率高于VDJ 外顯子上的其他區(qū)域，即indels 發(fā)生的區(qū)域與高頻堿基突變的位置相對(duì)應(yīng)。

圖2 CH12F3細(xì)胞處理組和對(duì)照組中，AID的表達(dá)及抗體基因VDJ片段的點(diǎn)突變、插入和缺失頻率的分析Fig 2 Analysis of point mutation, insertion and deletion frequencies in the VDJ regions of antibody genes and AID expression in CH12F3 cells with or without AID overexpression

2.2 Polβ 抑制劑——DDC 對(duì)抗體基因VDJ 片段的突變分析

本研究通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)不同濃度的DDC處理CH12F3 細(xì)胞后對(duì)其增殖能力的影響，結(jié)果（圖3A）顯示，和經(jīng)0.9% NaCl 處理的CH12F3 細(xì)胞（對(duì)照組）相比，分別經(jīng)200、400、800 μmol/L DDC 處理的CH12F3 細(xì)胞在48、72 h 時(shí)的細(xì)胞數(shù)量均有顯著下 降（均P<0.05），而100 μmol/L DDC 處 理 的CH12F3 細(xì)胞則無(wú)明顯差異，因此該濃度被認(rèn)為是DDC 不影響細(xì)胞增殖的最大濃度。隨后，采用100 μmol/L DDC 處理細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組），再通過(guò)Western blotting 檢測(cè)慢病毒感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中AID 和Polβ 的表達(dá)，結(jié)果（圖3B）顯示該2組細(xì)胞的AID 均有表達(dá)，即慢病毒感染成功；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Polβ 的表達(dá)量與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.267），即100 μmol/L DDC 不影響Polβ的表達(dá)。

而后，對(duì)慢病毒感染前、后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共4 組細(xì)胞的基因組DNA 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序。對(duì)抗體基因VDJ 片段的點(diǎn)突變進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3C）顯示，慢病毒感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，其點(diǎn)突變頻率較低（P=0.000）；單堿基突變圖譜（圖3D）顯示，感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中抗體基因VDJ 序列的突變圖譜高度相似，且點(diǎn)突變主要分布在VDJ 片段的CDR2 和CDR3 區(qū)。對(duì)抗體基因VDJ片段的插入頻率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，長(zhǎng)度為1 bp及大于1 bp的插入頻率間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3E），且這些插入大多發(fā)生在CDR2 和CDR3 區(qū)域（圖3F）。對(duì)抗體基因VDJ片段的缺失頻率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，其長(zhǎng)度為1 bp 的缺失頻率較低（P=0.009，圖3G），且這些缺失主要發(fā)生在CDR2 和CDR3區(qū)域（圖3H）。

圖3 DDC對(duì)CH12F3細(xì)胞增殖及對(duì)抗體基因VDJ片段的點(diǎn)突變、插入和缺失頻率的影響Fig 3 Effects of DDC on the proliferation of CH12F3 cells and the frequencies of point mutation,insertion and deletion in the VDJ regions of antibody genes

2.3 Polβ抑制劑——5-MF對(duì)抗體基因VDJ片段的突變分析

通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)不同濃度的5-MF 處理CH12F3 細(xì)胞后對(duì)其增殖能力的影響，結(jié)果（圖4A）顯示，和經(jīng)DMSO 處理的CH12F3 細(xì)胞（對(duì)照組）相比，分別經(jīng)50、100、200 μmol/L 5-MF處理的CH12F3細(xì)胞在24、48、72 h 的細(xì)胞計(jì)數(shù)上顯著下降（均P<0.05），而25 μmol/L 5-MF 處理的CH12F3 細(xì)胞影響較小，因此該濃度被認(rèn)為是5-MF 對(duì)細(xì)胞增殖影響較小的最大濃度。隨后，采用25 μmol/L 5-MF 處理細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組），再通過(guò)Western blotting 檢測(cè)慢病毒感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中AID 和Polβ 的表達(dá)，結(jié)果（圖4B）顯示該2 組細(xì)胞的AID 均有表達(dá)，即慢病毒感染成功；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Polβ 的表達(dá)量與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.115），即25 μmol/L 5-MF不影響Polβ的表達(dá)。

而后，對(duì)慢病毒感染前、后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的基因組DNA 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序分析。對(duì)抗體基因VDJ 片段的點(diǎn)突變進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4C）顯示，慢病毒感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，其點(diǎn)突變頻率較低（P=0.000）；單堿基突變圖譜（圖4D）顯示，感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的點(diǎn)突變主要分布在抗體基因VDJ 片段CDR2 和CDR3 區(qū)。對(duì)抗體基因VDJ 片段的插入頻率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，其長(zhǎng)度大于1 bp的插入頻率較低（P=0.000，圖4E），且這些插入大多發(fā)生在CDR2 和CDR3 區(qū)域（圖4F）。對(duì)抗體基因VDJ 片段的缺失頻率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，其長(zhǎng)度大于1 bp 的缺失頻率亦較低（P=0.000，圖4G），且這些缺失亦主要發(fā)生在CDR2和CDR3區(qū)域（圖4H）。

圖4 5-MF對(duì)CH12F3細(xì)胞增殖及對(duì)抗體基因VDJ片段的點(diǎn)突變、插入和缺失頻率的影響Fig 4 Effects of 5-MF on the proliferation of CH12F3 cells and the frequencies of point mutation, insertion and deletion in the VDJ regions of antibody genes

3 討論

在因病毒感染導(dǎo)致的疾病預(yù)防和治療過(guò)程中，疫苗研制常受到毒株突變的限制。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)，少數(shù)個(gè)體在病毒慢性感染階段可產(chǎn)生廣譜中和抗體，以識(shí)別并廣泛中和多種類型的毒株［19］。目前，已 有 報(bào) 道 從 被HIV［6，20-21］、流 感 病 毒［22］、丙 肝 病毒［23］、埃博拉病毒［24］、寨卡病毒［25］和瘧原蟲［26］等感染的患者體內(nèi)分離得到bnAbs，這些發(fā)現(xiàn)從體液免疫角度給疫苗研制帶來(lái)了新的思路。但bnAbs的產(chǎn)生時(shí)間較長(zhǎng)且難以被誘導(dǎo)，因此如何快速獲得bnAbs成為了亟待解決的問(wèn)題。和普通的中和抗體相比，bnAbs 具有更高頻率的點(diǎn)突變、缺失和插入等，且這些突變事件的發(fā)生不利于疫苗的設(shè)計(jì)，具體機(jī)制亦不明晰。因此，在抗體進(jìn)化過(guò)程中，確定某一個(gè)或某一些影響抗體基因點(diǎn)突變、插入和缺失的作用因子至關(guān)重要。

抗體基因的突變事件發(fā)生頻率極低，用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)手段很難在細(xì)胞系中進(jìn)行檢測(cè)，因此無(wú)法對(duì)其產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行深入研究。為解決這一難題，本研究通過(guò)在CH12F3B 細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)AID 的方式，結(jié)合高通量測(cè)序?qū)υ摷?xì)胞中抗體基因VDJ 片段進(jìn)行深度測(cè)序，成功捕獲到了大量的基因點(diǎn)突變、插入和缺失事件。我們發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞系中檢測(cè)到抗體基因VDJ 片段上CDR2 和CDR3 區(qū)的點(diǎn)突變的頻率較高且分布較集中，這種由AID誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)高頻突變模式與體內(nèi)生發(fā)中心B 細(xì)胞的突變模式一致［3］。此外，插入和缺失發(fā)生的位置也主要在抗體基因VDJ 片段上CDR2 和CDR3 區(qū)，且抗體基因缺失的分布規(guī)律與小鼠體內(nèi)生發(fā)中心B 細(xì)胞的研究［3］結(jié)果亦相一致。上述結(jié)果表明，我們?cè)隗w外CH12F3 細(xì)胞系中構(gòu)建的AID過(guò)表達(dá)的研究方法可有效檢測(cè)抗體基因VDJ片段突變事件的產(chǎn)生，進(jìn)而有望利用該方法去尋找影響其突變事件發(fā)生的關(guān)鍵因子。

隨后，我們利用已建立的方法進(jìn)一步探索參與DNA 損傷修復(fù)的細(xì)胞作用因子——Polβ 的抑制劑DDC 和5-MF 對(duì)抗體基因點(diǎn)突變、缺失和插入的影響。通過(guò)對(duì)慢病毒感染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的突變頻率進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 μmol/L DDC 處理的CH12F3 細(xì)胞與對(duì)照組相比，點(diǎn)突變頻率、長(zhǎng)度為1 bp的缺失頻率均較低，而大于1 bp的插入和缺失頻率亦有下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而經(jīng)25 μmol/L 5-MF 處理的CH12F3 細(xì)胞與對(duì)照組比較，點(diǎn)突變頻率、長(zhǎng)度大于1 bp的插入和缺失頻率均有降低。這些結(jié)果均表明，DDC和5-MF能夠通過(guò)抑制Polβ的活性來(lái)影響抗體基因VDJ 序列上點(diǎn)突變、插入和缺失的發(fā)生頻率，因此Polβ 或是影響抗體基因點(diǎn)突變、插入和缺失的關(guān)鍵因子。

本研究在體外建立利用小鼠B 淋巴瘤細(xì)胞系CH12F3 研究抗體基因VDJ 片段點(diǎn)突變、插入和缺失的方法具有以下優(yōu)勢(shì)：①方便快捷，實(shí)驗(yàn)周期較短。②便于通過(guò)基因敲除、蛋白過(guò)表達(dá)或抑制劑處理等方式處理細(xì)胞，進(jìn)行高通量篩選，初步找出可能影響突變事件的關(guān)鍵因子。③投入成本較低，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單。盡管如此，該方法也存在一定的局限性：①細(xì)胞環(huán)境較為單一，而機(jī)體內(nèi)部環(huán)境復(fù)雜多樣，CH12F3 細(xì)胞過(guò)表達(dá)AID 并不能完全模擬生發(fā)中心B細(xì)胞經(jīng)歷SHM 的過(guò)程。②單次只能檢測(cè)1 個(gè)基因?qū)贵w基因VDJ 序列產(chǎn)生的影響。③對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)突變、插入和缺失事件的檢測(cè)數(shù)少于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)論推導(dǎo)到體內(nèi)未必相符。因此，通過(guò)本研究方法篩選得到的影響抗體基因突變事件的關(guān)鍵因子還需通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

綜上所述，本研究建立了通過(guò)細(xì)胞系研究抗體基因VDJ 片段點(diǎn)突變、插入和缺失的檢測(cè)方法，或?qū)轶w外篩選影響抗體基因突變事件發(fā)生的關(guān)鍵因子提供高效的方法。近年來(lái)，伴隨著高通量測(cè)序分析抗體序列的不斷發(fā)展，設(shè)計(jì)的測(cè)序引物不能涵蓋所有抗體基因片段、抗體重鏈與輕鏈的配對(duì)信息難以檢測(cè)、對(duì)測(cè)序過(guò)程中可能引入的堿基插入和缺失進(jìn)行分析等問(wèn)題仍將是解析抗體基因序列中突變事件產(chǎn)生機(jī)制的難點(diǎn)。未來(lái)，本研究還將繼續(xù)深入探究在AID 介導(dǎo)的SHM 過(guò)程中抗體基因VDJ序列突變事件的產(chǎn)生機(jī)制，以期為bnAbs的篩選和誘導(dǎo)提供新的線索。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

郝茜和葉菱秀參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，羅思敏和郝茜參與了數(shù)據(jù)分析和整理，羅思敏、郝茜和葉菱秀參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by HAO Qian and YEAP Lengsiew. The data was collected and analyzed by LUO Simin and HAO Qian. The manuscript was drafted and revised by LUO Simin， HAO Qian and YEAP Lengsiew. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-31

·Accepted：2022-03-25

·Published online：2022-04-28