張 咪，柳淑君，李福彬，張 燕

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025

單克隆抗體是抗體的一類主要形式，單克隆抗體藥物治療的有效性、安全性和特異性，使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有非常重要的地位［1-2］。1986—2021 年，在美國(guó)或歐盟獲批的抗體治療藥物數(shù)量從1 個(gè)增至100個(gè)［3］；且至2019年11月，共有79種抗體藥物正處于后期臨床研究實(shí)驗(yàn)［2］。為了提高單克隆抗體的藥效和成藥性，抗體優(yōu)化技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。

其 中， IgG 抗 體Fc （fragment crystallizable domain）的優(yōu)化是抗體優(yōu)化的一個(gè)重要領(lǐng)域。這是由于Fc 序列的變化決定了抗體與Fcγ 受體（Fcγ recepter，F(xiàn)cγR）、新生兒Fc 受體以及補(bǔ)體蛋白C1q的親和力。大量研究表明，多種類型IgG 單克隆抗體的活性受到其Fc 與FcγR 相互作用的影響。人和小鼠均表達(dá)多種IgG 亞型和多種FcγR。IgG 抗體Fc 與特定FcγR 的結(jié)合對(duì)其功能有不同的影響，比如IgG1 突變體（S298A/E333A/K334A）提高了其與FcγRIIIA的結(jié)合能力，使得FcγRIIIA 介導(dǎo)的抗體依賴細(xì)胞毒（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC） 作用增強(qiáng)，從而將該IgG1 突變體（即曲妥珠單抗）對(duì)表達(dá)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 （human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3 的體外殺傷能力提高了50～100 倍［4］；另一個(gè)IgG1 突變體（G236A/S239D/I332E）與FcγRIIA 的親和力提高了70倍，與FcγRIIA/FcγRIIB親和力提高了15 倍，可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)抗體靶向細(xì)胞的吞噬作用［5］。因此，通過(guò)改變抗體Fc與其FcγR 結(jié)合屬性進(jìn)而改變抗體功能，是重要的抗體藥物優(yōu)化思路。

抗體Fc 優(yōu)化的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是IgG 的Fc 部分至少有4 個(gè)片段與FcγR 相互作用［6］，直接相互作用的氨基酸位點(diǎn)約20 個(gè)。同時(shí)，不排除其他部分還可能產(chǎn)生間接影響。如N297 糖基化位點(diǎn)是人IgG 與FcγR結(jié)合的中心，N297A 突變可導(dǎo)致IgG 與FcγR 不能結(jié)合［7］；P396L 突變可導(dǎo)致ADCC 活性增加［8］。因此，優(yōu)化抗體Fc 與FcγR 結(jié)合能力時(shí)需要同時(shí)考慮的氨基酸位點(diǎn)較多，這使得Fc 的突變文庫(kù)非常大。同時(shí)，翻譯后修飾對(duì)Fc 和FcγR 相互作用也具有重要影響，使得抗體Fc 的優(yōu)化只能依托真核細(xì)胞表達(dá)平臺(tái)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)是表達(dá)和分泌人類抗體最天然的系統(tǒng)。然而，相對(duì)于文庫(kù)多樣性可達(dá)到1010的噬菌體展示系統(tǒng)和107的酵母展示系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)的篩選效率在很大程度上受到穩(wěn)轉(zhuǎn)文庫(kù)規(guī)模?。s104）的限制［9］。如何有效地實(shí)現(xiàn)更大范圍的Fc突變篩選，一直是一個(gè)重要的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

3T3 細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）；Phoenix細(xì)胞和Helper輔助質(zhì)粒由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院黃傳新博士課題組饋贈(zèng)；同源重組試劑盒（Hieff Clone? Plus Multi One Step Cloning Kit，貨號(hào)10912ES10）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；高保真DNA 聚合酶Pfu（貨號(hào)AP231）和大腸埃希菌（E. coli）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（貨號(hào)CD201）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；PEI 轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)：24765-2）購(gòu)自美國(guó)Polysciences 公司；膠回收試劑盒（Gel extraction kit，貨號(hào)D2500-02）、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒（Endo-Free Plasmid DNA Maxi Kit，貨號(hào)D6926-03）購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-tek 公司；Polybrene 助轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)GM-040901）購(gòu)自吉滿生物科技（上海）有限公司；PBS 緩沖液（貨號(hào)B320KJ）購(gòu)自上海源培生物科技公司；DAPI 熒光染料（貨號(hào)D3571）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；蛋白酶K（貨號(hào)B600452）、1 mol/L Tris-HCl pH 8.0 溶液（貨號(hào)B548127）、NaCl （貨 號(hào)A100241） 和SDS （貨 號(hào)A100227） 購(gòu)自生工生物工程（上海） 股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)和PCR 以實(shí)驗(yàn)室已有的哺乳動(dòng)物表面展示載體MIGR1-IgG2［該載體具有的特征是在膜表面表達(dá)人抗體IgG2 的同時(shí)也會(huì)表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）］為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（引物序列中除正常堿基外為簡(jiǎn)并堿基：R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T）。對(duì)合成的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行等比例混合（不考慮引物所含突變多樣性，直接等量混合）或者按該條引物所攜帶的突變數(shù)占總文庫(kù)多樣性的比例進(jìn)行混合（例如：簡(jiǎn)并引物編號(hào)為1 的引物包含3 072 種突變，則其占比為3 072/41 600×100%=7.38%，那么取7.38 μL 該引物，其他引物也按照計(jì)算的比例加入，混合）。然后進(jìn)行PCR使目的片段和線性化MIGR1-IgG2 載體具有相同末端序列，并根據(jù)膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)其進(jìn)行純化。

1.2.2 抗體Fc 突變質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建 純化后的具有相同末端序列的線性化載體和插入片段，通過(guò)同源重組酶進(jìn)行重組反應(yīng)。取10 μL 上述反應(yīng)產(chǎn)物加至100 μLE. coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，冰上靜置30 min，42 ℃熱激90 s，冰上放置2 min，加入500 μL LB 培養(yǎng)基，于37 ℃，搖床200 r/min 孵育30 min 后，取少量DH5α 菌液涂平板，過(guò)夜培養(yǎng)，次日計(jì)算克隆數(shù)。當(dāng)克隆數(shù)為文庫(kù)大小的2～5倍時(shí)，認(rèn)為該文庫(kù)構(gòu)建成功，并且將這些單克隆菌落，進(jìn)行一代測(cè)序（Sanger測(cè)序），檢測(cè)文庫(kù)的質(zhì)量。余下的DH5α 菌液，進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒提取質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒文庫(kù)。

1.2.3 抗體Fc 突變細(xì)胞文庫(kù)的構(gòu)建 將上述大抽質(zhì)粒文庫(kù)和Helper 輔助質(zhì)粒（摩爾比為2∶1），與轉(zhuǎn)染試劑PEI（總質(zhì)粒與PEI 質(zhì)量比為1∶5）混合，轉(zhuǎn)染提前鋪板的Phoenix 細(xì)胞（融合度為50%～60%），6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集含有反轉(zhuǎn)錄病毒的上清液。將該上清液與新鮮DMEM 培養(yǎng)基1∶1 混合，并加入Polybrene（終濃度為8 μg/mL），混勻后感染提前鋪板的3T3 細(xì)胞（融合度為50%～65%），24 h 后換液，48 h后即可獲得表達(dá)抗體Fc突變的細(xì)胞文庫(kù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析Phoenix 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和3T3 細(xì)胞的感染效率 胰酶消化收集Phoenix 細(xì)胞或者3T3 細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸浮液，PBS 緩沖液洗滌2 次，并用含有DAPI（0.5 μg/mL）的200 μL 流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果用FlowJo軟件分析。

1.2.5 基因組DNA 提取 取約1.5×106個(gè)3T3 細(xì)胞，500×g離 心5 min 取 上 清 液，PBS 緩 沖 液 洗 滌1 次，200 μL 無(wú)SDS 的基因組DNA 緩沖液［100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、 1 mmol/L EDTA］重懸，并加入4 μL濃度為10 μg/μL蛋白酶K，吹打混勻。然后加入200 μL 含有SDS 的基因組DNA緩 沖 液［100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1 mmol/L EDTA、1%SDS］，37 ℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入400 μL 異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)混勻，將會(huì)看到DNA 析出。然后用槍頭挑出DNA，加入800 μL 70%乙醇洗滌。再挑出DNA 晾干，最后加入100 μL ddH2O溶解，即獲得細(xì)胞基因組DNA。

1.2.6 高通量測(cè)序評(píng)估文庫(kù)構(gòu)建情況 取大抽質(zhì)粒約60 ng或者待分析細(xì)胞DNA作為模板，自建庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序（PE150），獲得500 萬(wàn)～800 萬(wàn)條序列。使用Flash 程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行拼接，得到高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)。提取突變區(qū)域的核苷酸序列，將其批量翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列（http：//www.cbs.dtu.dk/services/VirtualRibosome/）［10］，在Rstudio 和Excel 中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算期望文庫(kù)突變?cè)诳偽膸?kù)中出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果

2.1 篩選與FcγRIIB 親和力增強(qiáng)的氨基酸單點(diǎn)突變

為了縮小影響FcγRIIB 親和力的氨基酸突變的范圍，我們首先選擇可能有直接影響的氨基酸位點(diǎn)，包括4 個(gè)區(qū)域，分別為EU 編號(hào)233～240、265～269、297～299、327～333 的位點(diǎn)［6］，對(duì)其進(jìn)行單點(diǎn)的任意突變，并通過(guò)篩選確定這些氨基酸突變。結(jié)果顯示，流式細(xì)胞術(shù)分選后，與FcγRIIB 結(jié)合的細(xì)胞比例逐步增多（圖1）。對(duì)分選前后細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析，與野生型相比，表1 中的氨基酸增強(qiáng)了抗體Fc 與FcγRIIB的親和力。本研究選取區(qū)域1（EU 編號(hào)233～240的位點(diǎn)）構(gòu)建Fc組合突變文庫(kù)。

第七，合理使用中藥和益生菌添加劑。在抗生素限用的時(shí)代，在防控疾病時(shí)，盡量采用中藥類制劑和微生態(tài)制劑，這樣可以避免殘留的發(fā)生，當(dāng)然盡量做到不發(fā)病才是最好的。

圖1 分選前后點(diǎn)突變文庫(kù)的檢測(cè)Fig 1 Analysis of point mutation libraries before and after sorting

表1 EU編號(hào)233～240位點(diǎn)與FcγRIIB親和力增強(qiáng)的氨基酸Tab 1 Amino acids with enhanced affinity for FcγRIIB at 233-240 of EU numbring

2.2 高容量Fc組合突變質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建

由于多個(gè)氨基酸同時(shí)參與IgG 抗體Fc 和FcγR 相互作用，各個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變并非簡(jiǎn)單的加減關(guān)系，而可能具有復(fù)雜的相互影響。我們推測(cè)，同時(shí)考慮多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變組合對(duì)獲得更好的優(yōu)化序列是必要的。因此，我們?cè)谝呀?jīng)獲得的單點(diǎn)氨基酸突變的基礎(chǔ)上，構(gòu)建能夠覆蓋全部區(qū)域1 的氨基酸位點(diǎn)的組合突變文庫(kù)。

根據(jù)表1所示氨基酸設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（表2），利用多個(gè)簡(jiǎn)并引物構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，使得組合突變文庫(kù)包含表1 所示的所有突變氨基酸組合，同時(shí)盡可能降低簡(jiǎn)并引物帶來(lái)的其他氨基酸突變。文庫(kù)中所包含的突變種類有11 520種（期望文庫(kù)多樣性，其計(jì)算方法為每個(gè)位點(diǎn)氨基酸種類相乘的結(jié)果，即6×4×4×4×5×3×2=11 520 種），增加到41 600 種（實(shí)際文庫(kù)多樣性，其計(jì)算方法為32 條簡(jiǎn)并引物包含的突變氨基酸種類相加：3 072+256+……+1 152+96=41 600 種），是期望文庫(kù)多樣性的3.6倍。

表2 簡(jiǎn)并引物的序列Tab 2 Sequences of the degenerate primers

2.3 按比例添加簡(jiǎn)并引物可提高文庫(kù)的均一性與完整性

將簡(jiǎn)并引物按等比例或者按引物所包含突變多樣性占比混合，進(jìn)行PCR 連接轉(zhuǎn)化制備質(zhì)粒文庫(kù)，對(duì)質(zhì)粒文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。結(jié)果（表3）顯示：等比例混合引物時(shí)，在組合突變質(zhì)粒文庫(kù)中有10 855種為期望文庫(kù)中的組合突變，即所構(gòu)建的質(zhì)粒文庫(kù)覆蓋了期望文庫(kù)中94.24%的組合突變，突變出現(xiàn)頻率大于等于10-6的比例為82.38%；而按一定比例混合引物時(shí)，在組合突變質(zhì)粒文庫(kù)中有11 472種為期望文庫(kù)中的組合突變，即所構(gòu)建的質(zhì)粒文庫(kù)覆蓋了期望文庫(kù)中99.58%的組合突變，且出現(xiàn)頻率均大于等于10-6。隨機(jī)選取10 個(gè)單克隆菌落進(jìn)行一代測(cè)序，結(jié)果（表4）顯示，10 條序列中有3 個(gè)為期望文庫(kù)的序列，另外7 個(gè)為簡(jiǎn)并引物所引入的新的組合突變，同時(shí)比例也與上述3.6 倍基本相符。我們選取按突變種類占比混合引物制備的質(zhì)粒文庫(kù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 簡(jiǎn)并引物等比例混合和按突變種類占比混合后質(zhì)粒文庫(kù)的檢測(cè)結(jié)果Tab 3 Results of plasmid library after the degenerate primers mixed with equal proportion or according to the proportion of mutation diversity

表4 EU編號(hào)233～240位點(diǎn)Fc組合突變文庫(kù)的Sanger測(cè)序結(jié)果Tab 4 Sanger sequencing results of Fc combined mutation plasmid library at 233-240 of EU numbering

2.4 高容量Fc組合突變細(xì)胞文庫(kù)的構(gòu)建

為了確保文庫(kù)中上萬(wàn)種突變能通過(guò)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒，而后感染3T3 細(xì)胞表達(dá)膜IgG，需要根據(jù)轉(zhuǎn)染效率來(lái)確定被轉(zhuǎn)染的Phoenix 細(xì)胞數(shù)量以及被感染的3T3 細(xì)胞數(shù)量。因此，本研究中，我們按照轉(zhuǎn)染/感染效率為40%，實(shí)際感染或感染細(xì)胞數(shù)為文庫(kù)的100 倍，轉(zhuǎn)染/感染時(shí)Phoenix 細(xì)胞/3T3 細(xì)胞融合度為50%，這3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)確定2 個(gè)15 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞數(shù)量即可滿足轉(zhuǎn)染/感染要求。

轉(zhuǎn)染Phoenix 細(xì)胞48 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Pheonix 細(xì)胞的包裝病毒時(shí)的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果（圖2A）顯示，與未轉(zhuǎn)染的Phoenix 細(xì)胞相比，Phoenix細(xì)胞突變文庫(kù)的GFP 表達(dá)水平為51.6%。反轉(zhuǎn)錄病毒感染3T3 細(xì)胞，48 h 后檢測(cè)3T3 細(xì)胞感染效率，結(jié)果（圖2B）顯示，約有47.4%的3T3 細(xì)胞有GFP 信號(hào)，提示細(xì)胞文庫(kù)初步構(gòu)建成功。

圖2 Phoenix細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（A）及3T3細(xì)胞的感染效率（B）Fig 2 Transfection efficiency in the Phoenix cells(A)and infection efficiency in the 3T3 cells(B)

2.5 高通量測(cè)序檢測(cè)Fc組合突變細(xì)胞文庫(kù)的質(zhì)量

取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取DNA，進(jìn)行高通量測(cè)序。結(jié)果（表5）表明，期望的組合突變?cè)趯?shí)際細(xì)胞文庫(kù)中可以檢測(cè)到9 898 種，占期望文庫(kù)的85.92%，只有14.08%的突變沒(méi)有被檢測(cè)到，成功構(gòu)建了包含大部分期望氨基酸組合突變的細(xì)胞文庫(kù)。

表5 Fc組合突變細(xì)胞文庫(kù)的高通量測(cè)序結(jié)果分析Tab 5 Analysis of high throughput sequencing results of Fc combined mutant cell library

3 討論

單抗藥物的研發(fā)技術(shù)和平臺(tái)日漸成熟，其中通過(guò)重組抗體的方式在體外進(jìn)行抗體文庫(kù)的構(gòu)建已經(jīng)成為單抗藥物研發(fā)的重要手段。為了能夠更加系統(tǒng)、全面地模擬自然突變的情況，需要設(shè)計(jì)高通量的抗體文庫(kù)。目前構(gòu)建抗體文庫(kù)的方法主要有定點(diǎn)突變、硅蛋白設(shè)計(jì)［6-7］、噬菌體展示和酵母展示技術(shù)［8-10］等。其中，定點(diǎn)突變和硅蛋白設(shè)計(jì)方法受通量和成本的限制［11-12］；而高通量噬菌體展示和酵母展示技術(shù)，前者無(wú)法進(jìn)行Fc 糖基化修飾，后者展示的糖蛋白包含高甘露糖，使得抗體在血清中會(huì)被很快清除［13-15］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)可以解決上述障礙，并可以在細(xì)胞表面展示具有正確折疊和翻譯后修飾的全人源化抗體［16］。本研究中，我們提供了一個(gè)基于單點(diǎn)突變文庫(kù)的篩選結(jié)果，分步構(gòu)建大容量多組合突變文庫(kù)的方法，用于哺乳動(dòng)物表面展示技術(shù)對(duì)Fc 變體的篩選。與前述方法相比，該技術(shù)有2 個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①所構(gòu)建的文庫(kù)大小可達(dá)到105，屬于高通量，便于后續(xù)篩選。②可進(jìn)行翻譯后糖基化修飾，是Fc 工程的理想平臺(tái)。利用這種方法，我們成功構(gòu)建了4.16×104多樣性的組合突變質(zhì)粒文庫(kù)及對(duì)應(yīng)細(xì)胞文庫(kù)。高通量測(cè)序分析這些文庫(kù)結(jié)果顯示實(shí)際文庫(kù)能夠覆蓋期望組合突變的99.58%（質(zhì)粒文庫(kù)）或85.92%（細(xì)胞文庫(kù)），為后續(xù)構(gòu)建更高容量突變文庫(kù)及高通量篩選Fc 組合突變變體打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

Fc工程改造增加對(duì)FcγRIIB的結(jié)合能力被認(rèn)為是一種有前景的方法?；贗gG1 的Fc 突變體V12（E233D/G237D/H268D/P271G/Y296D/A330R）［12］是目前已知的最大程度增強(qiáng)與FcγRIIB 的結(jié)合能力，且不增加與其他活化型FcγR 結(jié)合能力的Fc 變體。該研究在抗體鉸鏈下游區(qū)域和CH2 區(qū)域的約30 個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變建庫(kù)篩選，并且考慮了從Fc/FcγRIIB復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)優(yōu)化Fc 變體。其不足之處是V12 變體是通過(guò)定點(diǎn)突變方法發(fā)現(xiàn)的，受通量的限制，所有的變體數(shù)加起來(lái)不到1 000 個(gè)。與此相比，本研究有3 個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：①建庫(kù)分為2 步，首先在區(qū)域1 的7 個(gè)位點(diǎn)獲得與FcγRIIB 高親和力的氨基酸，然后基于這些氨基酸再進(jìn)行組合突變。在Fc 中與FcγRIIB 相結(jié)合的4 個(gè)區(qū)域內(nèi)，除了第3 個(gè)區(qū)域包含的氨基酸位點(diǎn)較少，其余的氨基酸個(gè)數(shù)為5～7個(gè)，如果要進(jìn)行組合突變文庫(kù)的構(gòu)建，直接用簡(jiǎn)并引物的方法構(gòu)建，每個(gè)位點(diǎn)包含20 種可能，所構(gòu)建的文庫(kù)容量將達(dá)到205～207。根據(jù)現(xiàn)有條件，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示法處理容量如此大的文庫(kù)有技術(shù)限制，而且后續(xù)的分選工作也難以進(jìn)行。因此，本研究先對(duì)單點(diǎn)突變文庫(kù)進(jìn)行了一輪篩選，獲得與FcγRIIB 高親和力的一些氨基酸，以這些與FcγRIIB 有結(jié)合優(yōu)勢(shì)的氨基酸突變?yōu)榛A(chǔ)，進(jìn)行組合突變時(shí)可縮小文庫(kù)的大小，使得后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建和分選更易進(jìn)行。②利用簡(jiǎn)并引物來(lái)構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，按照每條引物所包含突變多樣性占比混合引物制備的文庫(kù)更均一，實(shí)際文庫(kù)覆蓋期望文庫(kù)的比例更高，在質(zhì)粒文庫(kù)中能夠達(dá)到99%以上。同時(shí)，一代測(cè)序結(jié)果中，出現(xiàn)的突變個(gè)數(shù)的比例也正好符合實(shí)際文庫(kù)和期望文庫(kù)的比值。③效率高，成本低。設(shè)計(jì)包含11 520種突變的文庫(kù)，若每種組合突變合成1 條引物，則需要合成11 520 條引物，成本太高，而且操作起來(lái)極其困難。本研究?jī)H用32 條引物就可以通過(guò)PCR 產(chǎn)生上萬(wàn)種突變，每條引物能包括多種可能性，同時(shí)又盡可能降低了文庫(kù)的大小，既節(jié)省了成本，又大大降低了操作難度。

質(zhì)粒文庫(kù)準(zhǔn)備就緒之后，需要通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒感染3T3 細(xì)胞獲得細(xì)胞文庫(kù)。與對(duì)照相比，Phoenix 細(xì)胞包裝病毒的效率為51.6%，而3T3 細(xì)胞被感染的效率為47.4%，基本符合預(yù)期，初步提示文庫(kù)構(gòu)建成功。最后，再通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)細(xì)胞文庫(kù)的完整性，結(jié)果顯示，85.92%的突變包含在細(xì)胞文庫(kù)中，未檢測(cè)到的突變?cè)蛴锌赡苁且驗(yàn)楦咄繙y(cè)序所使用的模板不能夠完全覆蓋我們所制備的細(xì)胞文庫(kù)導(dǎo)致的。不過(guò)上述質(zhì)粒文庫(kù)和細(xì)胞文庫(kù)的高通量測(cè)序結(jié)果也顯示我們構(gòu)建了高質(zhì)量的抗體Fc 組合突變文庫(kù)。這說(shuō)明本研究的設(shè)計(jì)可以為抗體文庫(kù)的構(gòu)建提供一種較好的方法思路。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一個(gè)包含41 600種IgG-Fc變體的組合突變膜抗體庫(kù)。通過(guò)簡(jiǎn)并引物獲得質(zhì)粒文庫(kù)，成本低且易操作，為構(gòu)建細(xì)胞文庫(kù)提供了基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)獲得的抗體庫(kù)，具有可展示全長(zhǎng)抗體、高通量、可進(jìn)行糖基化修飾等優(yōu)點(diǎn)，因而展示的抗體在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。在進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者病毒感染的過(guò)程中，較難保證只有1 種外源DNA 進(jìn)入單個(gè)細(xì)胞。不過(guò)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)將被感染成功的細(xì)胞數(shù)設(shè)定在實(shí)際文庫(kù)大小的100 倍左右，保證了只有多次進(jìn)入細(xì)胞并且編碼高親和力Fc 突變序列才會(huì)被篩選出來(lái)，盡量減少篩選結(jié)果的隨機(jī)性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)具有很大的優(yōu)勢(shì)與開(kāi)發(fā)潛力，本研究中所討論的建庫(kù)方法適用于所有類型的蛋白，并不局限于IgG，還可用于單鏈可變區(qū)片段（ScFv）［17］、病毒膜蛋白［18］等。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院已申請(qǐng)專利“FcγRIIB 親和力增強(qiáng)的抗體Fc區(qū)”（PCT/CN2020/133685，待審），發(fā)明人為李福彬、張燕、張咪、畢艷俠、田世豪、張慧慧和柳淑君。所有作者聲明不存在其他利益沖突。

A patent application titled “Antibody Fc region having enhanced FcγRIIB affinity” has been filed by Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （PCT/CN2020/133685， pending）， and the listed inventors are LI Fubin， ZHANG Yan， ZHANG Mi， BI Yanxia， TIAN Shihao， ZHANG Huihui， and LIU Shujun.All the authors disclose no other relevant conflicts of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

李福彬、張燕參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；張燕、張咪參與了實(shí)驗(yàn)操作；張燕、張咪和柳淑君參與了數(shù)據(jù)分析；張咪、張燕和李福彬參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LI Fubin and ZHANG Yan. The experiments were performed by ZHANG Yan and ZHANG Mi. The results were analyzed by ZHANG Yan， ZHANG Mi and LIU Shujun.The manuscript was drafted and revised by ZHANG Mi， ZHANG Yan and LI Fubin. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-01

·Accepted：2022-04-25

·Published online：2022-04-28