龔其雨，陳 磊

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。CRC 的治療以手術(shù)根治為基礎(chǔ)，輔以化學(xué)治療，但仍有近半數(shù)患者受困于腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而無(wú)有效的治療手段。CRC 的發(fā)生是一個(gè)涉及多種癌基因多階段的突變積累的過(guò)程，同時(shí)，腫瘤所處的免疫微環(huán)境亦起著重要的調(diào)控作用［1］。免疫系統(tǒng)因重要的疾病防御與監(jiān)測(cè)功能，近年來(lái)一直占據(jù)腫瘤治療的熱點(diǎn)，為CRC 的治療開(kāi)辟了新的方向［2-3］。在過(guò)去10年，腫瘤免疫療法的臨床應(yīng)用帶來(lái)振奮人心的成效，但也隨著腫瘤內(nèi)及腫瘤間的異質(zhì)性而帶來(lái)一系列問(wèn)題。以免疫檢查點(diǎn)阻滯法（immune checkpoint blockade，ICB）治療為例，程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）阻斷劑在錯(cuò)配修復(fù)缺陷與高微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability high，MSI-H）的轉(zhuǎn)移性CRC 患者中顯示出可觀療效，其呈現(xiàn)高水平的腫瘤突變負(fù)荷和免疫浸潤(rùn)。相比之下，錯(cuò)配修復(fù)和微衛(wèi)星穩(wěn)定的CRC 患者則對(duì)ICB治療無(wú)應(yīng)答，其低水平的腫瘤突變負(fù)荷和免疫浸潤(rùn)成為治療抵抗的重要原因［3-5］。因此，免疫微環(huán)境在很大程度上決定著CRC 的治療難度和患者的生存預(yù)后。長(zhǎng)期以來(lái)，以T 細(xì)胞為主導(dǎo)，輔以樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、巨噬細(xì)胞等抗原提呈的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)長(zhǎng)期占據(jù)免疫療法的主流研究方向［6］。然而，B 細(xì)胞這類同時(shí)兼?zhèn)淇乖岢始暗钟愇锏亩喙δ苄约?xì)胞，在腫瘤微環(huán)境，尤其在CRC 的作用卻缺乏足夠的研究。

隨著近年的深入研究，B 細(xì)胞在腫瘤免疫微環(huán)境中的多樣化作用逐步得到人們的重視。B 細(xì)胞是多種細(xì)胞因子和趨化因子的來(lái)源，有重要的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)作用，包括引導(dǎo)淋巴組織的發(fā)育，塑造和促進(jìn)效應(yīng)和記憶T 細(xì)胞反應(yīng)［7-8］，還可通過(guò)產(chǎn)生LTα1β2 而獨(dú)立于淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)三級(jí)淋巴組織形成（tertiary lymphoid structure，TLS）［9-12］。此外，B 細(xì)胞可產(chǎn)生白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10 和IL-35負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［7］。B細(xì)胞和漿細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制支持抗腫瘤免疫反應(yīng)。近年來(lái)有研究［13-15］顯示，腫瘤組織浸潤(rùn)B 細(xì)胞以及腫瘤引流淋巴結(jié)中的B 細(xì)胞（tumor infiltrating B cells，TIB）和漿細(xì)胞在機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中具有重要作用。一項(xiàng)關(guān)于CRC 浸潤(rùn)性B 細(xì)胞的研究［16］表明，CD20+B 細(xì)胞對(duì)CRC 的進(jìn)展具有良好的預(yù)后價(jià)值，并證明CD20+B 細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間具有顯著的相關(guān)性。

本研究基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和抗體庫(kù)數(shù)據(jù)的分析，探究B細(xì)胞亞型在結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境及腫瘤進(jìn)展中的作用，比較腫瘤與癌旁浸潤(rùn)性B細(xì)胞亞群組成的差異，研究潛在的分子驅(qū)動(dòng)機(jī)制，分析B細(xì)胞與微環(huán)境中免疫細(xì)胞的互作關(guān)系的變化，尋找可能的調(diào)控途徑以促進(jìn)B 細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，以期為CRC 的腫瘤免疫治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣本采集并制備懸液進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序

收集來(lái)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化科3例患者（均為Ⅰ期/Ⅱ期結(jié)直腸癌患者）的手術(shù)樣本，均無(wú)藥物治療。在告知采樣標(biāo)準(zhǔn)后，在相同環(huán)境條件下收集每位患者的腫瘤、癌旁正常組織以及外周血樣本，共9 份。新鮮組織樣本經(jīng)消化后制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)流式分選得到CD45+細(xì)胞。血液樣本經(jīng)去紅處理后得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。經(jīng)質(zhì)控后，采用10X Genomics 技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組和VDJ 文庫(kù)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)拼裝比對(duì)基因組后得到轉(zhuǎn)錄組和B細(xì)胞抗原受體庫(kù)（B cell receptor repertoire，BCR）數(shù)據(jù)。

1.2 構(gòu)建結(jié)直腸癌浸潤(rùn)及循環(huán)B 細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組圖譜

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的初步分析主要使用Seurat 4.0 軟件包來(lái)完成。首先按照標(biāo)準(zhǔn)化流程處理單個(gè)樣本，包含以下步驟：質(zhì)控（表達(dá)基因數(shù)小于200 和大于8 000的細(xì)胞剔除，在少于10 個(gè)細(xì)胞表達(dá)的基因剔除）、按測(cè)序深度進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、log 轉(zhuǎn)化、尋找高變基因（2 000 個(gè)）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、K-means 無(wú)監(jiān)督聚類分群，最后用統(tǒng) 一 流 形 逼 近 與 投 影 （uniform manifold approximation and projection，UMAP）實(shí)現(xiàn)可視化。

根據(jù)文獻(xiàn)［17］及實(shí)驗(yàn)提供的標(biāo)記基因分群，將免疫細(xì)胞分為以下幾群：①T/NK 細(xì)胞，標(biāo)記基因?yàn)镃D3 delta subunit of T-cell receptor complex（CD3D）、granulysin （GNLY） 和 natural killer cell granule protein 7（NKG7）。②B 細(xì)胞和漿細(xì)胞，標(biāo)記基因?yàn)镃D79a molecule （CD79A）、membrane spanning 4-domains A1（MS4A1）、PR/SET domain 1（PRDM1）和syndecan 1（SDC1）。③髓系細(xì)胞，標(biāo)記基因?yàn)閕nterleukin 1β （IL1B）、S100 calcium binding protein A8（S100A8）和cystatin C（CST3）。使用Harmony 3.4 軟件包去除批次效應(yīng)后整合所有樣本，按上述標(biāo)準(zhǔn)化流程處理后，篩選出包含漿細(xì)胞在內(nèi)的所有B細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞名稱匹配好BCR 數(shù)據(jù)，按標(biāo)準(zhǔn)化流程處理后重新聚類分群，依據(jù)文獻(xiàn)參考標(biāo)記基因分亞群，計(jì)算各亞群的在各樣本的比例。同時(shí)將T/NK 細(xì)胞和髓系細(xì)胞群按照上述流程進(jìn)行聚類分群，結(jié)果供細(xì)胞通信分析使用。

1.3 B 細(xì)胞各亞群在正常與腫瘤組織的差異基因和通路富集分析

使用MAST 1.20包計(jì)算B細(xì)胞各亞群在腫瘤與癌旁正常組織樣本的差異基因，選擇|log2（fold change）|（|log2（FC）|）大于2，校正后的P值小于0.001 的基因，分別挑選出上調(diào)和下調(diào)的差異基因，使用clusterProfiler 3.14 包對(duì)每個(gè)亞群進(jìn)行差異基因的通路富集分析，按照校正后的P值從小到大排序，在上調(diào)和下調(diào)的通路中分別選取前10的通路進(jìn)行生物分析。

1.4 基于TCGA-COAD 數(shù)據(jù)驗(yàn)證B 細(xì)胞各亞群在腫瘤與正常樣本的變化

考慮到患者樣本數(shù)據(jù)量過(guò)少的原因，為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們應(yīng)用CIBERSORTx 1.0 解卷積的方法，將B細(xì)胞各亞群的基因表達(dá)譜映射到癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的結(jié)腸癌數(shù)據(jù)（Colon adenocarcinoma，COAD）中進(jìn)行分析，計(jì)算各樣本中B細(xì)胞亞群的特征基因組成得分，比較其在腫瘤和正常組織中的變化情況。同時(shí)依據(jù)患者的疾病進(jìn)展信息，分析各個(gè)亞群在患者腫瘤進(jìn)展中的差異變化。

1.5 B細(xì)胞亞群與免疫細(xì)胞的互作關(guān)系分析

將T/NK 細(xì)胞以及髓系細(xì)胞挑選出進(jìn)行重新聚類分群后，使用cellphoneDB v3.0 細(xì)胞通信軟件計(jì)算細(xì)胞亞群間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分子對(duì)，選擇校正后P值小于0.05的分子對(duì)進(jìn)行分析，重點(diǎn)關(guān)注生發(fā)中心B細(xì)胞（germinal center B cells，GCB），找出重要調(diào)控分子并分析其在免疫微環(huán)境的作用。

1.6 B細(xì)胞VDJ組庫(kù)數(shù)據(jù)分析

以患者為單位，計(jì)算B 細(xì)胞各亞群的克隆指數(shù)，并評(píng)估遷移性［18］，使用配對(duì)t檢驗(yàn)比較組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？寺⌒栽u(píng)估指數(shù)如下：

其中，m代表在亞群C1 和C2 共有的克隆型種數(shù)；ni-C代表在亞群C 中克隆型i所含的細(xì)胞數(shù)；N代表單個(gè)樣本中每個(gè)細(xì)胞亞群的細(xì)胞總數(shù)。

1.7 B細(xì)胞抗原受體重鏈和輕鏈的突變水平分析

使用工具pRESTO v0.70 進(jìn)行BCR 的突變水平分析，進(jìn)行以下質(zhì)控：去除引物無(wú)法識(shí)別或比對(duì)得分差的序列閱讀，保留在單樣本至少出現(xiàn)2 次的序列；使用國(guó)際免疫基因數(shù)據(jù)庫(kù)（ImMunoGeneTics，IMGT）作為參考；除去非功能性序列并除去超過(guò)30 個(gè)突變的序列；選擇對(duì)稱加權(quán)的核苷酸點(diǎn)突變數(shù)作為突變位點(diǎn)數(shù)。以每群B細(xì)胞的突變位點(diǎn)數(shù)的平均值代表該細(xì)胞群的突變水平，比較其在腫瘤和正常組織中的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 軟件包states v0.3.1 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料包括細(xì)胞組成比例、克隆擴(kuò)增指數(shù)及B 細(xì)胞重鏈突變位點(diǎn)數(shù)等，以±s形式表示。在腫瘤、正常和血液樣本中，細(xì)胞群組成比例的差異比較使用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)；在TCGA-COAD 的驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中，腫瘤和正常組織的亞群組成比例差異使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來(lái)分析；腫瘤和正常組織中的B 細(xì)胞克隆擴(kuò)增指數(shù)的差異分析使用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)；在B細(xì)胞重鏈突變水平的分析中，樣本間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞全局及B細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)錄組圖譜

我們整合了未經(jīng)治療的結(jié)直腸癌患者共9 份樣本的CD45+免疫細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)量控制及批次矯正整合后分群標(biāo)注，共得到35 619 個(gè)細(xì)胞，包含18 246 個(gè)T/NK細(xì)胞、14 244 個(gè)B 細(xì)胞和漿細(xì)胞及3 129 個(gè)髓系細(xì)胞（圖1A），標(biāo)記基因如圖1B 所示。從細(xì)胞在3 種組織的組成比例圖可以看出（圖1C），T/NK 細(xì)胞在腫瘤樣本中普遍上升，而B(niǎo)細(xì)胞，尤其是漿細(xì)胞卻普遍減少，初步反映漿細(xì)胞在CRC 免疫微環(huán)境中的作用有減弱趨勢(shì)。接下來(lái)將所有B 細(xì)胞及漿細(xì)胞分選出來(lái)，并結(jié)合8 804 個(gè)BCR 陽(yáng)性細(xì)胞輔助分選（圖1D），進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 免疫細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄組圖譜Fig 1 Transcriptome map of main immune cells

我們對(duì)14 244 個(gè)B 細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)化流程處理后重新聚類分群，得到如下13 個(gè)細(xì)胞亞群：GCB、濾泡B 淋巴細(xì)胞（follicular B cell，F(xiàn)oB）、未轉(zhuǎn)化的記憶B 細(xì)胞（non-switched memory B cell，nsMemB）、轉(zhuǎn)化 的 記 憶 B 細(xì) 胞 （switched memory B cell，sMemB）、 高表達(dá)熱休克蛋白的記憶B 細(xì)胞（sMemB-HSP）、高表達(dá)免疫球蛋白IgA 的記憶B 細(xì)胞（sMemB-IgA）、調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞（regulatory B cell，Breg）、漿母細(xì)胞（plasmablast，PB），以及表達(dá)各類免疫球蛋白亞型的漿細(xì)胞（plasma cell，PC），如PC-IGHM、PC-IGHA1、PC-IGHA2、PCIGHA1/2、PC-IGHG1 等。標(biāo)記基因如圖2A、2B 所示。B 細(xì)胞各亞群在3 種組織樣本中展現(xiàn)出不同的浸潤(rùn)模式（圖2C）。相較于正常組織，腫瘤樣本中有較多的CD20+B 細(xì)胞浸潤(rùn)， 表現(xiàn)在GCB、nsMemB、sMemB 和sMemB-HSP 顯著上升（P值分別為0.023、0.002、0.002、0.031），而漿細(xì)胞主要以表達(dá)IGHM 和IGHA 類（包含PC-IGHA1 和PCIGHA2 這2 類）免疫球蛋白的漿細(xì)胞比例顯著下降（P值分別為0.021、0.000）。結(jié)果表明CD20+B 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中作用顯著提升，相反，漿細(xì)胞（尤其是表達(dá)免疫球蛋白IgA 類型的）呈顯著下降趨勢(shì)，表明漿細(xì)胞在微環(huán)境中的作用大幅削弱。此外，外周血樣本的組成中以記憶B 細(xì)胞為主，尤其是未經(jīng)轉(zhuǎn)化的B 細(xì)胞，表明記憶B 細(xì)胞是循環(huán)性B 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的主力軍。

圖2 B細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)錄組圖譜Fig 2 Atlas of B cell subclusters in CRC

2.2 基于TCGA-COAD 數(shù)據(jù)驗(yàn)證B 細(xì)胞各亞群在腫瘤與正常組織的差異

我們將B 細(xì)胞亞群的單細(xì)胞表達(dá)圖譜映射到TCGA 的COAD 數(shù)據(jù)中，計(jì)算B 細(xì)胞亞群的組成得分。如圖3A 所示，GCB 在腫瘤顯著上升，轉(zhuǎn)化后的記憶B 細(xì)胞均顯著上升，這與單細(xì)胞的分析結(jié)果一致。同時(shí)，表達(dá)IGHA1/2 和IGHG1 類漿細(xì)胞顯著下降，進(jìn)一步印證了漿細(xì)胞在微環(huán)境中作用受到限制。有背景研究報(bào)道，IGHG1 類漿細(xì)胞是微環(huán)境中腫瘤特異性抗體的主要分泌細(xì)胞，且可通過(guò)NK 細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬作用來(lái)行使抗腫瘤作用。由此推測(cè)，漿細(xì)胞的抗腫瘤作用受到抑制。GCB 是免疫微環(huán)境中記憶B 細(xì)胞和漿細(xì)胞的生成來(lái)源，我們考慮GCB在腫瘤免疫微環(huán)境中的發(fā)育狀態(tài)是否有所改變，接下來(lái)對(duì)GCB在微環(huán)境中的變化進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注。

考慮到我們的樣本均來(lái)自早期CRC患者，于是我們結(jié)合TCGA患者的病程信息來(lái)分析GCB的變化。如圖3B所示，隨著疾病惡化，在Ⅰ～Ⅲ期，GCB得分逐漸下降，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.003、0.024），提示腫瘤的發(fā)展過(guò)程中GCB的功能逐步被抑制。在Ⅳ期，雖然GCB特征呈上升趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為進(jìn)一步探究GCB 在腫瘤微環(huán)境的驅(qū)動(dòng)下發(fā)生了何種變化，我們對(duì)腫瘤樣本中GCB 的差異基因做了通路富集分析。結(jié)果如圖3C 所示，GCB 在腫瘤中的抗原提呈功能顯著上升，有利地支持了T細(xì)胞的激活和增殖，同時(shí)自身也在進(jìn)行有效的VDJ 重排以提高特定抗原親和力的趨勢(shì)，具有積極的抗腫瘤效應(yīng)。而在下調(diào)通路中，我們也發(fā)現(xiàn)與分泌抗體相關(guān)的通路顯著下調(diào)，這提示我們漿細(xì)胞減少的一大原因是否由GCB轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)減少所致。

圖3 TCGA-COAD數(shù)據(jù)分析B細(xì)胞亞群在腫瘤與正常組織的組成差異Fig 3 Composition of B cell subsets in tumor and normal tissues by TCGA-COAD data profiling

2.3 GCB與T細(xì)胞和髓系細(xì)胞的通信分子對(duì)

在上述的研究中，我們發(fā)現(xiàn)GCB 可能在CRC 的免疫微環(huán)境中發(fā)揮著積極的作用。為探究外部環(huán)境的影響因素，我們進(jìn)行了細(xì)胞通信分析。圖4A 所示，為T 細(xì)胞與GCB 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通信分子對(duì)?？梢钥闯鲈谀[瘤樣本中，具有抑制T細(xì)胞功能的分子對(duì)顯著下降，如CD160-TNFRSF14、LTATNFRSF1B、CCL4-CNR2，這對(duì)于促進(jìn)T細(xì)胞的殺傷腫瘤作用是有積極意義的［19］。此外，在腫瘤中上升的信號(hào)還包括促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞激活與發(fā)育的分子對(duì)，如CD27-CD70、CXCL13-CXCR5［20-21］。然而，也存在一些微弱的抑制性信號(hào)在腫瘤中增強(qiáng)，如LGALS9-CD44，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道具有促進(jìn)并穩(wěn)定調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）發(fā)育的作用，以及CD52-SIGLEC10 抑制T 細(xì)胞的功能［22］。這提示我們GCB 在生發(fā)中心的功能是多面的，但以促進(jìn)和激活T 細(xì)胞的抗腫瘤作用為主?；蛟S針對(duì)GCB 采取措施，特異性激活并提高T細(xì)胞功能的信號(hào)，抑制其與Treg或耗竭T 細(xì)胞的聯(lián)系，可以有效促進(jìn)免疫微環(huán)境整體的抗腫瘤作用。而在髓系細(xì)胞，B 細(xì)胞亞群與之通信的情況在腫瘤和正常組織中變化較小。值得關(guān)注的是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族信號(hào)在腫瘤中上調(diào)，表明GCB 細(xì)胞在微環(huán)境中有微弱促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能的作用（圖4B）?？傊?，B細(xì)胞在CRC免疫微環(huán)境中展示的總體作用是促進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)的信號(hào)。

圖4 B細(xì)胞亞群與T細(xì)胞亞群及髓系細(xì)胞亞群的通信分子對(duì)Fig 4 Interecting pairs between B cell subsets with T cells and myeloid cells

2.4 B細(xì)胞各亞群的抗原受體庫(kù)分析

圖5A所示，為B細(xì)胞各亞群在3種組織樣本的克隆擴(kuò)增情況?？傮w比較，B 細(xì)胞在正常與腫瘤組織中的克隆指數(shù)較PBMC較低，而腫瘤樣本與正常組織相比，大部分B 細(xì)胞亞群的克隆指數(shù)均較低，但GCB與PB 這2 個(gè)亞群在腫瘤中均上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），提示它們可能在免疫微環(huán)境中受到抗原刺激后積極增殖（圖5B、5C）。這對(duì)于B細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)是積極有利的。同時(shí)GCB 的B 細(xì)胞受體重鏈在腫瘤中的突變頻率也高于正常組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），這提示GCB 突變水平在提高，進(jìn)而有力地提升與腫瘤抗原的親和力。

圖5 B細(xì)胞各亞群的克隆擴(kuò)增情況及GCB在組織的突變水平比較Fig 5 Clonal expansion index of B cell subsets and mutation level of GCB

各亞群間的遷移指數(shù)如圖6，顯示出與轉(zhuǎn)錄組一致的分析結(jié)果。在正常組織中，CD20+各亞群間的轉(zhuǎn)化指數(shù)均較低，GCB 也主要與漿母細(xì)胞共享較多的克隆型。而在腫瘤中，GCB與表達(dá)IgA類免疫球蛋白的記憶B 細(xì)胞有較多的共享克隆型，再次證明GCB在腫瘤中更朝向記憶B細(xì)胞發(fā)展。

圖6 B細(xì)胞各亞群在正常(A)、腫瘤(B)和外周血(C)組織中的克隆型遷移指數(shù)比較Fig 6 Transition index of B cell subsets among normal(A),tunor(B)and PBCM(C)sample

3 討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析的方法，基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)，對(duì)結(jié)直腸癌浸潤(rùn)和循環(huán)性B細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)CD20+B 細(xì)胞在腫瘤組織中顯著上升，以GCB 作用最顯著；以通路分析、通信分析以及VDJ 組庫(kù)數(shù)據(jù)分析闡釋了GCB 的積極作用，發(fā)現(xiàn)它在微環(huán)境中具有積極的抗腫瘤效應(yīng)，一方面對(duì)T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)起到了有力的支持作用，另一方面腫瘤組織中的GCB 自身也在進(jìn)行高水平的BCR 重鏈突變，以適應(yīng)腫瘤抗原進(jìn)行高親和力的演變。與之相反的是漿細(xì)胞在腫瘤中的作用大幅減少，以表達(dá)IgA 類的漿細(xì)胞為主，同時(shí)GCB 向漿細(xì)胞的演化發(fā)展在腫瘤組織中逐漸降低，取而代之的是逐步向記憶B 細(xì)胞方向的發(fā)展?？傊珺 細(xì)胞在結(jié)直腸癌的腫瘤免疫微環(huán)境中亦發(fā)揮重要作用，它不是簡(jiǎn)單的旁觀者細(xì)胞，而是從根本上協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)的積極參與者。

通過(guò)從B 細(xì)胞亞群在3 種組織中不同浸潤(rùn)模式研究中確定的CD20+B 重要性， 表現(xiàn)為GCB、nsMemB、sMemB 和sMemB-HSP 的顯著上升，同時(shí)表達(dá)IGHM 和IGHA 類免疫球蛋白的漿細(xì)胞顯著下降。這提示我們思考B 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生轉(zhuǎn)變的原因，我們選擇記憶B 細(xì)胞和漿細(xì)胞兩者共同的來(lái)源——GCB 進(jìn)行探究。通過(guò)將單細(xì)胞數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄圖譜映射到TCGA-COAD 的數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)GCB 在腫瘤組織中亦是顯著上升的，并且隨著腫瘤的進(jìn)展，GCB 的組成比例逐漸下降，我們猜測(cè)可能是由于GCB 在腫瘤發(fā)展中功能受到了抑制。經(jīng)由通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)GCB 在腫瘤中的抗原提呈功能顯著上升，有利地支持了T 細(xì)胞的激活和增殖，同時(shí)自身也在進(jìn)行有效的VDJ 重排以提高特定抗原親和力的趨勢(shì)，具有積極的抗腫瘤效應(yīng)。而在下調(diào)通路中，我們也發(fā)現(xiàn)與分泌抗體相關(guān)的通路顯著下調(diào)，這提示我們漿細(xì)胞減少的一大原因或許是由GCB 轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)減少所致。為了進(jìn)一步探究微環(huán)境對(duì)GCB 細(xì)胞自身功能的影響，我們通過(guò)細(xì)胞互作分子對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，具有抑制T 細(xì)胞功能的分子對(duì)顯著下降，同時(shí)促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞激活與發(fā)育的分子對(duì)也顯著上調(diào)，展示了GCB 細(xì)胞在CRC 免疫微環(huán)境中對(duì)T 細(xì)胞抗腫瘤作用的積極支持。在GCB 與髓系細(xì)胞的通信分析中，TNF 的信號(hào)增強(qiáng)提示GCB 細(xì)胞對(duì)于巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的潛在支持作用。綜合來(lái)看，我們認(rèn)為在早期的腫瘤微環(huán)境中，GCB 細(xì)胞通過(guò)間接的正向支持作用從而發(fā)揮積極的抗腫瘤效應(yīng)。最后，我們通過(guò)VDJ 組庫(kù)數(shù)據(jù)探討上述分析結(jié)果，從克隆指數(shù)和遷移指數(shù)兩方面評(píng)估，發(fā)現(xiàn)GCB在腫瘤組織中顯著克隆擴(kuò)增，同時(shí)發(fā)生高水平的重鏈突變，這反映了GCB 擴(kuò)增并提高腫瘤抗原親和力的趨勢(shì)。從亞群間的遷移分析，我們發(fā)現(xiàn)GCB 在腫瘤組織中更朝向記憶B 細(xì)胞的方向發(fā)展。然而，究竟記憶B 細(xì)胞在結(jié)直腸癌的腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮了什么樣的作用，在未來(lái)的工作中，仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的探索分析。

綜上，對(duì)結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境中的B細(xì)胞有了初步探索。CD20+B 細(xì)胞在腫瘤組織中顯著上升，以GCB 作用最顯著，通過(guò)自身體細(xì)胞高頻突變以及和周圍免疫細(xì)胞的聯(lián)系，發(fā)揮積極的抗腫瘤效應(yīng)。提升GCB 細(xì)胞的功能或許是未來(lái)免疫治療的一大方向，可為提升腫瘤的治療效果提供新思路。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

龔其雨、陳磊參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；龔其雨、陳磊參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by GONG Qiyu and CHEN Lei.The manuscript was drafted and revised by GONG Qiyu and CHEN Lei.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-11-18

·Accepted：2022-03-28

·Published online：2022-04-28