李振興，張曉林，宋瑩，丁曉紅，路立峰，單雪梅，郭珊珊，李景云

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264210）

澤漆（Euphorbia helioscopia L.）是大戟科大戟屬一年生或兩年生草本植物，味辛、苦，性微寒，4~5 月開花時(shí)采收，全草曬干后入藥，具有行水、消痰、殺蟲及解毒功效，用于治療水氣腫滿、痰飲喘咳、痢疾、菌痢、瘰疬、癬瘡，結(jié)核性瘺管和骨髓炎[1]。目前對澤漆的研究主要集中在化學(xué)成分及藥理作用研究[2-6]，對澤漆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少。本文對澤漆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，并對不同產(chǎn)地的澤漆進(jìn)行測定，測定方法進(jìn)行方法學(xué)研究，旨在建立準(zhǔn)確可靠的質(zhì)量研究方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與材料

LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津）；LE204E 電子天平（日本ANG）；DRHH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-400KED 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZXRD-B5210 鼓風(fēng)干燥箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，批號100081-201610）；甲醇為色譜純（MERCK）；水為超純水；其余試劑均為分析純；澤漆10 批藥材采自山東、江蘇及安徽等地（見表1），經(jīng)山東藥品食品職業(yè)學(xué)院路立峰副教授鑒定為澤漆，藥材現(xiàn)保存于山東藥品食品職業(yè)學(xué)院標(biāo)本館。

2 方法與結(jié)果

2.1 澤漆鑒別

2.1.1 顯微鑒別 本品粉末顯黃綠色。置顯微鏡下觀察：花粉粒亮黃色，類圓形，直徑15~30m，壁較厚，表面有顆粒狀的雕紋，有萌發(fā)孔3 個(gè)，見圖1-h 和1-i。纖維眾多，多成束，稀有單個(gè)散在，木化，有的具單紋孔，見圖1-a 和1-b。螺紋導(dǎo)管多見，直徑15~40m，見圖1-c。葉表皮細(xì)胞垂周壁念珠狀增厚或深波狀彎曲，見圖1-d 和1-e。薄壁細(xì)胞類圓形或類長圓形，有較大細(xì)胞間隙，有的細(xì)胞內(nèi)含淡黃棕色顆粒狀物，見圖1-f。木栓細(xì)胞淡棕色或黃棕色，表面觀多角形，壁稍厚，栓化，見圖1-g。

圖1 澤漆顯微鑒別圖Fig.1 Microscopic identification of Euphorbia helioscopia L.

2.1.2 薄層色譜鑒別 供試品溶液的制備：取本品粉末1.0 g，加80% 甲醇50 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使之溶解，用乙醚振搖提取2 次，每次10 mL，棄去乙醚液，水液加稀鹽酸10 mL，置90 ℃水浴鍋中加熱1 h，取出，迅速冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，用水30 mL洗滌，棄去水液，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使之溶解，作為供試品溶液。點(diǎn)樣1L。

對照品溶液的制備：取槲皮素對照品（中檢院提供，批號100081-201610），加甲醇制成每1mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。點(diǎn)樣2L。

薄層板：青島海洋化工廠生產(chǎn)的預(yù)制硅膠H 薄層板，厚度0.20~0.25 mm，批號為20191130。

展開劑：甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10:8:1）。

展開條件：溫度25 ℃相對濕度70%。

顯色：3%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃加熱數(shù)分鐘。

檢視：紫外光燈（365 nm）。

結(jié)果：供試品色譜中，10 批澤漆均與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，故收入正文。見圖2。

圖2 澤漆藥材的TLC 鑒別圖譜Fig.2 TLC chromatograms of 10 batches of Euphorbia helioscopia L.

2.2 檢查

按照《中國藥典》2020 年版水分測定法（烘干法，通則0832）、灰分測定法（通則2302）和浸出物測定法（熱浸法、冷浸法，通則2201）對10 批澤漆藥材進(jìn)行測定，每批樣品平行操作2 份，見表1。

表1 10 批樣品檢查項(xiàng)測定（n=2）Table 1 Loss on drying,total ash,acid-insoluble ash and ethanol-soluble extractives of 10 batches of Euphorbia helioscopia L.(n=2)

2.3 澤漆的含量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.2% 磷酸溶液（50:50）為流動相，檢測波長371 nm，柱溫40 ℃，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算不得低于5 000，分離度不小于1.5。

2.3.2 對照品溶液制備 取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含槲皮素40g 的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過3 號篩）0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液（4:1）50 mL，密塞，稱定重量，置于85 ℃水浴鍋中加熱回流30 min，立即冷卻，再稱定重量，用甲醇-25% 鹽酸溶液（4:1）補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 空白溶劑 甲醇-25%鹽酸溶液（4:1）。

圖3 系統(tǒng)適應(yīng)性圖譜Fig.3 Spectra of the system adaptability

2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取槲皮素對照品溶液（濃度為85.226g/mL）精密吸取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為線性溶液，取線性溶液10L 注入液相色譜儀，分別測定峰面積。以槲皮素對照品的進(jìn)樣量（g）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=4 574 489.17x+4 505.48，R2=0.999 9。結(jié)果表明，槲皮素在0.085 226~0.852 26g 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，結(jié)果槲皮素峰面積的RSD 為0.16%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品（批號：澤漆-濟(jì)寧）按照2.3.3 方法制備供試品溶液，共6 份，按上述色譜條件測定，結(jié)果槲皮素的平均含量為0.483 4 mg/g，RSD為0.99%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 中間精密度 由實(shí)驗(yàn)人員B 取澤漆-濟(jì)寧（批號：澤漆-濟(jì)寧）供試品按照2.3.3 供試品制備方法制備供試品溶液，共6 份，按上述色譜條件測定，結(jié)果槲皮素的平均含量為0.480 7 mg/g，RSD為1.01%（n=12），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號：澤漆-濟(jì)寧），分別于制備后的0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h按上述色譜條件測定，測得槲皮素峰面積的RSD 為1.02%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h 穩(wěn)定。

2.3.11 加樣回收試驗(yàn) 精密量取槲皮素對照品1.0mL（濃度為1.117 8 mg/mL）6 份，分別置于6 個(gè)250 mL具塞錐形瓶中，吹干，取已測知含量的澤漆樣品（批號為210 420，水分為8.39%，槲皮素含量為0.490 2%）約0.25 g，精密稱定，共取6 份，按照2.3.3 方法制備供試品溶液。依法測定，計(jì)算回收率。槲皮素的平均加樣回收率為99.28%，RSD為0.79%（n=6），結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of recovery tests (n=6)

2.3.12 樣品的測定 取收集的10 批樣品，按照2.3.3方法制備供試品溶液。依法測定，按外標(biāo)法計(jì)算槲皮素的含量，結(jié)果見表2。

表3 不同產(chǎn)地澤漆含量測定結(jié)果Table 3 The results of content from different origins

3 討論

3.1 澤漆的鑒別參考《江蘇省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2016年版“澤漆”項(xiàng)下選用槲皮素作為指標(biāo)性成分[7]。通過對槲皮素對照品溶液進(jìn)行紫外-可見分光光度法掃描確定檢測波長為371 nm。

3.2 通過查閱文獻(xiàn)[8-11]，研究中考察流動相甲醇-0.2%磷酸溶液（47:53）及甲醇-0.2%磷酸溶液（50:50），兩者均滿足分離條件，由于第2 種流動相保留時(shí)間更短，故采用第2 種流動相。

3.3 依據(jù)文獻(xiàn)[12-15]測量指標(biāo)特點(diǎn)，在供試品溶液制備時(shí)考察了不同的提取溶劑[甲醇-18%鹽酸溶液（4:1），甲醇-25% 鹽酸溶液（4:1），甲醇-36%鹽酸溶液（4:1）]、不同提取方法（超聲，回流）、不同提取時(shí)間（30 min、60 min和90min）、不同提取溫度（85℃、90℃和95℃），研究表明在甲醇-25%鹽酸溶液（4:1）溶劑下提取時(shí)間超過30 min槲皮素含量會下降，回流提取效果比超聲提取好，回流溫度對提取影響不大，綜合考慮節(jié)能環(huán)保等，選取甲醇-25%鹽酸溶液（4:1）50mL 的溶劑85 ℃水浴回流30 min 作為提取條件。

3.4 本文對不同產(chǎn)地10 批澤漆的槲皮素含量測定表明，個(gè)體差異較大，一是由于本品是草本植物，全草用藥，在采收干燥和運(yùn)輸過程中葉、莖、根比例不一致，二是可能與各產(chǎn)地生長氣候條件有關(guān)，因采集時(shí)間集中，生長時(shí)間對含量影響較小。

3.5 參照《中國藥典》2020 年版四部通則[16]分別測定10 批樣品水分、總灰分、酸不溶性成分和浸出物，結(jié)果見表1。水分在7.5%~10.4%之間，平均值為8.8%?？偦曳衷?0.59%~13.37% 之間，平均值為11.3%。酸不溶性灰分在0.28%~1.06%之間，平均值為0.6%。分別考察了不同浸出方法（冷浸法和熱浸法）和不同溶劑（乙醇、70%乙醇、稀乙醇和水），結(jié)果表明采用熱浸法，以70%乙醇作溶劑，浸出物含量最高，測定10 批樣品，結(jié)果在19.8%~24.4%之間，平均值為23.0%。