范歡歡，王天驕，張然然，邢秀梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112）

梅花鹿（Cervus nippon）和馬鹿（Cervus elaphus）為偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）鹿屬（Cervus）的兩個(gè)種，由于這兩種鹿染色體具有高度的同源性，生殖隔離和遺傳隔離的程度較淺[1]，還未進(jìn)化到“限制或停止基因交換”的階段[2]，不論在野外[3]還是家養(yǎng)情況都可以產(chǎn)生可育的后代[4]。近十余年，我國(guó)鹿茸市場(chǎng)混亂，養(yǎng)鹿企業(yè)及個(gè)體養(yǎng)殖戶為了追求雜交帶來(lái)的利益，盲目地將雜交公鹿作為種用，加之人工受精技術(shù)的應(yīng)用，無(wú)序進(jìn)行種間雜交，使得純種梅花鹿數(shù)量銳減，給梅花鹿的良種繁育帶來(lái)了挑戰(zhàn)，也給純種梅花鹿的保護(hù)帶來(lái)了壓力和困難。優(yōu)良的梅花鹿種質(zhì)資源被消耗，將會(huì)導(dǎo)致雜交改良難以繼續(xù)進(jìn)行，這與雜交的初衷相矛盾。自然界中雜交的后代從體型上接近梅花鹿；在人工圈養(yǎng)狀態(tài)下，以梅花鹿為母本、馬鹿為父本雜交產(chǎn)生F1，再以梅花鹿公鹿與F1 代母鹿交配，這樣得到的F2代雜交鹿其體型外貌與梅花鹿極為相似，肉眼難以將二者區(qū)分。

隨著科技的快速發(fā)展，高通量基因分型技術(shù)和全基因組測(cè)序技術(shù)成本逐漸降低，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）在種源鑒定的應(yīng)用已成主流趨勢(shì)，Kim等[5]利用SNP 標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建了由90 個(gè)SNP 標(biāo)記組成的集合，用于鑒別韓國(guó)本地牛、雜交牛和外來(lái)品種牛，同時(shí)隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，全基因組SNP 芯片應(yīng)運(yùn)而生[6]。目前比較成熟的SNP 芯片公司是Illumina 公司的Infinium 技術(shù)[7]和Affymetrix 公司的Axiom 技術(shù)[8]。

Illumina Infinium 芯片是基于微珠的Bead Array生物芯片[9]，Affymetrix 芯片制作是通過(guò)“光蝕刻”完成的[10]，目前，全基因組SNP 芯片種類(lèi)非常多，如豬[11]、牛[12]、綿羊[13]、三文魚(yú)[14]和雞60 K[15]?；蛐酒瑸檫z傳多樣性分析、品種關(guān)系分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies, GWAS）和定量性狀鑒定提供了重要工具[16]。另外，SNP 芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳追溯體系，SNP 標(biāo)記在追溯體系中不僅能做到物種識(shí)別和品種鑒別，例如陸地棉的基因芯片[17]包含17 954 個(gè)種間SNP，可以準(zhǔn)確地區(qū)分陸地棉和海島棉。水稻60 K[18]可以對(duì)粳稻、秈稻及其雜交群體進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒別，雞55 K[19]基因芯片可以準(zhǔn)確地對(duì)中國(guó)13 個(gè)地方品種進(jìn)行鑒別。

本團(tuán)隊(duì)對(duì)249 只梅花鹿、206 只馬鹿、一代雜交鹿（F1）23 只、二代雜交鹿（F2）20 只和三代雜交鹿（F3)20 只共518 個(gè)個(gè)體（表1）進(jìn)行全基因組重測(cè)序（F1 是梅花鹿母鹿和馬鹿公鹿產(chǎn)生的后代，F(xiàn)2 是花馬雜交后代的母鹿和梅花鹿公鹿雜交產(chǎn)生的后代，F(xiàn)3 是梅花鹿公鹿和F2 代母鹿雜交產(chǎn)生的后代），共產(chǎn)生14.03 T有效數(shù)據(jù)（Cleandata），以染色體級(jí)別梅花鹿基因組為參考序列，對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行變異檢測(cè)，共產(chǎn)生130 306 923 SNP 位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾剩余32 940 536 個(gè)位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合所有個(gè)體的表型信息確認(rèn)梅花鹿和馬鹿參考群體，計(jì)算所有SNP 在兩個(gè)參考群體中的遺傳分化指數(shù)（Genetic differentiation index, FST），根據(jù)定制算法和嚴(yán)格的篩選原則，最終選取1 000 個(gè)馬鹿特異性SNP位點(diǎn)用于1K梅花鹿基因芯片的開(kāi)發(fā)（即鹿芯壹號(hào)）[20]，該芯片可以準(zhǔn)確對(duì)待測(cè)樣本的種源（即梅花鹿純度）進(jìn)行鑒別。

表1 鹿全基因組測(cè)序樣本信息Table 1 The information of the whole genome sequencing samples

本研究利用梅花鹿基因芯片對(duì)284 只待測(cè)樣本進(jìn)行基因分型，同時(shí)對(duì)芯片的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，為純種梅花鹿的保護(hù)和利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 從盤(pán)錦、阿城和西豐采集的284 只鹿的待測(cè)抗凝血液樣本，見(jiàn)表2。

表2 血液樣品信息Table 2 The information of the blood samples

1.1.2 主要試劑與儀器 血液基因組DNA 提取試劑盒（DP348-03）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；異丙醇、無(wú)水乙醇、瓊脂糖、50 TAE、6 Loading Buffer、DL15 000 DNA Marker 均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。電泳儀（EPS-300）購(gòu)自上海天能科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)（SYSTEMGelDocXR+IMAGELA）購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的提取與質(zhì)量檢測(cè) 對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行頸靜脈采血，使用血液基因組DNA 提取試劑盒（DP348-03）對(duì)血液樣品的基因組DNA 進(jìn)行提取。DNA 3.5L（2L DNA 樣品，1.5L 6 Loading Buffer，混勻）上樣于1%瓊脂糖凝膠，120 V 電泳18 min，然后將凝膠取出，放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.2 1 K SNP 芯片分型及質(zhì)控 本研究所有群體樣本均按照Illumina 公司提供的掃描方案進(jìn)行1 K芯片掃描和基因分型。其主要步驟為：①樣本DNA定量，按照要求提供稀釋至50ng/L 的樣本DNA；②全基因組DNA 擴(kuò)增；③樣本DNA 片段化、沉淀和重懸；④與1 K 芯片雜交；⑤芯片掃描和數(shù)據(jù)讀取分析?；蚍中秃筇蕹齋NP 檢出率小于95% 的SNP 及個(gè)體和次要等位基因頻率（minor allele frequency,MAF）小于0.05的SNP 標(biāo)記[21]。

1.2.3 系譜、表型鑒定 雖然待測(cè)個(gè)體都有系譜記錄，但是現(xiàn)場(chǎng)工作的復(fù)雜性可能會(huì)出現(xiàn)系譜記錄不準(zhǔn)確，并且F2 代僅靠表型無(wú)法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定。因此，本研究根據(jù)待測(cè)個(gè)體的系譜記錄及表型對(duì)其進(jìn)行綜合鑒定。梅花鹿屬于中型鹿，背面為黑色，腹面為白色，背部中央多有明顯的暗褐色背線（有些品種背線不明顯或無(wú)背線），臀部有明顯白色臀斑，圍繞臀斑有一圈或半圈黑色被毛，尾長(zhǎng)9~15 cm；夏季毛色呈棕黃色或棕紅色（因品種不同而有所差異），遍布白色斑點(diǎn)，狀似梅花；冬季毛色呈灰褐色，白斑不明顯[22]。F1 代個(gè)體的體型多大于馬鹿，被毛顏色多為淡黃色或灰色，斑點(diǎn)不明顯或無(wú)斑點(diǎn)，臀斑顏色為白色，無(wú)黑色毛圈，明顯區(qū)別于梅花鹿，另外F1代個(gè)體的鑒別可參考Ward等[23]建立的四點(diǎn)視覺(jué)評(píng)分系統(tǒng)；F2 代個(gè)體體型外貌類(lèi)似梅花鹿。本研究在梅花鹿資源研究領(lǐng)域?qū)＜覍?duì)待測(cè)樣本的頭長(zhǎng)、毛色、背線、尾斑、喉斑和臀斑綜合評(píng)定后完成個(gè)體表型鑒定，同時(shí)結(jié)合系譜記錄對(duì)待測(cè)個(gè)體進(jìn)行綜合鑒定。

1.2.4 種群結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)樣本的基因分型數(shù)據(jù)利用R-4.0.2 中的prcomp 函數(shù)進(jìn)行主成分分析，然后使用ggplot2 包進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 血液基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

圖1 為血液基因組DNA 提取部分結(jié)果。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大部分DNA 樣品的質(zhì)量可以滿足要求，個(gè)別樣品DNA 電泳條帶出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、條帶過(guò)暗或無(wú)條帶現(xiàn)象。不合格的樣品重新進(jìn)行基因組DNA 的提取并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，直至達(dá)到測(cè)序要求。

圖1 血液基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis results of the blood genome

2.2 芯片的分型和質(zhì)控

284 個(gè)樣本的芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)有974個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，經(jīng)過(guò)過(guò)濾條件（見(jiàn)方法1.2.2）的篩選剩余833 個(gè)SNP 位點(diǎn)用于后續(xù)的分析，剩余位點(diǎn)的MAF 平均值為0.38，SNP 位點(diǎn)的平均檢出率為98.7%，3 個(gè)群體的平均檢出率，見(jiàn)表3。

表3 芯片質(zhì)控信息Table 3 The information of the chip quality control

2.3 系譜、表型鑒定和種群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)系譜、表型鑒定方法（見(jiàn)方法1.2.3 和1.2.4），284 只待測(cè)個(gè)體中F1 共有48 只，F(xiàn)2 有50 只，梅花鹿186 只。根據(jù)這些樣本的芯片分型數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，F(xiàn)1 和梅花鹿分別緊密地聚集在一起并且聚集在PC1 的兩端，F(xiàn)2 個(gè)體較為分散，但是整體上和F1、梅花鹿區(qū)分明顯，這和系譜、表型鑒定的結(jié)果基本一致，說(shuō)明芯片的檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確的。

圖2 待測(cè)樣品的種群結(jié)構(gòu)分析Fig.2 The population structure analysis of the samples to be tested

3 討論

目前梅花鹿及其鹿產(chǎn)品的鑒別技術(shù)主要分為物理化學(xué)方法和生物學(xué)方法兩大類(lèi)，其中物理化學(xué)有質(zhì)譜、紅外線光譜等技術(shù)。尹冬冬[24]選擇近紅外光譜在7 500~4 500 cm-1信息段對(duì)鹿血和偽劣鹿血近紅外光譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明該方法鑒別真正鹿血樣本和未知鹿血樣本準(zhǔn)確率分別達(dá)到100%和93%。郭曉涵等[25]將主成分分析（PCA）和OPLS-DA 相結(jié)合的UPLCQTOF-MS 法成功地應(yīng)用于中國(guó)藥典規(guī)定鹿茸的鑒別。利用主成分分析（PCA）和OPLS-DA 對(duì)原發(fā)生QI 處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并從大樣本中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)標(biāo)記肽。根據(jù)產(chǎn)品離子模型，選擇了具有較好響應(yīng)的兩個(gè)片段離子以建立適當(dāng)?shù)亩囗憫?yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），其可用于鑒定馴鹿鹿茸，即使在濃度較低的情況下也是可以對(duì)馴鹿鹿茸的真?zhèn)芜M(jìn)行定性鑒別，為規(guī)范鹿茸市場(chǎng)提供有力的技術(shù)支持。生物學(xué)方法是蛋白質(zhì)和DNA 分析方法，蛋白質(zhì)分析方法包括電泳法[26]和免疫學(xué)方法[27]，DNA分析方法如PCR、qPCR 和SNP 等。劉春生等[28]根據(jù)鹿科鹿屬種動(dòng)物Cytb 全序列比對(duì)分析,設(shè)計(jì)1 對(duì)可以鑒定正品鹿茸（包括梅花鹿和馬鹿）和其他近源種鹿茸的特異性引物，并且結(jié)合PCR 的方法可以快速準(zhǔn)確地鑒別出馬鹿和梅花鹿的產(chǎn)品。Fajardo[29]提出了一種四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法，可以同時(shí)測(cè)定馬鹿和梅花鹿成分的含量。四重分析法顯示與密切相關(guān)物種的中等交叉反應(yīng)性，優(yōu)化后，四重分析法對(duì)四種鹿的每種檢測(cè)限為0.1%，定量限為0.5%。董世武等[30]基于GBS 測(cè)序技術(shù)以組裝到染色體的梅花鹿基因組為參考，檢測(cè)173 個(gè)梅花鹿、209 個(gè)馬鹿、113 個(gè)一代雜交鹿（F1)、38 個(gè)二代雜交鹿（F2）以及1 個(gè)未知個(gè)體共534個(gè)樣本的SNP變異，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選原則，篩選出40295個(gè)SNP位點(diǎn)用于分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，根據(jù)分子進(jìn)化樹(shù)顯示的樣本間進(jìn)化關(guān)系確定參考群體，識(shí)別馬鹿有而梅花鹿沒(méi)有的特異性SNP 位點(diǎn)760 個(gè)，梅花鹿有而馬鹿沒(méi)有的特異性SNP 位點(diǎn)501 個(gè)。本研究利用的1 K梅花鹿基因芯片是在整個(gè)基因組范圍內(nèi)尋找馬鹿和梅花鹿基因組的不同點(diǎn)，GBS 測(cè)序只是對(duì)基因組的1%進(jìn)行測(cè)序。因此，基因芯片的結(jié)果要更加準(zhǔn)確。

主成分分析結(jié)果表明，主成分1（principal components 1，PC1）可以將梅花鹿、馬鹿、F1、F2 區(qū)分出來(lái)，F(xiàn)2群體較為分散分布在PC1 的中間位置，但大體上可以和其他兩個(gè)群體區(qū)分開(kāi)來(lái)，這可能是因?yàn)镕2 群體中個(gè)體血緣純度不均一[21]。另外F2 群體中還有3 個(gè)表型鑒定為F1 的個(gè)體，可能是因?yàn)椴蓸蛹竟?jié)（換毛季節(jié)）對(duì)人為判斷造成影響，3 個(gè)F1 實(shí)際為F2 群體。