范歡歡，王天驕，張然然，邢秀梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春 130112）

梅花鹿（Cervus nippon）和馬鹿（Cervus elaphus）為偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）鹿屬（Cervus）的兩個種，由于這兩種鹿染色體具有高度的同源性，生殖隔離和遺傳隔離的程度較淺[1]，還未進(jìn)化到“限制或停止基因交換”的階段[2]，不論在野外[3]還是家養(yǎng)情況都可以產(chǎn)生可育的后代[4]。近十余年，我國鹿茸市場混亂，養(yǎng)鹿企業(yè)及個體養(yǎng)殖戶為了追求雜交帶來的利益，盲目地將雜交公鹿作為種用，加之人工受精技術(shù)的應(yīng)用，無序進(jìn)行種間雜交，使得純種梅花鹿數(shù)量銳減，給梅花鹿的良種繁育帶來了挑戰(zhàn)，也給純種梅花鹿的保護(hù)帶來了壓力和困難。優(yōu)良的梅花鹿種質(zhì)資源被消耗，將會導(dǎo)致雜交改良難以繼續(xù)進(jìn)行，這與雜交的初衷相矛盾。自然界中雜交的后代從體型上接近梅花鹿；在人工圈養(yǎng)狀態(tài)下，以梅花鹿為母本、馬鹿為父本雜交產(chǎn)生F1，再以梅花鹿公鹿與F1 代母鹿交配，這樣得到的F2代雜交鹿其體型外貌與梅花鹿極為相似，肉眼難以將二者區(qū)分。

隨著科技的快速發(fā)展，高通量基因分型技術(shù)和全基因組測序技術(shù)成本逐漸降低，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）在種源鑒定的應(yīng)用已成主流趨勢，Kim等[5]利用SNP 標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建了由90 個SNP 標(biāo)記組成的集合，用于鑒別韓國本地牛、雜交牛和外來品種牛，同時隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，全基因組SNP 芯片應(yīng)運而生[6]。目前比較成熟的SNP 芯片公司是Illumina 公司的Infinium 技術(shù)[7]和Affymetrix 公司的Axiom 技術(shù)[8]。

Illumina Infinium 芯片是基于微珠的Bead Array生物芯片[9]，Affymetrix 芯片制作是通過“光蝕刻”完成的[10]，目前，全基因組SNP 芯片種類非常多，如豬[11]、牛[12]、綿羊[13]、三文魚[14]和雞60 K[15]。基因芯片為遺傳多樣性分析、品種關(guān)系分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies, GWAS）和定量性狀鑒定提供了重要工具[16]。另外，SNP 芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于動物遺傳追溯體系，SNP 標(biāo)記在追溯體系中不僅能做到物種識別和品種鑒別，例如陸地棉的基因芯片[17]包含17 954 個種間SNP，可以準(zhǔn)確地區(qū)分陸地棉和海島棉。水稻60 K[18]可以對粳稻、秈稻及其雜交群體進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒別，雞55 K[19]基因芯片可以準(zhǔn)確地對中國13 個地方品種進(jìn)行鑒別。

本團隊對249 只梅花鹿、206 只馬鹿、一代雜交鹿（F1）23 只、二代雜交鹿（F2）20 只和三代雜交鹿（F3)20 只共518 個個體（表1）進(jìn)行全基因組重測序（F1 是梅花鹿母鹿和馬鹿公鹿產(chǎn)生的后代，F(xiàn)2 是花馬雜交后代的母鹿和梅花鹿公鹿雜交產(chǎn)生的后代，F(xiàn)3 是梅花鹿公鹿和F2 代母鹿雜交產(chǎn)生的后代），共產(chǎn)生14.03 T有效數(shù)據(jù)（Cleandata），以染色體級別梅花鹿基因組為參考序列，對所有個體進(jìn)行變異檢測，共產(chǎn)生130 306 923 SNP 位點，經(jīng)過質(zhì)控過濾剩余32 940 536 個位點，同時結(jié)合所有個體的表型信息確認(rèn)梅花鹿和馬鹿參考群體，計算所有SNP 在兩個參考群體中的遺傳分化指數(shù)（Genetic differentiation index, FST），根據(jù)定制算法和嚴(yán)格的篩選原則，最終選取1 000 個馬鹿特異性SNP位點用于1K梅花鹿基因芯片的開發(fā)（即鹿芯壹號）[20]，該芯片可以準(zhǔn)確對待測樣本的種源（即梅花鹿純度）進(jìn)行鑒別。

表1 鹿全基因組測序樣本信息Table 1 The information of the whole genome sequencing samples

本研究利用梅花鹿基因芯片對284 只待測樣本進(jìn)行基因分型，同時對芯片的準(zhǔn)確性進(jìn)行評估，為純種梅花鹿的保護(hù)和利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 從盤錦、阿城和西豐采集的284 只鹿的待測抗凝血液樣本，見表2。

表2 血液樣品信息Table 2 The information of the blood samples

1.1.2 主要試劑與儀器 血液基因組DNA 提取試劑盒（DP348-03）購自天根生化科技（北京）有限公司；異丙醇、無水乙醇、瓊脂糖、50 TAE、6 Loading Buffer、DL15 000 DNA Marker 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。電泳儀（EPS-300）購自上海天能科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)（SYSTEMGelDocXR+IMAGELA）購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的提取與質(zhì)量檢測 對試驗動物進(jìn)行頸靜脈采血，使用血液基因組DNA 提取試劑盒（DP348-03）對血液樣品的基因組DNA 進(jìn)行提取。DNA 3.5L（2L DNA 樣品，1.5L 6 Loading Buffer，混勻）上樣于1%瓊脂糖凝膠，120 V 電泳18 min，然后將凝膠取出，放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.2 1 K SNP 芯片分型及質(zhì)控 本研究所有群體樣本均按照Illumina 公司提供的掃描方案進(jìn)行1 K芯片掃描和基因分型。其主要步驟為：①樣本DNA定量，按照要求提供稀釋至50ng/L 的樣本DNA；②全基因組DNA 擴增；③樣本DNA 片段化、沉淀和重懸；④與1 K 芯片雜交；⑤芯片掃描和數(shù)據(jù)讀取分析?；蚍中秃筇蕹齋NP 檢出率小于95% 的SNP 及個體和次要等位基因頻率（minor allele frequency,MAF）小于0.05的SNP 標(biāo)記[21]。

1.2.3 系譜、表型鑒定 雖然待測個體都有系譜記錄，但是現(xiàn)場工作的復(fù)雜性可能會出現(xiàn)系譜記錄不準(zhǔn)確，并且F2 代僅靠表型無法對其進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定。因此，本研究根據(jù)待測個體的系譜記錄及表型對其進(jìn)行綜合鑒定。梅花鹿屬于中型鹿，背面為黑色，腹面為白色，背部中央多有明顯的暗褐色背線（有些品種背線不明顯或無背線），臀部有明顯白色臀斑，圍繞臀斑有一圈或半圈黑色被毛，尾長9~15 cm；夏季毛色呈棕黃色或棕紅色（因品種不同而有所差異），遍布白色斑點，狀似梅花；冬季毛色呈灰褐色，白斑不明顯[22]。F1 代個體的體型多大于馬鹿，被毛顏色多為淡黃色或灰色，斑點不明顯或無斑點，臀斑顏色為白色，無黑色毛圈，明顯區(qū)別于梅花鹿，另外F1代個體的鑒別可參考Ward等[23]建立的四點視覺評分系統(tǒng)；F2 代個體體型外貌類似梅花鹿。本研究在梅花鹿資源研究領(lǐng)域?qū)＜覍Υ郎y樣本的頭長、毛色、背線、尾斑、喉斑和臀斑綜合評定后完成個體表型鑒定，同時結(jié)合系譜記錄對待測個體進(jìn)行綜合鑒定。

1.2.4 種群結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)樣本的基因分型數(shù)據(jù)利用R-4.0.2 中的prcomp 函數(shù)進(jìn)行主成分分析，然后使用ggplot2 包進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 血液基因組DNA質(zhì)量檢測

圖1 為血液基因組DNA 提取部分結(jié)果。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，大部分DNA 樣品的質(zhì)量可以滿足要求，個別樣品DNA 電泳條帶出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、條帶過暗或無條帶現(xiàn)象。不合格的樣品重新進(jìn)行基因組DNA 的提取并進(jìn)行質(zhì)量檢測，直至達(dá)到測序要求。

圖1 血液基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis results of the blood genome

2.2 芯片的分型和質(zhì)控

284 個樣本的芯片檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)有974個位點具有多態(tài)性，經(jīng)過過濾條件（見方法1.2.2）的篩選剩余833 個SNP 位點用于后續(xù)的分析，剩余位點的MAF 平均值為0.38，SNP 位點的平均檢出率為98.7%，3 個群體的平均檢出率，見表3。

表3 芯片質(zhì)控信息Table 3 The information of the chip quality control

2.3 系譜、表型鑒定和種群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)系譜、表型鑒定方法（見方法1.2.3 和1.2.4），284 只待測個體中F1 共有48 只，F(xiàn)2 有50 只，梅花鹿186 只。根據(jù)這些樣本的芯片分型數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析，見圖2。結(jié)果表明，F(xiàn)1 和梅花鹿分別緊密地聚集在一起并且聚集在PC1 的兩端，F(xiàn)2 個體較為分散，但是整體上和F1、梅花鹿區(qū)分明顯，這和系譜、表型鑒定的結(jié)果基本一致，說明芯片的檢測結(jié)果是準(zhǔn)確的。

圖2 待測樣品的種群結(jié)構(gòu)分析Fig.2 The population structure analysis of the samples to be tested

3 討論

目前梅花鹿及其鹿產(chǎn)品的鑒別技術(shù)主要分為物理化學(xué)方法和生物學(xué)方法兩大類，其中物理化學(xué)有質(zhì)譜、紅外線光譜等技術(shù)。尹冬冬[24]選擇近紅外光譜在7 500~4 500 cm-1信息段對鹿血和偽劣鹿血近紅外光譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明該方法鑒別真正鹿血樣本和未知鹿血樣本準(zhǔn)確率分別達(dá)到100%和93%。郭曉涵等[25]將主成分分析（PCA）和OPLS-DA 相結(jié)合的UPLCQTOF-MS 法成功地應(yīng)用于中國藥典規(guī)定鹿茸的鑒別。利用主成分分析（PCA）和OPLS-DA 對原發(fā)生QI 處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并從大樣本中發(fā)現(xiàn)兩個標(biāo)記肽。根據(jù)產(chǎn)品離子模型，選擇了具有較好響應(yīng)的兩個片段離子以建立適當(dāng)?shù)亩囗憫?yīng)監(jiān)測（MRM），其可用于鑒定馴鹿鹿茸，即使在濃度較低的情況下也是可以對馴鹿鹿茸的真?zhèn)芜M(jìn)行定性鑒別，為規(guī)范鹿茸市場提供有力的技術(shù)支持。生物學(xué)方法是蛋白質(zhì)和DNA 分析方法，蛋白質(zhì)分析方法包括電泳法[26]和免疫學(xué)方法[27]，DNA分析方法如PCR、qPCR 和SNP 等。劉春生等[28]根據(jù)鹿科鹿屬種動物Cytb 全序列比對分析,設(shè)計1 對可以鑒定正品鹿茸（包括梅花鹿和馬鹿）和其他近源種鹿茸的特異性引物，并且結(jié)合PCR 的方法可以快速準(zhǔn)確地鑒別出馬鹿和梅花鹿的產(chǎn)品。Fajardo[29]提出了一種四重實時熒光定量PCR 檢測方法，可以同時測定馬鹿和梅花鹿成分的含量。四重分析法顯示與密切相關(guān)物種的中等交叉反應(yīng)性，優(yōu)化后，四重分析法對四種鹿的每種檢測限為0.1%，定量限為0.5%。董世武等[30]基于GBS 測序技術(shù)以組裝到染色體的梅花鹿基因組為參考，檢測173 個梅花鹿、209 個馬鹿、113 個一代雜交鹿（F1)、38 個二代雜交鹿（F2）以及1 個未知個體共534個樣本的SNP變異，經(jīng)過嚴(yán)格的篩選原則，篩選出40295個SNP位點用于分子進(jìn)化樹的構(gòu)建，根據(jù)分子進(jìn)化樹顯示的樣本間進(jìn)化關(guān)系確定參考群體，識別馬鹿有而梅花鹿沒有的特異性SNP 位點760 個，梅花鹿有而馬鹿沒有的特異性SNP 位點501 個。本研究利用的1 K梅花鹿基因芯片是在整個基因組范圍內(nèi)尋找馬鹿和梅花鹿基因組的不同點，GBS 測序只是對基因組的1%進(jìn)行測序。因此，基因芯片的結(jié)果要更加準(zhǔn)確。

主成分分析結(jié)果表明，主成分1（principal components 1，PC1）可以將梅花鹿、馬鹿、F1、F2 區(qū)分出來，F(xiàn)2群體較為分散分布在PC1 的中間位置，但大體上可以和其他兩個群體區(qū)分開來，這可能是因為F2 群體中個體血緣純度不均一[21]。另外F2 群體中還有3 個表型鑒定為F1 的個體，可能是因為采樣季節(jié)（換毛季節(jié)）對人為判斷造成影響，3 個F1 實際為F2 群體。