張洪銘，郭文軍，孫英蓮，王英軍，解生旭，徐雅娟※

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130012）

發(fā)熱是較多疾病的共同特征，具有復(fù)雜的病理過程，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為發(fā)熱是因外源性熱原作用于免疫活性細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性熱原，而內(nèi)源性熱原作用于環(huán)磷腺苷等體溫調(diào)節(jié)介質(zhì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱增加或散熱減少[1,2]。清肺化痰顆粒（QFHT）是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院的協(xié)定方劑，由桑白皮和地骨皮等12味藥材組成，在解熱、祛痰、鎮(zhèn)咳和平喘的臨床應(yīng)用中療效確切，但該方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚未明確，需要利用全面有效的研究手段進(jìn)行探討。近幾年提出的代謝組學(xué)研究思維符合中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的系統(tǒng)性治療原則，該研究方法已被廣泛應(yīng)用于探討藥物作用機(jī)制[3-5]。本文擬以UPLC-Q-Exactive-MS的血清代謝組學(xué)為技術(shù)手段，篩選酵母誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱的潛在生物標(biāo)志物，探討QFHT解熱作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級SD 大鼠60 只，雌雄各半，180~200 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001；質(zhì)量合格證號：210726210100264952，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用符合倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 試藥與試劑

QFHT由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院制劑室提供；對乙酰氨基酚片，葵花藥業(yè)集團(tuán)湖北武當(dāng)有限公司，批號：190402；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20120516；氯化鈉注射液，長春豪邦藥業(yè)有限公司，批號：S13030601；質(zhì)譜級甲醇，德國Fisher 公司；超純水（Milli-Q 儀器所制）；大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：03/2021。

1.3 儀器

ST-360酶標(biāo)儀，上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；Vanquish Duo 超高效液相色譜儀，Q-Exactive 質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Science；GL-21M 高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；PD-1C-80 冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)前每只大鼠測肛溫2次，選取體溫波動(dòng)不超過0.5℃的大鼠為實(shí)驗(yàn)用大鼠，以2次合格體溫的平均值作為大鼠基礎(chǔ)體溫值。大鼠60 只，兼顧體溫、體重將其均分6 組，每組10 只，分別為對照組、模型組、陽性藥組、QFHT 高劑量組、中劑量組和低劑量組。陽性藥組灌胃0.1 g/kg 對乙酰氨基酚片，給藥組灌胃3.5 g/kg QFHT，對照組給予同體積水，連續(xù)給藥5 d，末次給藥前大鼠禁食不禁水16 h，末次給藥后，除對照組外，其余各組大鼠立即于背部皮下注射15%酵母混懸液10mL/kg 致熱，建立大鼠發(fā)熱模型。

1.4.2 藥效學(xué)評價(jià) 各組大鼠致熱后1 h、2 h、4 h、5 h和6 h 各測肛溫1 次，記錄體溫值并計(jì)算與基礎(chǔ)體溫差值；大鼠最后1 次測量體溫后腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），腹主動(dòng)脈采血，靜置3 h，3 000 r/min離心10 min 分離血清，按照cAMP 酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清cAMP 的含量。

1.4.3 血清代謝組學(xué)分析

1.4.3.2 液相質(zhì)譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD（50 mm 2.1 mm，1.9m）；流動(dòng)相：水（A）-甲醇（B），梯度：5% B（0~2 min），5%~35% B（2~5 min），35%~55%B（5~12 min），55%~65%B（12~14 min），65%~100%B（14~20 min），100% B（20~25 min），100%~5%B（25~30 min），5%B（30~35 min）；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5L；柱溫：50 ℃。

采用電噴霧電離源（ESI），樣品分別采用正、負(fù)離子模式檢測。鞘氣流量60 Arb；輔助氣流量15 Arb；毛細(xì)管溫度300℃；一級檢測掃描范圍100~1 500 m/z，分辨率35 000。二級裂解掃描范圍100~1 500 m/z，分辨率17500，裂解能量為10，20，30；動(dòng)態(tài)排除設(shè)為30s。

1.4.4 主成分分析和潛在生物標(biāo)志物的篩選 使用Compound Discoverer-3.1 對原始的UPLC-Q-Exactive-MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，得到包含每個(gè)離子峰的保留時(shí)間、m/z值和歸一化強(qiáng)度等詳細(xì)信息的多維數(shù)據(jù)集，保存為.csv 文件并導(dǎo)入SIMCA-P14.1 軟件，建立偏最小二乘判別分析（PLS-DA）模型，探討不同組間血清代謝物的差異，參數(shù)R2Y 和Q2被用來評價(jià)PLS-DA 模型的擬合程度。模型組與對照組比較，根據(jù)投影值（VIP＞1）和P ＜0.05，篩選潛在生物標(biāo)志物。分析給藥組與模型組之間這些潛在生物標(biāo)志物的水平來說明QFHT對大鼠解熱的作用。

1.4.5 潛在生物標(biāo)志物的鑒定及通路富集分析 潛在生物標(biāo)志物的一級和二級質(zhì)譜碎片信息與人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB，http://www.hmdb.ca） 中已知代謝物的碎片信息進(jìn)行比對，來實(shí)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物的鑒定。將鑒定出的潛在生物標(biāo)志物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0 網(wǎng)站進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 QFHT 對發(fā)熱大鼠體溫和血清中cAMP 的影響

如圖1 A 所示，與對照組相比，模型組大鼠在注射酵母混懸液后體溫逐漸增加，4 h 后體溫顯著升高，且大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、足部、耳廓和鼠尾發(fā)紅發(fā)燙的現(xiàn)象，表明發(fā)熱模型建立成功。與模型組相比，陽性藥組和QFHT 中劑量組大鼠體溫均呈現(xiàn)下降趨勢，且效果明顯（P ＜0.05）。如圖1B 所示，造模6 h 后，模型組大鼠血清中cAMP 含量明顯高于對照組，陽性藥組和QFHT 中劑量組大鼠血清中cAMP 含量明顯低于模型組（P ＜0.05），結(jié)果表明QFHT 具有解熱作用。

圖1 各組大鼠肛溫上升曲線圖（A）和血清中cAMP 含量柱形圖（B）Fig.1 Curve of anal temperature rise (A)and column chart of serum cAMP content (B)of rats in the each group

2.2 血清代謝輪廓分析

利用UPLC-Q-Exactive-MS 分析對照組、模型組、陽性藥組和QFHT 中劑量組大鼠的代謝輪廓，進(jìn)樣分析每10 個(gè)血清樣品后，進(jìn)樣一次QC 樣品，分析評價(jià)儀器和方法的穩(wěn)定性。QC 樣品的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，在正離子模式（P）和負(fù)離子模式（N）下提取了包含4 755 個(gè)和2 331 個(gè)離子的兩個(gè)數(shù)據(jù)集，通過計(jì)算同一離子在不同QC 中歸一化強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）來評價(jià)儀器和方法的穩(wěn)定性。如圖2 所示，在正離子模式和負(fù)離子模式下分別有74%和70%的被測離子的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于30%[6]，表明該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

圖2 所有代謝物在QC 樣品中的RSD（%）分布Fig.2 RSD(%)distribution of all metabolites in QC samples

血清樣品總離子流圖如圖3 所示，各組間總離子流圖存在細(xì)微差別，但直觀分析不足以闡明各組間血清代謝譜的差異，故采用主成分分析的手段進(jìn)一步闡明QFHT 對發(fā)熱大鼠代謝譜的影響。

圖3 總離子流圖Fig.3 Total ion flow diagram

將對照組、模型組和QFHT 中劑量組的多維數(shù)據(jù)集導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 建立PLS-DA模型，并進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)對模型進(jìn)行驗(yàn)證，具體擬合參數(shù)見表1，一般認(rèn)為R2Y 及Q2值大于0.5 的模型擬合較好，穩(wěn)定性較高[7]。如圖4A、4B 所示，模型組和對照組主成分間完全分離，表明大鼠經(jīng)干酵母造模后，血清代謝譜發(fā)生紊亂，發(fā)熱模型造模成功。圖4C、4D 中顯示，QFHT中劑量組的聚類脫離了模型組，而表現(xiàn)出接近對照組的趨勢，表明QFHT中劑量組的大鼠發(fā)熱已得到恢復(fù)，QFHT 起到了解熱的效果。

圖4 PLS-DA 得分圖Fig.4 PLS-DA score diagram

表1 置換檢驗(yàn)的擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of the replacement test

2.3 潛在生物標(biāo)志物篩選及鑒定

分析模型組和對照組的PLS-DA 得分圖，根據(jù)投影值（VIP ＞1）和t 檢驗(yàn)（P ＜0.05）篩選了123 個(gè)潛在生物標(biāo)志物，將潛在生物標(biāo)志物的碎片信息與HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對鑒定。以RT 18.876 min-m/z 480.309 6的LysoPE（18:0/0:0）離子為例說明了鑒定結(jié)構(gòu)過程，如圖5所示，在m/z 196.037 5處觀察到對應(yīng)于C5H11NO5P-頭基的碎片離子，并且在m/z283.2643 處觀察到該頭基碎片的損失；m/z 214.048 6、m/z 140.011 8 和m/z 78.959 1 處的離子分別代表頭基上的C5H13NO6P-、C2H7NO4P-和O3P-碎片離子，以此將RT18.876min-m/z480.309 6離子鑒定為LysoPE（18:0/0:0）。

圖5 LysoPE（18:0/0:0）二級質(zhì)譜圖Fig.5 LysoPE(18:0/0:0)secondary mass spectrometry

通過上述方法鑒定出21 個(gè)潛在生物標(biāo)志物，并運(yùn)用MetaboAnalyst 5.0 分析了潛在生物標(biāo)志物在各組間的變化趨勢，大鼠發(fā)熱后21 個(gè)潛在生物標(biāo)志物發(fā)生不同程度的改變，并在QFHT治療后能夠被逆轉(zhuǎn)，詳細(xì)信息見表2，表明QFHT 可以通過調(diào)節(jié)這些潛在生物標(biāo)志物達(dá)到解熱的效果。

表2 內(nèi)源性潛在生物標(biāo)志物及其在組間的變化趨勢Table 2 Endogenous potential biomarkers and their variation trends among groups

這些潛在生物標(biāo)志物的改變提示了代謝表型發(fā)生變化，有助于了解大鼠發(fā)熱的潛在代謝機(jī)制和QFHT的治療機(jī)制。生成熱圖以顯示不同組中每個(gè)生物標(biāo)記物的相應(yīng)水平。如圖6 所示，不同組間的色差表現(xiàn)出潛在生物標(biāo)志物的變化。

圖6 潛在生物標(biāo)志物熱圖Fig.6 Heat map of potential biomarkers

2.4 代謝通路分析

將潛在生物標(biāo)志物的Compound Name導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0 進(jìn)行通路富集分析，共富集9 條代謝通路，見圖7，其中Impact ＞0.1 為最主要的代謝途徑，詳見表3，表明QFHT解熱的機(jī)制與調(diào)控色氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x有關(guān)。

圖7 潛在生物標(biāo)志物的代謝通路分析Fig.7 Metabolic pathway analysis of potential biomarkers

表3 潛在生物標(biāo)志物的代謝通路參數(shù)Table 3 Metabolic pathway parameters of potential biomarkers

3 討論

發(fā)熱是較多疾病的共同臨床特征，具有復(fù)雜的病理過程?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，細(xì)菌、病毒、真菌和炎性滲出物等外源性熱原作用于免疫活性細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性熱原[1]。內(nèi)源性熱原最初作用于前列腺素、環(huán)磷腺苷等體溫調(diào)節(jié)介質(zhì)，通過它們的正向調(diào)節(jié)，使得大腦中的體溫調(diào)節(jié)點(diǎn)上移，導(dǎo)致產(chǎn)熱增加或散熱減少，最終引起發(fā)燒[2]。常用于誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型的誘導(dǎo)劑為干酵母、脂多糖和2，4-二硝基苯酚、面包酵母和釀酒酵母甘露聚糖等[8]，其中2，4-二硝基苯酚性發(fā)熱模型升溫最快，但持續(xù)時(shí)間較短；脂多糖誘導(dǎo)的發(fā)熱模型的特征為雙相或三相發(fā)熱，其造模劑量極小，高劑量易導(dǎo)致動(dòng)物死亡；與前兩個(gè)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的發(fā)熱模型相比，干酵母誘導(dǎo)的發(fā)熱模型相對穩(wěn)定，熱程長，重復(fù)性好，且原料易得[9]。

發(fā)熱反應(yīng)大多是各種致熱因子作用于機(jī)體，產(chǎn)生和釋放內(nèi)熱原，并進(jìn)一步影響體溫調(diào)節(jié)中樞，使調(diào)溫起步點(diǎn)提高，體溫相應(yīng)升高。大鼠皮下注射酵母懸液可激活產(chǎn)生內(nèi)熱原。內(nèi)生致熱原一般包括IL-1、IL-6和TNF-等，體溫中樞調(diào)節(jié)介質(zhì)包括單胺物質(zhì)、cAMP和PGE2等，發(fā)熱過程中，內(nèi)生致熱原通過中樞發(fā)熱介質(zhì)作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，使體溫調(diào)定點(diǎn)上移，機(jī)體產(chǎn)熱。本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射15%酵母混懸液建立感染性發(fā)熱大鼠模型，結(jié)果QFHT 給藥組在給藥后4 h 對酵母引起的大鼠體溫升高具有降低作用。

cAMP 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的炎癥介質(zhì)之一，是體內(nèi)第二信使，對外界刺激做出反應(yīng)的一類重要的信息傳遞分子，也是中樞主要的正性發(fā)熱介質(zhì)，cAMP含量上升是多種致熱原引起發(fā)熱的共同中間環(huán)節(jié)[10]，可以通過內(nèi)源性熱原 下丘腦Na+/Ca2+-cAMP 途徑參與體溫調(diào)節(jié)[11-13]。因此抑制cAMP 的合成和釋放是抑制發(fā)熱反應(yīng)的有效方法。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ELISA法測定大鼠血清中cAMP 含量，結(jié)果表明，對乙酰氨基酚組和QFHT 給藥組可明顯降低發(fā)熱大鼠血清中cAMP 的含量（P ＜0.05）。提示QFHT 具有一定的解熱作用，其解熱機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)中樞發(fā)熱介質(zhì)cAMP，從而達(dá)到降低體溫的作用。

色氨酸是人體必需氨基酸，主要參與蛋白質(zhì)合成和代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，其中5-羥色氨酸是5-羥色胺（5-HT）的前體物質(zhì)，5-HT途徑是色氨酸降解的主要代謝途徑之一。據(jù)報(bào)道，酵母菌引起的發(fā)熱與5-HT 有關(guān)，而下丘腦5-HT含量與溫度呈正相關(guān)[14]。有研究表明，5-HT等中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)能引起大鼠發(fā)熱[15]。本實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，高熱大鼠體內(nèi)色氨酸、5-HT顯著升高，提示色氨酸合成5-羥色胺的能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致體溫升高，給予QFHT 后，色氨酸、5-HT 水平明顯下降，表明下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞受到調(diào)節(jié)，從而達(dá)到解熱作用，同時(shí)也證實(shí)了QFHT 調(diào)控色氨酸代謝的可能。

有研究發(fā)現(xiàn)，腦室注射IL-1 腦脊液中?；撬犸@著增多，同時(shí)一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，?；撬崮軌蚓徑獍l(fā)熱過程中出現(xiàn)的興奮沖動(dòng)傳遞和電解質(zhì)的改變等。家兔腦室內(nèi)注射?；撬?，能夠抑制由內(nèi)毒素、致熱性細(xì)胞因子或PGE2 誘發(fā)的發(fā)熱反應(yīng)[16]。牛磺熊去氧膽酸是熊去氧膽酸和?；撬峤Y(jié)合的產(chǎn)物，本代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，模型組牛磺熊去氧膽酸顯著改變，QFHT治療后，其水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)，提示QFHT 通過調(diào)控?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑起到解熱的療效。

本研究通過UPLC-Q-Exactive-MS 代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)QFHT 對發(fā)熱大鼠的治療作用與其改善血清中內(nèi)源性潛在生物標(biāo)志物的水平有關(guān)，并主要通過調(diào)控色氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑發(fā)揮解熱作用，可為臨床上QFHT 的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。