賴楚兒，王義軍

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種炎癥性自身免疫性疾病，發(fā)病與遺傳和細菌感染等環(huán)境因素相關(guān)，以中軸關(guān)節(jié)、韌帶和肌腱受累產(chǎn)生非特異性炎癥、纖維化及骨化為主要表現(xiàn)。臨床癥狀典型為腰背疼痛和晨僵，后期隨著脊柱關(guān)節(jié)破壞、融合可出現(xiàn)脊柱僵直和畸形。西醫(yī)藥物治療主要是NSAIDs、DMARDs和bDMARDs（TNF 抑制劑）等[1-3]。在我國患病率約為0.3%[4]。中醫(yī)認為AS 屬于痹病范疇，發(fā)病以正虛為本，腎虛及督脈空虛是根本病因，風濕、瘀血、痰濁及濕熱等是阻滯經(jīng)脈，造成疼痛、僵硬，影響病情發(fā)展的重要原因，為標。

青風藤 穿山龍藥對是胡蔭奇教授治療強直性脊柱炎的經(jīng)驗用藥[5]，特別適用于寒濕痰瘀痹阻所致的腰背疼痛。青風藤味苦、辛，性平，入肝、脾經(jīng)，主要功用是祛風濕、通經(jīng)絡(luò)，此外還有通利小便的作用；穿山龍味甘、苦，性溫，歸肝、腎、肺經(jīng)，與青風藤同有祛風除濕、舒經(jīng)通絡(luò)之功效，兼可活血止痛[6]。兩藥相須為用，辛開苦泄，溫通肝腎之經(jīng)，加強祛風通絡(luò)之功效。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學，探究青風藤 穿山龍藥對治療強直性脊柱炎的可能靶點及作用機制，為中醫(yī)藥治療強直性脊柱炎提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 青風藤 穿山龍化學成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]，分別以中藥名搜索青風藤和穿山龍，獲得中藥化學成分。根據(jù)ADEM篩選有效活性成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。另外根據(jù)文獻補充藥物有效成分。

1.2 化合物疾病靶點篩選

在TCMSP 平臺下載中藥有效成分的化學結(jié)構(gòu)圖，以.Mol 格式導入PharmMapper 服務(wù)器[8-10（]http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），據(jù)成分化學結(jié)構(gòu)預測作用靶點，目標集為“Human Protein Targets Only”，獲得的靶點數(shù)據(jù)，選擇Norm Fit＞0.5 的蛋白質(zhì)靶點，將其UniplotID 導入Untprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）[11]，獲得對應(yīng)的化合物疾病基因靶點。

1.3 強直性脊柱炎疾病靶點篩選

在在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https://omim.org）、DrugBank 疾病靶點篩選數(shù)據(jù)庫[12]（https://www.drugbank.ca/）和GeneCards數(shù)據(jù)庫[13（]https://www.genecards.org/）輸入疾病名稱“ankylosing spondylitis”，獲得疾病靶點數(shù)據(jù)。疾病基因經(jīng)Unprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范化處理，用疾病靶點與成分靶點繪制韋恩圖，獲得成分疾病交集基因。

1.4 藥物 成分 疾病 靶點網(wǎng)絡(luò)

將青風藤 穿山龍藥對治療AS 的成分-疾病基因數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件[14]進行可視化分析，構(gòu)建出“藥物 成分 靶點 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

在String 功能性蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫[15]（https://string-db.org/）導入成分 疾病交集基因，隱藏網(wǎng)絡(luò)無聯(lián)系的節(jié)點，設(shè)定最低交互評分為0.4，構(gòu)建PPI（protein-protein interaction network）網(wǎng)絡(luò)。據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)用Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化分析，根據(jù)Degree值篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（Hub 基因），構(gòu)建關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體（Gene ontology，GO）富集分析

GO 富集分析包括包括生物過程（Biological process, BP）、細胞組分（Cellular component, CC）和分子功能（Molecular function,MF）3 方面。在Metascape[16]（https://metascape.org/）數(shù)據(jù)庫導入交集基因，分別進行GOBP、GOCC 和GOMF 分析，P ＜0.01。

1.7 京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析

KEGG Pathway 分析通過基因富集分析得出關(guān)鍵通路。將交集基因?qū)隡etascape，選擇P ＜0.01 進行KEGG Pathway 分析，利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 富集柱狀圖及KEGG富集氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 青風藤-穿山龍化學成分篩選

在TCMSP 平臺搜索獲得化學成分，青風藤16個，穿山龍9 個，按OB≥30%，DL≥0.18 篩選后，共獲得有效成分9 個，查閱文獻[17]發(fā)現(xiàn)穿山龍中有效成分薯蕷皂苷元、纖細薯蕷皂苷已有與疾病相關(guān)研究，故補充這2 個成分，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得其成分結(jié)構(gòu)信息，見表1。

表1 青風藤 穿山龍有效成分Table 1 The effective components of Caulis Sinomenii-Rhizoma Dioscoreae Nipponicae Herb Pairs

2.2 化合物疾病靶點篩選

在PharmMapper 服務(wù)器獲得有效成分的蛋白質(zhì)靶點，經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為基因靶點，獲得青風藤成分的靶點基因573 個，穿山龍成分靶點基因954 個，去除重復基因，共獲得青風藤 穿山龍藥對有效成分靶點基因297 個。

2.3 強直性脊柱炎疾病靶點篩選

OMIM數(shù)據(jù)庫獲得AS靶點基因108 個；DrugBank疾病靶點篩選數(shù)據(jù)庫獲得AS疾病蛋白質(zhì)靶點348 個，經(jīng)Uniprot 轉(zhuǎn)化為基因靶點；在GeneCards 數(shù)據(jù)庫搜索AS疾病相關(guān)基因共2123個，按Relevancescore ＞1.08篩選，獲得627個疾病靶點基因，將3個數(shù)據(jù)庫所獲得的疾病基因整合，去除重復項，得到816 個AS 靶點基因。通過Excel 函數(shù)獲得成分 疾病交集基因56 個，并繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 青風藤 穿山龍藥對與強直性脊柱炎交集基因韋恩圖Fig.1 Intersection genes from the Venn diagram

2.4 藥物 成分 疾病 靶點網(wǎng)絡(luò)

將青風藤 穿山龍治療AS 的成分 疾病基因?qū)隒ytoscape 3.7.2 軟件得到“藥物 成分 交集靶點疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。圖中正方形代表疾病，正六邊形代表藥物，圓形代表藥物有效成分，菱形代表青風藤穿山龍藥對藥物成分對應(yīng)的基因靶點，三角形代表其與疾病交集基因，同時圖形面積代表連結(jié)節(jié)點數(shù)，面積越大代表連結(jié)節(jié)點越多。

圖2 藥物 成分 靶點 疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 TCM component target disease network

2.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

在String 平臺導入交集基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共有節(jié)點56 個，邊數(shù)186 條，平均節(jié)點度（average node degree）6.64。經(jīng)Cytoscape 可視化分析，隱去游離節(jié)點，見圖3。其中圓圈表示基因節(jié)點，節(jié)點面積與連接度（Degree值）的大小成正比，節(jié)點之間連線的粗細與Combine score 的大小成正比。在Cytoscape 進行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)Degree 值篩選關(guān)鍵基因（Hub 基因），選擇Degree值前10 的基因構(gòu)建關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)。如圖4 關(guān)鍵基因依次是ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2、F2、PPARG、IL2、CYP19A1 和NR3C1。

圖3 交集基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of intersecting genes

圖4 關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram of hub genes

2.6 GO功能富集分析

GO 功能富集分析結(jié)果得到GOBP 739 條，GOCC 19 條，GOMF 79 條。按p-value 值從小到大篩選GOBP前20 條，GOCC 和GOMF 各前10 條，繪制富集柱狀圖，主要富集分析結(jié)果如圖5。

圖5 GO 功能富集圖Fig.5 Histogram of GO functional enrichment analysis

2.7 KEGG通路富集分析結(jié)果

在Metascape 對交集基因進行KEGG 通路富集分析，共得到74 條通路，按P-value 值從小到大排列，去除癌癥相關(guān)通路，取前25 條通路制作富集氣泡圖，見圖6。結(jié)果顯示，交集基因KEGG 通路主要富集如下：Steroid hormone biosynthesis（類固醇激素生物合成）、Ovarian steroidogenesis（卵巢類固醇生成）、Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450（細胞色素P450 對異種生物的代謝）、PPAR signaling pathway（PPAR 信號通路）、Complement and coagulation cascades（補體和凝血級聯(lián)）、foxo signaling pathway（foxo信號通路）、Endocrine resistance（內(nèi)分泌抵抗）、Longevity regulating pathway（長壽調(diào)節(jié)通路）、HIF-1 signaling pathway（HIF-1 信號通路）、AMPK signaling pathway（AMPK信號通路）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號通路）、Axon guidance（軸突導向）、T cell receptor signaling pathway（T 細胞受體信號通路）和insulin resistance（胰島素抵抗）。

圖6 KEGG 通路富集圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG functional enrichment analysis

3 討論

3.1 中藥與化學成分

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，青風藤有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和降血壓作用[18]。穿山龍具有明顯的抗炎作用，此外還有鎮(zhèn)痛、抗疲勞、抗氧化、降尿酸及耐缺氧作用[19]。青風藤和穿山龍兩藥配伍使用是胡蔭奇教授治療強直性脊柱炎的特色經(jīng)驗用藥，用于治療寒濕痰瘀痹阻型大僂。除此之外，王慶國[21]治療強直性脊柱炎的經(jīng)驗方穿藤通痹湯中也有這兩藥相須為用，以藤類之屬，可通經(jīng)入絡(luò)，通利祛邪[20]。溫啟宗認為青風藤與穿山龍配伍治療大僂及其他痹癥，可散風寒濕痹，活絡(luò)止痛，善治腰背疼痛[21]。

薯蕷皂苷元（Dgn）的抗炎作用通過減弱多種酶活性和減少IL-1 誘導的炎性因子分泌抑制中性粒細胞活化及超氧化物形成[22]。調(diào)節(jié)免疫方面Dgn 促進巨噬細胞分泌，刺激M2 細胞分化和淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高免疫調(diào)節(jié)活性[23]。此外Dgn 有保護軟骨細胞的作用，可能通過減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷實現(xiàn)[24]。纖細薯蕷皂苷也與保護骨細胞相關(guān)，通過下調(diào)破骨細胞分化相關(guān)基因抑制破骨細胞形成和吸收[25]。

青藤堿（SIN）的抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用主要是降低炎性因子水平和抑制巨噬細胞活化遷移過程。SIN 可以下調(diào)多種炎性因子水平，通過阻斷活化的TLR4/MyD88/NF- B 信號通路，SIN抑制巨噬細胞遷移及免疫應(yīng)答，并促進巨噬細胞自噬[26,27]。SIN 抑制TNF-誘導分泌，調(diào)節(jié)體內(nèi)TH17/Treg 的失衡，抑制成骨分化從而減輕關(guān)節(jié)炎、減少骨侵蝕[28]。在鎮(zhèn)痛方面，SIN可以改善神經(jīng) 免疫失衡，抑制氧化應(yīng)激和慢性疼痛狀態(tài)的中樞致敏[29]。

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因有ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2 和IL2。血清白蛋白（ALB）有良好的結(jié)合轉(zhuǎn)運能力，是維持血漿膠體滲透壓的重要成分。ALB在AS患者中是一個有效的評價指標，缺血修飾白蛋白（IMA）、纖維蛋白原與白蛋白比值在AS 患者中明顯升高，均與疾病活動相關(guān)[30,31]。胰島素樣生長因子1（IGF1）具有高效的促生長活性，在間充質(zhì)干細胞中起到促進增殖和成骨細胞分化，促進骨形成的作用[32]。此外IGF-I通過阻斷PI3K/AKT/TLR4 通路減弱IL-6 和TNF- 分泌，起到抗炎效果[33]。雌激素受體（ESR1）和雄激素受體（AR）等類固醇激素及其受體參與調(diào)節(jié)靶組織中的細胞增殖和分化。雌二醇可減少破骨細胞生長因子產(chǎn)生，起到保骨作用[34]。AR 能夠促進M2 巨噬細胞分化及自噬，從而減輕炎癥反應(yīng)和組織凋亡，促進組織的修復[35]。MMP2 是一種廣泛存在的金屬蛋白酶，中國人群中MMP-2 rs243865 C/T 基因的多態(tài)性可能與AS風險有關(guān)[36]。AS 患者中下調(diào)MMP-2 表達可使成骨細胞分化和骨形成中的轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)，防止異位骨化中的成骨細胞分化[37]。白細胞介素-2（IL2）是T 細胞增殖的必要生長因子，是人體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的核心物質(zhì)。AS 患者血清中IL-2 水平顯著升高，且與炎癥反應(yīng)標志物、疾病活動指數(shù)等指標呈正相關(guān)，經(jīng)治療后可降低[38]。AS 患者外周血中CD4+Treg 和CD8+Treg 細胞減少，IL-2 處理可糾正Treg/Th17 細胞失衡，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[39]。

3.3 KEGG通路

KEGG 通路富集分析顯示，青風藤 穿山龍藥對治療AS 的交集基因靶點富集在類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成、補體和凝血級聯(lián)、foxo信號通路、AMPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和T 細胞受體信號通路。

類固醇激素包括性激素和皮質(zhì)激素。在治療AS中，局部注射糖皮質(zhì)激素有利于改善關(guān)節(jié)炎和附著點炎，這得益于其抗炎、抑制免疫功能，但不建議全身糖皮質(zhì)激素長期應(yīng)用。雌激素E2 缺乏可使Th17 細胞分化增加，E2 可抑制IL-17 介導的破骨細胞分化，減少骨質(zhì)流失[40]。E2 還可以降低小鼠中TNF、干擾素-和IL-17A 的表達起到抗炎作用[41]。另一種類固醇激素維生素D，一方面可調(diào)節(jié)骨組織鈣磷吸收，另一方面可參與調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)，維生素D 在固有免疫早期可增強細胞募集和細胞因子分泌，并通過負反饋機制防止廣泛的炎癥和組織破壞；在適應(yīng)性免疫中促進初始T細胞活化，增強抗原呈遞，間接調(diào)節(jié)DC 功能[42]。較高的血清維生素D 水平是AS 的保護因素，維生素D活化產(chǎn)物25OHD水平與AS患病風險呈負相關(guān)[43,44]。

補體和凝血級聯(lián)通路中，補體系統(tǒng)是固有免疫中的重要介質(zhì)，補體系統(tǒng)異常則會導致慢性炎癥和組織損傷，減少補體激活可以降低AS 中心血管疾病發(fā)病率[45]。在AS 中可見補體激活產(chǎn)物沉積，攻擊成骨細胞和破骨細胞，使用補體抑制劑能有效阻止免疫細胞的增殖和分化[46]。凝血系統(tǒng)的激活與炎癥性疾病的疾病活動有關(guān)，axSpA 患者體內(nèi)纖維蛋白原和D-二聚體升高，且與炎癥及疾病活動度呈正相關(guān)[47]。

foxo 信號通路中FoxO 轉(zhuǎn)錄因子通過控制T、B淋巴細胞的功能和發(fā)育，調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受，在FoxO活性失調(diào)時導致慢性炎癥和自身免疫[48]。Foxo1失活會抑制CD8+T 細胞反應(yīng)中的aTreg 細胞遷移，過度激活則會導致CD8+T細胞依賴性的炎癥疾病[49]。

AMPK信號通路、PI3K-Akt信號通路與骨形成和代謝相關(guān)。AMPK 是一種蛋白激酶，在AS 中，它可以激活自噬刺激成骨細胞的分化和礦化及負向調(diào)節(jié)抑制破骨細胞的分化和功能[50]。PI3K/Akt通路可調(diào)節(jié)骨髓中的細胞增殖遷移和成骨分化[51]。PI3K-Akt通路被抑制后，影響成骨細胞的早期分化和晚期鈣化，破骨細胞形成受抑制[52]。兩個通路共同起到促進成骨細胞存活、抑制破骨細胞形成和抑制成纖維細胞轉(zhuǎn)化成骨的作用。

T 細胞受體信號通路是T 淋巴細胞增殖、分化，激活免疫效應(yīng)的重要組成，在HLA-B27 陽性的AS患者中具有高度同源性TCR 的T 細胞克隆，表明AS相關(guān)的T 細胞克隆型的存在和富集參與了發(fā)病[53]，當AS 處于高活動度時，病理性CD4+T 細胞可能因為與CD8+共享TCR 而識別HLA-B27 呈遞的自身抗原，激活T 細胞不均衡擴增[54]。

4 小結(jié)

綜上所述，青風藤 穿山龍藥對治療強直性脊柱炎，主要通過化學成分薯蕷皂苷元、纖細薯蕷皂苷與青藤堿，關(guān)鍵靶點基因可能是ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2 和IL2，主要信號通路為類固醇激素生物合成、補體和凝血級聯(lián)、AMPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、foxo 信號通路和T 細胞受體信號通路，多靶點、多通路共同起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制炎癥過程和調(diào)控骨細胞活性等作用。但由于個別藥物化學成分靶點信息較少，各數(shù)據(jù)庫收錄、匹配靶點算法不同，藥物成分、靶點基因與疾病之間的關(guān)系還需要進一步實驗驗證。