孫月，王磊，胡宇，楊威，許依能，紀(jì)登杰，陳麗*

（1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；3.江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

魷魚作為十分重要的海洋經(jīng)濟(jì)產(chǎn)物[1]，2019年國內(nèi)海洋捕撈量約為29萬噸，其中江蘇地區(qū)年產(chǎn)量為6838噸[2]。目前，國內(nèi)魷魚的加工制品均為初加工產(chǎn)品，深加工的高值化產(chǎn)品較少，下腳料利用率低[3]。魷魚內(nèi)臟約占魷魚體重的15%[4]，富含脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)元素等，具有良好開發(fā)前景[5]。

章魚胺（octopamine，OA）作為一種天然存在的生物胺[6]，最早是從章魚的唾液腺中分離[7]，類似于神經(jīng)遞質(zhì)——去甲腎上腺素[8]。已有研究表明，章魚胺可加強(qiáng)小鼠脂肪細(xì)胞的脂解作用、促進(jìn)人脂肪細(xì)胞的葡萄糖吸收[9]，可見在治療肥胖癥和II型糖尿病方面，章魚胺有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可以單獨(dú)或與其它原料聯(lián)合用于減肥與糖尿病的治療，也可作為健康食品原料、食品乃至臨床藥物的輔助制劑[10-11]。章魚胺的生物活性研究[12-13]以及檢測方法[14-16]也受到廣泛關(guān)注。

目前，魚露和枳實(shí)是天然章魚胺的主要來源[17]，但工藝相對復(fù)雜且提取量較少，開發(fā)程度相對有限[18]。本試驗(yàn)以提高章魚胺得率為目標(biāo)，采用5%三氯乙酸為提取劑提取魷魚內(nèi)臟中的章魚胺，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化章魚胺提取工藝條件，并以抗壞血酸為陽性對照，考察章魚胺體外抗氧化活性，以期為海洋生物高值化利用和開發(fā)天然抗氧化劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魷魚凍品：市售；章魚胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane THAM，Tris]（ 均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；乙腈（色譜純）：德國達(dá)姆施塔特公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Aglient 1260，配有紫外檢測器）：美國Aglient公司；高剪切均質(zhì)乳化機(jī)（D-500）：德國WIGGENS有限公司；分析天平（TP-4101）：美國丹佛儀器有限公司；疊加式恒溫振蕩器（IS-RDS3）：美國精騏有限公司；冷凍高速離心機(jī)（Allegra X-30R）：美國BECKMAN有限公司；快速混勻器（XK96-A）：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

魷魚解凍，取內(nèi)臟，使用高剪切均質(zhì)乳化機(jī)勻漿，置于-20℃冰箱中貯存。

1.3.2 章魚胺提取

準(zhǔn)確稱取魷魚內(nèi)臟勻漿10 g，加入適量的5%三氯乙酸，置于恒溫振蕩器進(jìn)行振蕩提取，5 000 r/min離心10 min，收集上清液。準(zhǔn)確移取10 mL上清液于25 mL離心管中，調(diào)節(jié)溶液pH值為12，加入10 mL正丁醇/三氯甲烷（體積比1∶1）混合溶液，振蕩萃取15 min，5 000 r/min離心10min，收集上清液。將所得萃取液進(jìn)行濃縮，加入0.1mol/L鹽酸振蕩，過0.45μm微孔濾膜待測。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別設(shè)置不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、提取溫度（20、30、40、50、60 ℃） 和料液比 [1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g/mL）]提取魷魚內(nèi)臟中章魚胺。以章魚胺得率為評價(jià)指標(biāo)，考察不同因素條件對魷魚內(nèi)臟中章魚胺得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以魷魚內(nèi)臟中章魚胺得率（Y）為響應(yīng)值，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，按照Box-Behnken中心組合法設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 章魚胺含量測定

1.3.5.1 高效液相色譜條件

色譜柱：AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鈉（體積比40∶60），pH7.5；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；紫外檢測波長：284 nm。

1.3.5.2 章魚胺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相溶解，獲得濃度為1 mg/mL的母液。將母液稀釋成不同倍數(shù)，配制成濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL的溶液。分別精確吸取10μL，在1.3.5.1條件下進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到章魚胺回歸方程為Y=5.689 4X-0.178 5（R2=0.999 8）。

1.3.5.3 章魚胺得率計(jì)算

章魚胺得率計(jì)算公式如下。

式中：Y為章魚胺得率，mg/g；C為樣品中章魚胺的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為稱取魷魚內(nèi)臟的質(zhì)量，g。

1.3.6 章魚胺體外抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[19]中DPPH自由基清除能力的測定方法。用乙醇分別配制 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mg/mL章魚胺樣品待測液。取2 mL不同濃度的樣品溶液和1 mmol/L的DPPH溶液1 mL，充分搖勻后避光放置30 min，在517 nm測定其吸光度A1；以2 mL無水乙醇和1 mL DPPH溶液按上述方法操作測定其吸光度A0，用作空白對照；將2 mL樣品和1 mL乙醇溶液混合，按上述方法操作測定其吸光度A2。配制相同濃度的VC溶液用作陽性對照。不同濃度的樣品對DPPH自由基的清除率根據(jù)下列公式計(jì)算。

1.3.6.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[20]中超氧陰離子自由基清除能力的測定方法。用乙醇分別配制 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mg/mL章魚胺樣品待測液。取2.6 mL 50 mmol/L的Tris-HCl、0.5 mL 10 mmol/L的鄰苯三酚溶液于試管中，加入樣品溶液1 mL，快速混勻并于20℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，325 nm下測其吸光度A1；以1 mL無水乙醇代替樣品溶液按上述方法操作測定其吸光度A0，用作空白對照；用0.5 mL乙醇溶液替代10 mmol/L鄰苯三酚溶液，按上述方法操作測定其吸光度A2。配制相同濃度的VC溶液用作陽性對照。不同濃度的樣品對超氧陰離子自由基的清除率根據(jù)下列公式計(jì)算。

1.3.6.3 羥自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[21]中羥自由基清除能力的測定方法。用乙醇分別配制 0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mg/mL章魚胺樣品待測溶液。向試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，2 mL不同濃度的樣品溶液，最后加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL開始反應(yīng)，充分搖勻后，置于37℃水浴鍋中保溫反應(yīng)30 min，在510 nm測定其吸光度A1；以2 mL無水乙醇代替樣品溶液按上述方法操作測定其吸光度A0，用作空白對照；用1 mL乙醇溶液替代6 mmol/L H2O2溶液，按上述方法操作測定其吸光度A2。配制相同濃度的VC溶液用作陽性對照。不同濃度的樣品對羥自由基的清除率根據(jù)下列公式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，運(yùn)用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取時(shí)間對章魚胺得率的影響見圖1。

圖1 提取時(shí)間對章魚胺得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction yield of octopamine

由圖1可知，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，章魚胺得率達(dá)到最大。但隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長，章魚胺得率下降，這可能是由于提取時(shí)間過長導(dǎo)致章魚胺降解，得率下降。因此選擇提取時(shí)間1、2、3 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

提取溫度對章魚胺得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對章魚胺得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction yield of octopaminea

由圖2可知，章魚胺的得率隨著提取溫度的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。提取溫度為30℃時(shí)，章魚胺得率達(dá)到最大值。繼續(xù)升高提取溫度會(huì)使章魚胺得率下降，這是因?yàn)樵谔崛〉倪^程中，溫度的升高會(huì)使章魚胺分解。因此選擇提取溫度20、30、40℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

料液比對章魚胺得率的影響見圖3。

圖3 料液比對章魚胺得率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of octopamine

由圖 3 可以看出，當(dāng)料液比為 1∶2（g/mL）～1∶5（g/mL）時(shí)，章魚胺得率隨著溶劑體積的增加而增大，隨后，再增加溶劑體積，得率減小。這可能是溶劑達(dá)到一定量時(shí)，溶劑中的章魚胺濃度達(dá)到飽和，進(jìn)一步增大溶劑體積可能導(dǎo)致其他物質(zhì)的溶出。因此選擇料液比1∶4、1∶5、1∶6（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

依照單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取提取時(shí)間、提取溫度、料液比這3個(gè)因素作為自變量，章魚胺得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

經(jīng)多元擬合，得到章魚胺得率的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=6.04+0.037A+0.78B+0.62C+0.012AB+0.41AC+0.078BC-1.46A2-1.06B2-1.67C2。

回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model

由表3可知，該模型的P=0.000 1＜0.01，失擬項(xiàng)P=0.751 0＞0.05，表明該回歸模型極顯著，擬合度高，誤差小，可以用來對不同條件下章魚胺提取效果進(jìn)行預(yù)測和分析。一次項(xiàng)B和C影響均為極顯著，另外，A2、B2、C2影響均為極顯著，交互項(xiàng)AB、AC、BC均不顯著。從F值可以得出3個(gè)因素對章魚胺得率影響大小順序：提取溫度B＞料液比C＞提取時(shí)間A。該試驗(yàn)?zāi)Ｐ突貧w方程的 R2=0.978 0、R2Adj=0.911 9、信噪比為 10.46 6，C.V.=10.87%，表明該模型回歸方程可靠性和可信度較高，能解釋91.19%的響應(yīng)值變化，方程合理。

2.3 交互作用分析

3個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖4～圖6所示，曲線梯度反映各交互作用對章魚胺得率的影響程度，響應(yīng)面越陡峭則表示該交互作用對章魚胺得率的影響越大[22-23]。

圖4 提取時(shí)間和提取溫度交互作用對章魚胺得率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of the interaction effect of extraction time and extraction temperature on the extraction yield of octopamine

圖5 提取時(shí)間和料液比交互作用對章魚胺得率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the interaction effect of extraction time and material-to-liquid ratio on the extraction yield of octopamine

圖6 提取溫度和料液比交互作用對章魚胺得率的響應(yīng)面圖與等高線Fig.6 Response surface plot and contour plot of the interaction effect of extraction temperature and material-to-liquid ratio on the extraction yield of octopamine

由圖4～圖6可知，等高線圖均接近圓形，相應(yīng)曲面坡度較平緩，可見章魚胺得率受提取時(shí)間、提取溫度、料液比兩兩交互作用的影響較小。

2.4 最優(yōu)工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件分析預(yù)測得到章魚胺最佳提取條件：提取時(shí)間 2.04 h、提取溫度 33.75℃、料液比 1∶5.2（g/mL），此時(shí)章魚胺得率為6.25 mg/g。為驗(yàn)證該試驗(yàn)的可行性，結(jié)合實(shí)際操作，將試驗(yàn)條件分別修正為提取時(shí)間2.0 h、提取溫度 33 ℃，料液比 1∶5.2（g/mL），進(jìn)行 3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到章魚胺得率為6.51 mg/g，與預(yù)測值接近。

2.5 章魚胺體外抗氧化活性測定結(jié)果

DPPH自由基清除率測定結(jié)果見圖7。

圖7 章魚胺和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effects of DPPH free radicals by octopamine and VC

由圖7可知，章魚胺對DPPH自由基清除能力較強(qiáng)。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著章魚胺和VC溶液的質(zhì)量濃度增大，對DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)章魚胺的質(zhì)量濃度大于1.1 mg/mL時(shí)，章魚胺的DPPH自由基清除率趨于平緩。章魚胺具有良好的DPPH自由基清除能力。

超氧陰離子自由基清除率測定結(jié)果見圖8。

圖8 章魚胺和VC對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.8 The scavenging effects of super-oxygen anions free radicals by octopamine and VC

由圖8可知，當(dāng)章魚胺和VC質(zhì)量濃度增加時(shí)，其超氧陰離子自由基清除率也在持續(xù)增大。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.1 mg/mL時(shí)，章魚胺的超氧陰離子自由基清除率為62.0%。以樣品質(zhì)量濃度對超氧陰離子自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合后，計(jì)算得到章魚胺和VC的IC50值分別為0.774 3 mg/mL和0.624 7 mg/mL。

羥自由基清除率測定結(jié)果見圖9。

圖9 章魚胺和VC對羥自由基的清除作用Fig.9 The scavenging effects of hydroxyl free radicals by octopamine and VC

由圖9可知，在0.1mg/mL～1.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，章魚胺和VC對羥自由基清除率隨著濃度的增加而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，章魚胺的羥自由基清除率達(dá)到50%左右。雖然章魚胺對羥自由基的清除能力明顯弱于VC（VC的IC50值為0.7411 mg/mL），但是仍可以表明章魚胺具有一定的羥自由基清除能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用5%三氯乙酸提取魷魚內(nèi)臟中的章魚胺，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化章魚胺提取工藝，得到最佳提取工藝條件為提取時(shí)間2.0 h、提取溫度為 33 ℃、液料比 1∶5.2（g/mL），所得章魚胺得率為6.51 mg/g，與預(yù)測值6.25 mg/g較為接近，誤差較小?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，章魚胺對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及羥自由基的清除能力均與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)章魚胺質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL時(shí)，對DPPH自由基清除率達(dá)到50%左右；章魚胺質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，對羥自由基的清除率達(dá)到50%左右；章魚胺質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL時(shí)，對超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到60%以上。

章魚胺作為天然產(chǎn)物，具有較高的安全性，本試驗(yàn)可為提升魷魚資源的利用效率、章魚胺工業(yè)化生產(chǎn)以及生產(chǎn)天然抗氧化劑提供依據(jù)。