陸杜鵑，黃翠萍，羅茂果，周 蓮，代 倩，鐘婷婷，陳櫟穎，李 鑫，黎杉珊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 四川雅安 625014）

單氰胺（Cyanamide）又名氨基氰，是一種良好的植物生長調(diào)節(jié)劑[1]，可以促使蔬菜和水果提前萌芽、開花、結(jié)果、成熟、上市[2]，在番茄、葡萄、櫻桃等經(jīng)濟效益較高的蔬菜和水果產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用[3-4]。然而，單氰胺在水中易溶解[5]，易通過農(nóng)業(yè)生產(chǎn)排放到自然環(huán)境中，從而影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和平衡[6]。此外，單氰胺有劇毒，能夠腐蝕人體皮膚組織，刺激呼吸道[7]，能引起接觸性皮炎[8]、頭暈頭痛和惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[9-12]，食品中的單氰胺殘留對人類健康有著潛在的危險。一方面，GB 2763-2019 《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定0.05 mg/kg（臨時限量）為葡萄的單氰胺最大殘留限量[13]；另一方面，缺乏相應(yīng)的行業(yè)標準及國家標準，有關(guān)單氰胺檢測的方法也不多[14]?，F(xiàn)有食品中單氰胺的分析方法主要有：比色法[15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]、紅外光譜法[17]、脈沖電化學(xué)檢測法[18]、電位滴定法[19]等。這些方法雖準確、可靠，但靈敏度尚有不足。建立高靈敏食品中單氰胺殘留量的檢測方法，對于促進食品安全和保障人類健康具有著非常重要的意義。

單氰胺結(jié)構(gòu)中含有活潑基團氨基，可通過柱前衍生化反應(yīng)后用高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLCMS）間接測定。衍生化反應(yīng)可在其分子上增加發(fā)色基團，改變其色譜行為，提高其質(zhì)譜霧化及離子化效率，大大提高其HPLC-MS 檢測靈敏度[4]。測定單氰胺常用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛[20]、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯[21]、丹磺酰氯[22]、1，2-萘醌-4-磺酸鉀[23]等。由于這些衍生試劑具有衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、對光敏感、專一性不強、操作復(fù)雜等問題，因此合成一種新的衍生化試劑就顯得非常必要。本研究合成了一種以羅丹明B 為母體結(jié)構(gòu)，琥珀酰亞胺基為活性基團，對單氰胺高效、專一的新型化學(xué)衍生試劑——羅丹明BN-琥珀酰亞胺酯（RBS），對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行表征，并基于RBS 柱前衍生和HPLC-MS 技術(shù)建立一種高靈敏、高準確、高效率的單氰胺檢測方法，用于檢測葡萄和番茄中的單氰胺殘留量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葡萄和番茄，購于雅安市農(nóng)貿(mào)市場。

羅丹明B （96%）（RB）、N-羥基琥珀酰亞胺（98%）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）（98%）、單氰胺（98%），北京百靈威科技有限公司；乙腈（HPLC級）、甲醇（HPLC 級），成都市凌微科技有限公司；乙酸乙酯（HPLC 級）、無水乙醇（HPLC 級），成都市科隆化學(xué)品有限公司；甲酸（LC-MS Ultra 級），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

Bruker AVIII 600 MHz 型核磁共振波譜儀，布魯克科技有限公司；Agilent 6120 型質(zhì)譜儀、Agilent 1260 型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Thermo Scientific NicoletIS10 型傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 RBS 合成及結(jié)構(gòu)表征

1.2.1 RBS 合成 RBS 合成路線如圖1所示。羅丹明B 2.4 g 溶于100 mL 乙腈中，加熱至約45 ℃加入N-羥基琥珀酰亞胺（HOSu）0.6 g 邊攪拌邊由恒壓滴液漏斗滴加入含二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）1.2 g 的乙腈溶液50 mL，維持45 ℃反應(yīng)1 h 再室溫攪拌反應(yīng)20 h[24]。過濾除去反應(yīng)生成的粉末，濾液蒸除乙腈，所得黏稠狀固體用干燥乙醚洗滌多次，所得粗產(chǎn)品用乙腈/乙醚重結(jié)晶，得亮綠色晶體。

圖1 RBS 的合成路線Fig.1 Synthesis route of RBS

1.2.2 核磁共振氫譜表征 以CD3CN 為溶劑測定RBS 的核磁共振氫譜，600.13 MHz 為質(zhì)子共振頻率，四甲基硅烷為內(nèi)標，298 K 為試驗溫度[25]。

1.2.3 傅里葉紅外光譜表征 在用溴化鉀為背景、儀器分辨率為4 cm-1、壓力為15 kPa 的條件下，掃描次數(shù)32 次[26]，使用壓片法測定。

1.2.4 高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定 將羅丹明B 和合成的RBS 稱取適量，用無水乙醇配置成一定濃度，過0.22 μm 有機相濾膜，用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行上機測定。

1.3 樣品前處理

樣品前處理參考蘭豐等[2]和Cheng 等[22]的方法并做了改進。分別準確稱取5 g 葡萄樣品和番茄樣品于100 mL 燒杯中，加入25 mL 乙酸乙酯，超聲15 min，加入30 g 無水硫酸鈉，持續(xù)渦旋3 min，在4 ℃下以4 000 r/min 離心15 min，快速定性濾紙過濾，用15 mL 乙酸乙酯沖洗3 次，收集所有濾液至100 mL 燒杯中，用0.22 μm 有機相濾膜過濾于50 mL 具塞玻璃試管中，于40 ℃氮吹儀上吹干，用1 mL 無水乙醇復(fù)溶，再用0.22 μm 有機相濾膜過濾至進樣品瓶中，備用。

1.4 標準溶液配制

準確稱取一定量的單氰胺標準品于10 mL 容量瓶中，使用色譜級的無水乙醇定容，配制成0.1 mol/L 的儲備液，再根據(jù)實際使用情況進行稀釋，最好現(xiàn)配現(xiàn)用[25]。

1.5 單氰胺衍生化

準確稱取一定量的RBS 使用色譜級的無水乙醇定容，配制成一定濃度的衍生試劑，將制得的衍生化試劑加入至一定量的單氰胺標準溶液和樣品溶液中，60 ℃下水浴避光反應(yīng)1 h[27]，采用0.22 μm 有機濾膜過濾至進樣瓶，上機測定。

1.6 HPLC-MS 條件

1.6.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：水+0.1%甲酸；流動相B：甲醇+0.1%甲酸；梯度洗脫：0～6 min，76%～95%B；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；DAD 檢測波長：260 nm。

1.6.2 質(zhì)譜條件 霧化氣體：氮氣；干燥氣的溫度：350 ℃；駐留時間：290 ms；掃描的方式：電噴霧離子源（ESI）正離子掃描；干燥氣的流速：12.0 L/min；相對駐留時間：100.0%；檢測的模式：Scan 掃描、SIM 掃描；霧化器的壓力：275.8 kPa；碰撞誘導(dǎo)解離能量：70 V；質(zhì)荷比掃描范圍：100～1 000 u。采用碎片離子和分子離子的質(zhì)荷比進行定性分析，采用外標法質(zhì)譜峰面積進行定量分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

作圖分析使用Origin 9.0 軟件，結(jié)構(gòu)式畫圖分析采用Chem Office 2016 軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excel 2010 軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 RBS 結(jié)構(gòu)表征

與RB 進行對比，通過核磁共振氫譜對合成的RBS 進行結(jié)構(gòu)分析，RBS 和RB 在氘代乙腈中的質(zhì)子化學(xué)位移（δH）和位置歸屬在表1中列出。從表1可得，熒光探針RBS 在0.00268‰處出現(xiàn)了含4 個氫原子的峰，此為兩個CH2，即琥珀酰亞胺基中的兩個亞甲基[24]，由這一特征值可表明RB分子上成功接枝了琥珀酰亞胺基基團，RBS 已合成。并且產(chǎn)物RBS 苯環(huán)中的氫原子與RB 中相應(yīng)氫原子相比，向低場方向發(fā)生了較大化學(xué)位移變化，說明下部苯環(huán)上琥珀酰亞胺酯取代基對整個大共軛結(jié)構(gòu)的電子云分布影響顯著，使氫核外電子云密度降低。此外，從RBS 芳環(huán)區(qū)質(zhì)子的化學(xué)位移還可以看到，RBS 與RB 一樣，4 號質(zhì)子的化學(xué)位移在2 號質(zhì)子的高場區(qū)。這說明RBS 與RB一樣為開環(huán)結(jié)構(gòu)。由于苯環(huán)上琥珀酰亞胺酯結(jié)構(gòu)的存在，使RBS 無法形成內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)。據(jù)此推斷，RBS 可能會較少受環(huán)境影響，在較寬的溶劑選擇及pH 值范圍內(nèi)都具備紫外吸收及熒光發(fā)射特性。

表1 RBS、RB 的核磁共振氫譜Table 1 Nuclear magnetic resonance spectroscopy of RBS and RB

對RBS 還進行了FTIR 表征。如圖2所示，波數(shù)為2 979.50，2 931.90 cm-1的峰被指認為甲基CH3、亞甲基CH2的伸縮振動峰，在1 771.57 cm-1處的峰被指認為酯基C=O 的伸縮振動峰，1 738.84 cm-1處的峰被指認為琥珀酰亞胺C=O 的伸縮振動峰，在1 646.61，1 590.08 cm-1處的峰被指認為芳環(huán)C=C 的伸縮振動峰，在1 468.10 cm-1處的峰被指認為甲基CH3、亞甲基CH2的彎曲振動峰，在1 182.48 cm-1處的峰指認為C-O 的伸縮振動峰，在998.02，923.64，682.64 cm-1處的峰指認為芳環(huán)=C-H 的伸縮振動峰。分析結(jié)果表明，衍生產(chǎn)物中出現(xiàn)琥珀酰亞胺的信號，說明羅丹明B-N-琥珀酰亞胺衍生成功[24]，以上數(shù)據(jù)進一步證實了RBS的成功合成。

圖2 RBS 的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of RBS

2.2 RBS 的HPLC-MS 鑒定

圖3是RBS 的色譜圖（圖3a）、總離子流圖（圖3b）及質(zhì)譜圖（圖3b 內(nèi)插圖）。如圖3a所示，1.63 min 出峰的物質(zhì)是合成的RBS，由于RBS 上的琥珀酰亞胺酯基團極易水解，1.86 min 出峰物質(zhì)為RBS 在流動相中部分水解生成的RB，通過與RB 標準品的色譜圖對照得以驗證。色譜圖基線平穩(wěn)，無其它雜質(zhì)，初步證明RBS 合成成功。如圖3b所示，RBS 的質(zhì)譜峰形良好，由內(nèi)插圖可見其質(zhì)荷比為540.3，可歸屬為RBS 的準分子離子峰[M+]（RBS 分子式：C32H34N3O5，M+計算值：540.25），以上結(jié)果可證明目標化合物RBS 成功合成。

圖3 RBS 的色譜圖（a）、提取離子流色譜圖（b）及質(zhì)譜圖（b 內(nèi)插圖）Fig.3 Chromatogram （a），extracted ion current chromatogram （b） and mass spectrum（b-inset） of RBS

2.3 RBS 衍生化單氰胺

RBS 衍生化單氰胺的反應(yīng)方程式如圖4所示。單氰胺化學(xué)分子結(jié)構(gòu)簡單，分子質(zhì)量小，極性大，沒有生色基團和熒光基團，無法直接進行色譜分析[27]。然而單氰胺結(jié)構(gòu)中含有氨基，經(jīng)衍生化反應(yīng)后可以增加發(fā)色基團，改變其色譜行為。RBS 中的琥珀酰亞胺基團（NHS）與氨基基團（-NH2）交聯(lián)反應(yīng)后生成的酰胺類物質(zhì)，該物質(zhì)結(jié)構(gòu)本身就含有共軛結(jié)構(gòu)，發(fā)生衍生化反應(yīng)后，衍生產(chǎn)物會更穩(wěn)定[28-29]。此反應(yīng)靈敏且迅速，具有高選擇性、高特異性、高專一性、反應(yīng)效率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于氨基化合物的衍生[30]。

圖4 RBS 衍生單氰胺的反應(yīng)示意圖Fig.4 Schematic diagram of RBS-derived cyanamide reaction

2.4 單氰胺衍生產(chǎn)物的HPLC-MS 鑒定

對RBS 與單氰胺的物質(zhì)的量比為2∶1 反應(yīng)后的溶液進行HPLC-MS 分析。如圖5a所示，HPLC 譜中1.67 min 和1.84 min 的色譜峰可分別歸屬為RBS 及其水解產(chǎn)物RB，保留時間5.42 min 的色譜峰歸屬為衍生產(chǎn)物RBS-Cya，該峰形尖銳、對稱，可以初步判斷RBS 對單氰胺的衍生化反應(yīng)是成功的。所有物質(zhì)在6 min 內(nèi)可以完全分離，分析時間較短[31]，能夠滿足定量分析的要求。圖5b 是在正離子模式下，采用SIM 掃描模式得到RBS 衍生化單氰胺的提取離子流色譜圖，由內(nèi)插圖可見，m/z=467.2 的質(zhì)譜峰，可歸屬為RBSCya 的[M+H]+峰（RBS-Cya 分子式：C29H30N4O2，M+計算值：466.24），由此可判斷RBS 對單氰胺的衍生化反應(yīng)成功進行。

圖5 RBS-Cya 的色譜圖（a）、提取離子流色譜圖（b）及質(zhì)譜圖（b 內(nèi)插圖）Fig.5 Chromatogram（a），extracted ion chromatogram （b） and mass spectrum （b-inset） of RBS-Cya

2.5 衍生化條件的優(yōu)化

試驗優(yōu)化的條件有衍生溶劑、衍生劑濃度、衍生溫度、衍生時間。考察了不同反應(yīng)溶劑對衍生化效率的影響，分別選用色譜級的乙腈、色譜級的無水乙醇、色譜級的甲醇作為反應(yīng)溶劑進行優(yōu)化[27]，當(dāng)以無水乙醇為反應(yīng)溶劑時（圖6a），峰面積達到最大，反應(yīng)最為完全，反應(yīng)效率最高，且無水乙醇毒性較低，價格低廉。此外，研究了衍生試劑RBS濃度為1，2，3，4，5，6，7，8 mmol/L 時的衍生效果，圖6b 顯示當(dāng)RBS 濃度為4 mmol/L 時，衍生產(chǎn)物峰面積最大，信號最強，衍生化效果最好。對反應(yīng)溫度進行研究，分別在30，40，50，60，70，80，90 ℃密封避光水浴加熱條件下使RBS 和單氰胺避光反應(yīng)，圖6c 表明在60 ℃水浴加熱條件下，其反應(yīng)時間短，轉(zhuǎn)化率高，這與趙華鋒等[27]研究的結(jié)果一致。60 ℃后反應(yīng)效率隨著溫度的升高逐漸變低，這可能是因為在高溫水浴條件下，部分水蒸氣滲透入反應(yīng)體系，使得RBS 易水解成RB，同時單氰胺在加熱的情況下，很容易水解生成尿素，在較高溫度時尿素直接生成二氧化碳和氨[32]，使衍生化效率降低。最后，在2 h 內(nèi)（0，30，60，90，120 min）研究了反應(yīng)時間對衍生效率的影響（圖6d），結(jié)果表明反應(yīng)60 min 時反應(yīng)效率最大且穩(wěn)定，這與王旭群等[33]研究的結(jié)果一致，60 min 后反應(yīng)效率隨著時間的延長逐漸變低，可能是在長時間的水浴加熱條件下，衍生化試劑RBS 的性質(zhì)有所變化，導(dǎo)致副反應(yīng)發(fā)生。綜上，RBS 衍生化單氰胺的優(yōu)化條件為：溶劑：無水乙醇；衍生試劑濃度：4 mmol/L；溫度：60 ℃；時間：60 min。

圖6 衍生條件的優(yōu)化Fig.6 Optimization of derivative conditions

2.6 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將RBS 與一定濃度的單氰胺標準溶液發(fā)生衍生化反應(yīng)，通過質(zhì)譜測定來進行參數(shù)優(yōu)化[25]。因為衍生產(chǎn)物含有雜環(huán)原子，在電噴霧離子源（ESI）正離子模式下掃描可以得到H+形成準分子離子峰[M+H]+[25]，所以選擇電噴霧離子源（ESI）正離子模式進行測定。先采用全掃描模式進行掃描，選擇母離子，再采用SIM 掃描模式，尋找出響應(yīng)最高的兩個碎片離子峰，最后選擇定性離子（234.10 m/z和467.20 m/z）和定量離子（466.20 m/z）作為RBS衍生化單氰胺的質(zhì)譜采集參數(shù)。

2.7 方法檢出限 （LOD）、線性范圍、定量限（LOQ）以及日內(nèi)和日間精密度

本試驗采用線性回歸分析方法，橫坐標為濃度、縱坐標為定量離子峰面積進行計算。通過加標回收法以最低測定濃度的信噪比S/N=3 來確定檢出限，以最低測定濃度的信噪比S/N=10 來確定定量限。通過測定日內(nèi)和日間精密度（n=3）來考察該方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，對標準樣品添加兩個的不同濃度，加標濃度為0.1 mmol/L 和0.4 mmol/L，每種添加濃度平行測定3 次，以3 次平行結(jié)果的相對標準偏差進行評估分析。如表2所示，本方法在0.005～5 mmol/L 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9969，該方法的檢出限為0.001 mmol/L，定量限為0.0025 mmol/L，日內(nèi)精密度為1.97%～3.63%，日間精密度為2.21%～4.18%，本方法在靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性方面具有明顯優(yōu)勢。因此，RBS 柱前衍生結(jié)合HPLC-MS 法不僅能用于單氰胺高靈敏的定量檢測，還可作為其它氨基化合物的一種分析檢測方法，從理論及實踐來說，高靈敏分析方法都具有很高的開發(fā)價值。

表2 方法線性范圍、LOD、相關(guān)系數(shù)、LOQ、日內(nèi)和日間精密度（n=3）[34]Table 2 Linear range，LOD，correlation coefficient，LOQ，intra-day and inter-day precision of the method （n=3）[34]

2.8 樣品精密度（RSD）和加標回收率

本試驗采用加標回收對空白樣品添加3 個不同的濃度，加標濃度為0.5，1，2 mmol/L，3 個加標濃度都平行測定3 次。該方法的精密度是通過3次平行結(jié)果的RSD 來分析的。由表3可知，82.10%～105.21%為葡萄樣品的回收率，RSD 為1.63%～3.35%；測得番茄樣品的回收率為77.56%～102.17%，RSD 為1.88%～4.04%。說明該方法的準確度和精密度都較好。

表3 葡萄樣品和番茄樣品3 個加標濃度下單氰胺的平均回收率和RSD（n=3）Table 3 Average recovery rate and RSD of cyanamide at 3 spiked concentrations for grape samples and tomato samples （n=3）

2.9 實際樣品中的單氰胺含量

按所研究的方法對雅安市農(nóng)貿(mào)市場的葡萄、番茄中單氰胺殘留量進行了測定，葡萄樣品中的單氰胺的含量為0.016 mmol/L，番茄樣品中的單氰胺含量為0.009 mmol/L。而GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定0.05 mg/kg（臨時限量）為葡萄的單氰胺最大殘留限量[13]，與之相比，本試驗測定的葡萄樣品單氰胺含量超標。

表4 實際樣品中的單氰胺含量Table 4 The content of cyanamide in actual samples

3 結(jié)論

本研究設(shè)計合成了新型琥珀酰亞胺酯類化學(xué)衍生試劑RBS，RBS 衍生化單氰胺選擇性好，副產(chǎn)物少，衍生化反應(yīng)較為快速及靈敏。高效液相色譜-質(zhì)譜檢測技術(shù)應(yīng)用廣泛，檢測范圍也較廣，還可改善樣品的分離度，靈敏度和準確度也得到提高，由此建立了RBS 柱前衍生高效液相色譜-質(zhì)譜法，用于檢測葡萄和番茄中的單氰胺殘留量。試驗結(jié)果表明，該方法具有選擇性好、靈敏度高、衍生化時間短、檢測限低等優(yōu)點，可對番茄和葡萄中的單氰胺殘留量進行批量檢測。建立食品中單氰胺殘留量的檢測方法，具有不可或缺的意義，同時有著較為廣闊的應(yīng)用前景。