郭 帥，盧家君，孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室 呼和浩特 010018）

益生菌是在適當劑量下給宿主帶來健康好處的活的微生物[1]。典型的益生菌為乳酸桿菌和雙歧桿菌。近年來，人們對益生菌的研究逐年增加，其中雙歧桿菌是益生菌領域的一個重要研究方向[2]。本研究所用菌株——乳雙歧桿菌Probio-M8 是從中國健康婦女母乳中分離得到的一株具有潛在益生特性的雙歧桿菌，具有治療便秘和腹瀉，抑制幽門螺桿菌生長，緩解和治療冠心病，緩解哮喘，緩解或治療旅行性腹瀉等益生功效[3-7]。然而，益生菌存活率較低，如何有效提高益生菌的存活率問題是目前研究人員面臨的巨大挑戰(zhàn)。

膠囊化被定義為將活性物質(zhì)包裹在淀粉、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)載體基質(zhì)中的過程[8-9]，是保護益生菌免受惡劣條件影響的一種強有力的方法[10-11]。在微膠囊化方法中，噴霧干燥是益生菌微膠囊化最古老和最常用的技術之一。國外學者Maciel 等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)，噴霧干燥過程中，通?？赏ㄟ^添加特定的組分來增強細胞保護，脫脂乳粉中含有的乳糖及乳蛋白在乳酸菌噴霧干燥過程中發(fā)揮了主要的保護作用，可以防止干燥過程中水分散失導致的細胞膜泄露。此外，脫脂乳中的蛋白質(zhì)可以通過穩(wěn)定細胞膜成分來防止細胞損傷，當與乳鈣相互作用時，它們可以在細菌細胞壁上形成保護涂層[13]。谷氨酸鈉作為重要壁材，主要是通過其氨基和微生物蛋白質(zhì)的羧基之間的反應來穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[14]。麥芽糊精為高分子化合物，具有良好的乳化特性及成膜特性，干燥過程中在菌體表面形成保護層，可以減少細胞與氧氣的接觸面積以及因細胞壁損壞而造成的胞內(nèi)物質(zhì)外泄[15]。先前的研究報道了單一保護劑并不能滿足菌體抵抗外界惡劣環(huán)境所需的條件，而在復合保護劑中，由于各種保護劑成分的在干燥過程中具有附加或協(xié)同保護作用，因此比單一成分能更好地保護微生物[16-17]。

本試驗的主要目的是評價不同壁材對真空低溫噴霧干燥技術制備乳雙歧桿菌Probio-M8 微膠囊的影響，通過對微膠囊粉的一些物理性質(zhì)的測定，以及對細胞膜完整性的、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和抗氧化能力的研究，選擇一種適合于真空低溫噴霧干燥制備乳雙歧桿菌Probio-M8 微膠囊的壁材，為乳雙歧桿菌Probio-M8 的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試菌株乳雙歧桿菌Probio-M8（Probio-M8）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳酸菌菌種資源庫（Lactic acid bacteria collection center,LABCC）提供。

1.2 試劑與儀器

改良MRS 培養(yǎng)基 （MRS 培養(yǎng)基+0.50 g/L 的L-半胱氨酸鹽酸鹽） 購自英國Oxoid 公司；脫脂乳、麥芽糊精、谷氨酸鈉、熒光染料LIVE/DEAD 細菌細胞活性測定試劑盒L7012，美國Invitrogen 公司。

YC-2000 真空低溫噴霧干燥機，上海雅程儀器設備有限公司；TM4000PLUS 掃描電鏡，日本株式會社日立高新技術那珂事業(yè)所；DSC25 型差示掃描量熱儀，美國TA 公司；Synergy H1 酶標儀，美國BioTek 公司；DM4000B 正置熒光顯微鏡，德國Leica 公司；HD-3A 型智能水分活度測量儀，無錫市華科儀器儀表有限責任公司；水分測定儀，上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化培養(yǎng)、收集 將冷凍保存（-80℃）的Probio-M8 菌種接入已滅菌的改良MRS 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h，再以2%的量接入到已滅菌的改良MRS 培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3 代，獲得處于穩(wěn)定期的Probio-M8，再將菌液以4 500×g、4 ℃離心15 min，用PBS 清洗2 次，棄上清，收集菌泥。

1.3.2 噴霧干燥 前期試驗已經(jīng)完成對5 種壁材（脫脂乳、麥芽糊精、谷氨酸鈉、海藻糖、阿拉伯膠）制備乳雙歧桿菌Probio-M8 微膠囊的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)單一保護壁材脫脂乳、麥芽糊精、谷氨酸鈉保護效果優(yōu)于海藻糖和阿拉伯膠，脫脂乳、麥芽糊精、谷氨酸鈉質(zhì)量分數(shù)均為10%時保護效果較好，復合保護壁材為脫脂乳質(zhì)量分數(shù)為13%、麥芽糊精為10%、谷氨酸鈉7%時保護效果最好。因此本試驗選取這4 種保護壁材進行噴霧干燥，噴霧干燥條件如表1。

表1 真空低溫噴霧干燥條件Table 1 Vacuum low temperature spray drying conditions

1.3.3 活菌計數(shù)及存活率計算 以改良MRS 瓊脂培養(yǎng)基為計數(shù)培養(yǎng)基，采用稀釋平板菌落計數(shù)法。菌體存活率計算公式：

式中，N——干燥后樣品單位體積活菌數(shù)，CFU/g；N0——干燥前樣品單位體積活菌數(shù)，CFU/g。

1.3.4 微膠囊粉末的物理性質(zhì)

1.3.4.1 水分含量及水分活度的測定 取3～5 g微膠囊粉劑，使用全自動水分測定儀測定微膠囊粉劑水分含量。利用智能水分活度儀測量樣品的水分活度，具體操作為：取適量脫脂乳均勻鋪平托盤，測定并預熱，然后稱取適量樣品，均勻鋪平托盤并進行測定。

1.3.4.2 微膠囊粉末的松密度和振實密度 根據(jù)Yoha 等[18]描述的方法測定松密度（ρL）和振實密度（ρT）。振實密度是將約2 g 益生菌粉末倒入空的10 mL 量筒中，將樣品重量m（kg）除以量筒中測量的體積VL（m3）計算得到松密度。振實密度是通過將量筒中的樣品輕敲200 次以達到恒定體積，將樣品質(zhì)量m 除以量筒中測量的體積VT計算得到振實密度。計算公式如（2）和（3）：

微膠囊粉末的流動性由松密度和振實密度使用公式（4）和（5）計算：

式中，HR——豪斯納比；CI——卡爾指數(shù)，%。

1.3.4.3 溶解度 微膠囊粉的溶解度根據(jù)Seth等[19]描述的方法進行估算。取2 g 樣品分別溶于50 mL 水中并完全溶解，然后以3 000 r/min、4 ℃下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中并稱重。此外，上清液置于105 ℃的熱空氣烘箱中完全干燥，然后稱重。根據(jù)質(zhì)量差異計算每個樣品的溶解度。

1.3.4.4 再水合時間 根據(jù)Lavanya 等[20]的方法分析微膠囊粉的復水能力。將2 g 樣品加入50 mL雙蒸水中，并在室溫下使用磁力攪拌器攪拌。記錄完全再水化所需的時間。

1.3.5 細胞膜完整性 本試驗用熒光染料LIVE/DEAD 細菌細胞活性測定試劑盒L7012 對菌細胞染色，用來表征不同保護壁材對Probio-M8 菌體細胞膜完整度的影響。具體操作如下：分別取1.5 μL PI 工作液和SYTO 9 工作液加入到1 mL 菌懸液中，振蕩混勻后室溫下避光孵育15 min，孵育完成后，取2 μL 處理后的待測樣品滴加到載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 形態(tài)特征觀察 取少許微膠囊粉均勻的涂抹于置于黏有導電的膠性物質(zhì)樣品臺上，吹去多余的膠囊微粒，然后在鍍金機中鍍金，再將制備好的樣品置于掃描電鏡下，設置電壓為15 kV，通過調(diào)節(jié)探頭與樣品之間的距離，并選取合適的放大倍數(shù)來獲取樣品的掃描電子顯微鏡圖像。

1.3.7 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度 準確稱取5 mg 微膠囊粉，并將其密封置于差示掃描量熱儀（DSC）專用鋁盤中，并采用空鋁盒作為對照，隨后放入DSC中，并另取一空鋁盤作為對照。設置溫度范圍為-40 ℃至100 ℃進行程序升溫，升溫速率為10 ℃/min，獲得樣品的熱性質(zhì)曲線。

1.3.8 抗氧化能力

1.3.8.1 總抗氧化能力的測定 用總抗氧化能力測定試劑盒對Probio-M8 干燥后樣品的羥自由基清除能力進行3 次重復測定。

1.3.8.2 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力的測定 首先用95%的乙醇將DPPH粉配置成0.1 mmol/L 溶液，然后取2 mL 待測樣品，加入8 mL 的DPPH 溶液作為試驗組，并在2 mL 95%乙醇溶液中加入8 mL 的DPPH 溶液作為對照組，再將2 mL 待測樣品與8 mL 乙醇溶劑混合作為空白組，以消除樣品本身和乙醇混合產(chǎn)生的誤差。試驗組、空白組及對照組置于無光處靜置30 min，于波長517 nm 處測定吸光度。

式中，A1——試驗組吸光度值；A2——空白組吸光度值；A3——對照組吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Probio-M8 微膠囊存活率

圖1為脫脂乳、麥芽糊精、谷氨酸鈉、復合壁材4 種壁材對Probio-M8 的保護效果。由圖可知，以脫脂乳、麥芽糊精、谷氨酸鈉、復合壁材為壁材的微膠囊存活率分別為68.85%，68.62%，67.46%和73.8%。其中以復合壁材為壁材的微膠囊存活率顯著高于其它3 組（P<0.05），說明不同種類的壁材組合對Probio-M8 微膠囊存活率有較好的保護作用。其次為以脫脂乳為壁材的微膠囊，脫脂乳在噴霧干燥過程中保護細胞活力的有效性與乳糖和乳蛋白的存在有關，乳糖和乳蛋白可能與益生菌的細胞膜相互作用，防止膜在脫水過程中破裂。使用不同的微膠囊壁材會影響益生菌細胞的生存能力，這與Pinto 等[21]的研究一致。

圖1 不同壁材對Probio-M8 微膠囊粉末存活率的影響Fig.1 Effects of different wall materials on the survival rate of Probio-M8 microcapsules powders

2.2 水分含量及水分活度

水分活度和含水量是衡量噴霧干燥微膠囊性能的重要理化性質(zhì)。有研究表明，水分含量強烈影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和益生菌在儲存過程中的生存能力，高水分活度表明食物系統(tǒng)中有更多的游離水可供生化反應進行，從而導致保質(zhì)期縮短[22-23]。表2給出了不同保護壁材的微膠囊粉末的平均含水量值及水分活度值，分別在4.65%～6.10%和0.17～0.20 之間變化，谷氨酸鈉能與水密切作用，所以谷氨酸鈉作為壁材的微膠囊粉水分含量最高[24]。一般來說，干燥產(chǎn)品的水分含量和水分活度越低，其穩(wěn)定性越好，然而對于益生菌產(chǎn)品，過低的水分含量（<2%）和水分活度（<0.1）會影響細胞膜性質(zhì)，從而抑制細胞代謝，這反過來會降低儲存期間的細胞存活力[25]。據(jù)報道，微膠囊的水分含量和水分活度分別為5%和0.3 左右時具有良好的儲存穩(wěn)定性[26]。綜上，壁材為脫脂乳、麥芽糊精以及復合壁材的微膠囊粉均保持了適當?shù)乃趾退只疃取?/p>

表2 Probio-M8 微膠囊粉末的水分含量及水分活度Table 2 Moisture content and water activityof Probio-M8 microcapsules powders

2.3 微膠囊粉末的流動性

豪斯納比（HR）和卡爾指數(shù)（CI）可以解釋微膠囊粉末流動性[27]，對于干燥粉末來說，HR 和CI值越低，粉末流動性越好，以獲得更好的流動性來延長其保存期。圖2顯示了真空低溫噴霧干燥下不同保護壁材微膠囊的的流動特性，通過對4 種保護壁材進行比較后發(fā)現(xiàn)，復合壁材、脫脂乳、谷氨酸鈉和麥芽糊精的作為壁材微膠囊粉HR 值分別為1.56，1.84，2.01，1.99。4 種微膠囊粉對應的CI 值分別為36.24%，45.28%，49.66%，49.55%。以復合壁材為壁材的微膠囊粉表現(xiàn)出較小的HR 和CI 值，說明將不同保護壁材按一定比例混合作為復合保護壁材表現(xiàn)出優(yōu)異的流動性。

圖2 不同Probio-M8 微膠囊粉豪斯納比和卡爾指數(shù)Fig.2 Hausner ratio and Carr’s index of different Probio-M8 microcapsule powders

2.4 微膠囊粉末的溶解度和再水合時間

由圖3可知，復合壁材、脫脂乳、谷氨酸鈉和麥芽糊精的微膠囊粉溶解度分別是78.75%，90.85%，91.50%，91.75%，4 種壁材對應的微膠囊粉的再水合時間分別為78.9，75.3，42，62.4 s。復合壁材的微膠囊粉溶解度顯著低于其它3 種保護壁材的微膠囊粉（P<0.05），其它3 種保護壁材的微膠囊粉的溶解度之間無顯著差異（P>0.05）。再水合能力與溶解度成正比，溶解度增加需要更少的時間來啟動表面再水合。因此，復合壁材的微膠囊粉再水合時間也高于以谷氨酸鈉和麥芽糊精為壁材的微膠囊粉（P<0.05），然而和以脫脂乳粉為壁材的微膠囊粉之間無顯著差異（P>0.05），這可能是由于復合壁材是一種復合型保護劑，物質(zhì)組成較為復雜，從而降低了微膠囊粉的溶解度和再水合能力。

圖3 不同Probio-M8 微膠囊粉溶解度和再水合時間Fig.3 The solubility and rehydration time of different Probio-M8 microcapsule powder

2.5 細胞膜完整性

細胞膜的完整性是維持細胞存活和代謝活性的關鍵因素[28]，對抵抗外界不良環(huán)境發(fā)揮著至關重要的作用。本試驗用SYTO 9 和碘化丙錠（PI）兩種不同的核酸染色劑來區(qū)分活細胞和死細胞，SYTO 9 是膜可滲透的，通常會對群體中的所有細胞進行染色，菌體呈現(xiàn)綠色熒光，而PI 只能進入膜受損的細胞菌體呈現(xiàn)紅色[29]。本試驗采用SYTO 9 和PI 染料對真空低溫噴霧干燥得到的4種不同壁材微膠囊的菌體細胞膜完整性進行測定，結(jié)果如圖4所示。

正如Gong 等[30]所報道，噴霧干燥過程會對細菌細胞膜的完整性產(chǎn)生不利的影響。Arepally 等[31]也通過研究發(fā)現(xiàn)，在噴霧干燥過程中，益生菌細胞會受熱和脫水，導致膜損壞，甚至失活。圖4顯示出的發(fā)出紅色熒光的菌體即為細胞膜受損導致失活的菌體。此外，不同的包埋壁材對菌體有不同的保護效果。以脫脂乳、麥芽糊精、復合壁材為保護壁材的微膠囊，發(fā)出紅色熒光的菌體明顯少于以谷氨酸鈉為保護壁材的微膠囊，說明以脫脂乳、麥芽糊精、復合壁材為保護壁材對菌體細胞膜完整性有較好的保護作用，以復合壁材為保護壁材的微膠囊菌體密度相較于其它3 組的菌體密度較大，而紅色熒光有所減少，說明復合壁材對細胞膜完整性有更好的保護作用。

圖4 壁材對噴霧干燥后Probio-M8 細胞膜完整性的影響Fig.4 Effects of wall materials on cell membrane integrity of Probio-M8 after spray-drying

2.6 形態(tài)特征觀察

微膠囊粉末的表面形態(tài)對益生菌的復水性和儲存穩(wěn)定性有直接影響[32]。圖5顯示了4 種不同保護壁材的微膠囊粉在不同放大倍數(shù)下獲得的SEM 顯微照片。根據(jù)Lian 等[33]的說法，除了壁材料的化學性質(zhì)不同之外，它們還具有不同的物理性質(zhì)（導熱性、熱擴散性），這可能在噴霧干燥過程中對包封的細胞產(chǎn)生不同程度的保護作用。由圖可知，使用不同的保護壁材，微膠囊的的形態(tài)并沒有明顯的差異，均表現(xiàn)出球形和各種尺寸，粒度直徑為5～10 μm，并帶有凹陷和表面皺縮，而沒有裂紋或裂隙的跡象，這表明壁材載體將菌體細胞完全包裹在里面，降低了菌體細胞對外界環(huán)境中氧氣的脅迫作用，穩(wěn)定了菌體細胞的活性。有研究表明，噴霧干燥工藝參數(shù)對微膠囊形態(tài)和粒度產(chǎn)生直接的影響，如噴嘴類型、霧化壓力和進料速度[34]。

圖5 Probio-M8 微膠囊SEM 圖Fig.5 SEM pictogram of Probio-M8 microcapsules

2.7 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度

玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）定義為非晶體系從玻璃態(tài)變?yōu)橄鹉z態(tài)的溫度，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度對噴霧干燥產(chǎn)品非常重要，因為它與產(chǎn)品的物理（黏性和結(jié)塊）和結(jié)構(gòu)（孔隙塌陷、質(zhì)地和再水合能力的變化）穩(wěn)定性以及儲存時發(fā)生的生物化學（脂質(zhì)氧化、基于酶反應的質(zhì)地或顏色變化）反應直接相關[35-36]，當物質(zhì)低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，體系內(nèi)的分子由于受到外界的束縛，其分子流動性較低，與外界基本不發(fā)生反應。因此，當食品處于玻璃態(tài)貯藏時，具有較好的貯藏穩(wěn)定性。4 種不同保護壁材的DSC熱流曲線如圖6所示，以脫脂乳、麥芽糊精、谷氨酸鈉、復合壁材為壁材的微膠囊粉的Tg分別為183.06，208.10，158.75，181.80 ℃，4 種保護壁材均表現(xiàn)出較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，這對益生菌微膠囊制劑的穩(wěn)定性和儲存帶來十分有利的影響。

圖6 Probio-M8 微膠囊DSC 掃描圖Fig.6 DSC thermograph of Probio-M8 microcapsules

2.8 抗氧化能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的有機基團，DPPH 溶液在波長517 nm 處有很強的吸收峰，具有特征性顏色紫色。當加入抗氧化物質(zhì)時，來自抗氧化劑的1 個電子與穩(wěn)定的DPPH·電子配對，因此，DPPH 的特征紫色變淡，抗氧化劑的濃度越高，DPPH 溶液的顏色越淺，可根據(jù)加入抗氧化劑前后DPPH 溶液吸光度值的變化來確定物質(zhì)的抗氧化能力，不同壁材的益生菌微膠囊制劑對DPPH 自由基的清除能力及總抗氧化能力結(jié)果見圖7。復合壁材、脫脂乳、谷氨酸鈉和麥芽糊精保護的Probio-M8 的DPPH 自由基清除能力分別為59.95，33.90，17.38和16.94，4 種菌體對應的總抗氧化能力分別是6.38，4.60，1.54，1.85 U/mL。脫脂乳的Probio-M8總抗氧化能力和DPPH 自由基的清除能力均高于其它壁材保護的Probio-M8,說明復合壁材Probio-M8 菌體的抗氧化能力有較好的保護作用。

圖7 壁材對噴霧干燥后Probio-M8 抗氧化能力的影響Fig.7 Effects of wall materials on antioxidant capacity of Probio-M8 after spray-drying

3 結(jié)論

本試驗研究了不同壁材對真空低溫噴霧干燥技術制備乳雙歧桿菌Probio-M8 微膠囊的影響，通過對微膠囊粉的理化性質(zhì)和存活率的測定，并對其形態(tài)進行了研究。試驗結(jié)果表明，復合壁材的Probio-M8 微膠囊粉末表現(xiàn)出較高的存活率，且具有較低的水分含量和水分活度，粉末流動性也優(yōu)于其它3 種壁材保護的Probio-M8，然而由于復合壁材組分復雜，其溶解度較低且再水合時間較長。此外，復合壁材保護的Probio-M8 細胞膜的完整性高于其它3 種壁材保護的Probio-M8，有效的保護了菌體細胞膜的完整性，并且具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和較好的抗氧化能力，對微膠囊粉的貯存穩(wěn)定性有極大的提高。本試驗通過對不同壁材對真空低溫噴霧干燥技術制備乳雙歧桿菌Probio-M8 微膠囊研究，對工業(yè)化生產(chǎn)高質(zhì)量的Probio-M8 菌劑有良好的指導作用。