張一帆，逄金柱，米麗娟，李依璇

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100183 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系（營養(yǎng)與健康研究院） 北京 100083 3 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司 北京 101107）

腦是一切認(rèn)知功能、調(diào)節(jié)功能的樞紐，是人類一切生命活動的最高中樞[1-2]。嬰幼兒出生后的12個月內(nèi)是其大腦發(fā)育的關(guān)鍵時期，大腦的結(jié)構(gòu)、功能、容量和連通性等發(fā)育迅速[3]。足月出生的嬰兒平均大腦體積僅為成人大腦平均體積的三分之一，在3月齡前，其體積會以4%/d 的速度增長，3月齡后減小到1%/d，在1 歲時腦容量翻倍[4-5]。在這段腦發(fā)育的黃金時期，嬰幼兒的營養(yǎng)供給十分重要。

母乳是嬰兒最佳的營養(yǎng)來源，嬰幼兒配方奶粉的營養(yǎng)成分應(yīng)最大程度地與母乳接近，以滿足嬰幼兒生長發(fā)育的需要[6]。目前的嬰幼兒配方奶粉的基本組成成分是模擬母乳設(shè)計的，可以基本滿足嬰幼兒對蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及維生素和礦物質(zhì)等微量元素的需求[7]。然而，二者在脂肪酸結(jié)構(gòu)、氨基酸組成以及低聚糖的種類及組成上仍有較大差異，因此母乳喂養(yǎng)與人工喂養(yǎng)仍有較大差異。在腦發(fā)育方面，母乳喂養(yǎng)更有利于嬰兒的神經(jīng)和大腦發(fā)育。李霞[8]的研究發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)的嬰兒精神發(fā)育指數(shù)（MDI）、運(yùn)動發(fā)育指數(shù)（PDI）指數(shù)均顯著高于人工喂養(yǎng)的嬰兒。開發(fā)一款適合嬰幼兒腦發(fā)育的配方奶粉十分重要。

目前，主流的促進(jìn)腦發(fā)育的嬰幼兒配方是在奶粉中添加二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（AA），二者對嬰幼兒的視網(wǎng)膜和大腦功能具有重要的意義[9]。近年研究表明，5-羥色胺（5-HT）與腸道菌群對兒童的神經(jīng)系統(tǒng)與腦發(fā)育同樣具有重要的意義[10]，如念珠菌、鏈球菌、腸球菌可以產(chǎn)生5-HT，同時海馬區(qū)內(nèi)5-HT 受體1A（5-HT1A）與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)[11-12]；5-HT 也是腸腦軸與腸道菌群相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，能影響大腦的信號傳導(dǎo)、情緒控制、學(xué)習(xí)與記憶力，同時也參與免疫功能[13]。根據(jù)GB 10765-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》的最新要求，奶粉中需要增加α-乳白蛋白以及某些氨基酸【色氨酸（Trp）、亮氨酸等】的含量，使其蛋白組成與氨基酸模式更接近母乳[14]。本研究通過增加α-乳白蛋白和色氨酸的含量以及調(diào)整總蛋白含量，設(shè)計開發(fā)一款升級版的嬰兒配方奶粉，探究其對新生大鼠腦發(fā)育的影響，為研發(fā)升級且更適合嬰幼兒生長發(fā)育的配方奶粉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠整窩鼠，7日齡，體重13～15 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SYXK（京）2017-0033。本試驗通過中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號：AW71302202-5-1。動物實驗室恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，每12 h 晝夜交替。

1.1.2 試驗原料 普通1 段嬰兒配方奶粉、升級嬰兒配方奶粉（蒙牛-雅士利、瑞哺恩），其主要成分見表1。

表1 不同嬰兒配方奶粉配方主要成分Table 1 Main ingredients of different infant formula

1.1.3 試劑 4%多聚甲醛通用型組織固定液，索萊寶生物科技有限公司；大鼠5-羥色胺（5-HT）ELISA 檢測試劑盒、大鼠5 羥基吲哚乙酸（5-HIAA）ELISA 檢測試劑盒；上海江萊生物有限公司；L-色胺酸，美國賽默飛世爾科技公司。

1.1.4 儀器 Multiskan FC 酶標(biāo)儀、Fresco21 冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技有限公司；Agilent 1290 Infinity 超高壓液相色譜儀、Agilent 6460 三重四極桿質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源（ESI），美國安捷倫科技公司；MS105DU 電子分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗方案 以30 只7日齡的SD 大鼠為實驗對象，隨機(jī)分為3 組，每組10 只子鼠與1只母鼠，每組子鼠雌、雄各半。實驗大鼠分為鼠乳喂養(yǎng)組（空白對照）、普通配方奶粉喂養(yǎng)組和升級配方奶粉喂養(yǎng)組（NZ 小試產(chǎn)品），兩種配方奶粉除α-乳白蛋白、色氨酸含量不同外，總能量、總蛋白及其它營養(yǎng)素的含量無顯著差異。將奶粉與水配制成22.5 g/100 mL 質(zhì)量濃度溶液，每次以0.4 mL/10 g BW 劑量灌胃實驗組大鼠，每4 h 灌胃1次（白天10：00、14：00、18：00 灌胃，10：00 須提前斷食4 h），晚上（18：00 至次日早上6：00）由母鼠自由喂奶。鼠房溫度22～24 ℃，濕度60%～70%，每日光照時間為8：30～20：30。預(yù)期喂飼21 d，測量大鼠生長發(fā)育指標(biāo)和神經(jīng)行為指標(biāo)，之后斷頸處死取臟器進(jìn)行檢測分析。

1.2.2 體質(zhì)量測量 測定SD 大鼠第0，7，14，21天的體質(zhì)量。

1.2.3 16 S rDNA 測序 采用CTAB 凍融法提取每組糞便樣品的總DNA，同時采用Nanodrop 對DNA 進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。然后通過PCR 擴(kuò)增目標(biāo)片段。采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫后上機(jī)進(jìn)行高通量測序。得到的測序數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量初篩，重測、補(bǔ)測問題樣本。通過篩選的原始序列按照index 和barcode 信息進(jìn)行文庫和樣本劃分，并去除barcode序列。按照QIIME2 dada2 分析流程去噪、OTU 聚類。測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對SD大鼠體質(zhì)量的影響

為評價不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對SD 大鼠生長發(fā)育的影響，對SD 大鼠的體質(zhì)量進(jìn)行測量。如圖1所示，實驗前各組大鼠初始體質(zhì)量無明顯差異，從第2 周開始，各組之間出現(xiàn)差異，且差異持續(xù)到實驗?zāi)┢?。隨著時間的推移，每組小鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)增加的趨勢，且普通配方奶粉組體質(zhì)量增加最快，而各組間無顯著差異，表明不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對SD 大鼠生長發(fā)育無影響。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化Fig.1 The body weight changes of rats in each group

2.2 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對SD大鼠臟器指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。為探究不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對SD 大鼠臟器發(fā)育的影響，對飼喂不同配方奶粉新生大鼠的臟器指數(shù)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，對于心臟、肺、腎和腦，各組之間臟器指數(shù)無顯著性差異（P>0.05）。對于肝臟，普通配方奶粉組的大鼠肝臟質(zhì)量較空白組顯著增加（P<0.05），較高的肝臟指數(shù)不利于健康，可能與肥胖與脂肪肝相關(guān)[15]。對于免疫器官，普通配方奶粉組的大鼠脾臟重量較空白組顯著增加（P<0.05），升級配方奶粉組的脾臟質(zhì)量雖最大，但與普通配方奶組相比無顯著性差異；升級配方奶粉組的大鼠胸腺質(zhì)量較空白組和普通配方奶粉組的大鼠顯著增加（P<0.05）。從臟器指數(shù)層面看，普通配方奶粉有助于脾臟免疫功能的提高（P<0.05）；而升級配方奶粉有助于胸腺免疫功能的提高（P<0.05）。

2.3 不同配方嬰兒奶粉對SD 大鼠血清5-HT、5-HIAA、Trp 含量的影響

5-HT 是一種存在于人體腦和消化道中的重要胞內(nèi)信使和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它首先由色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶生成5-HTP，然后經(jīng)5-羥色胺酸脫羧酶生成5-HT，5-HT 最終經(jīng)單胺氧化酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為5-羥吲哚乙酸 （5-Hydroxyindolacetic acid，5-HIAA）隨尿液排出體外。5-HT是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動的重要物質(zhì)，在血清和胃腸道中，5-HT 起到內(nèi)臟感覺、腸道蠕動、上皮分泌等作用。升級配方奶粉組5-HT 含量約為普通配方組的2倍，而較空白組相比，5-HT 含量無顯著差異，表明升級配方具有促進(jìn)大鼠內(nèi)臟感覺、腸道蠕動的潛力。5-HIAA 是5-HT 代謝終產(chǎn)物，升級配方奶粉組大鼠血清5-HIAA 含量顯著高于空白對照組和普通配方奶粉組（P<0.05）。普通配方奶粉組大鼠的血清5-HIAA 含量顯著低于空白對照組 （P<0.05）。升級配方奶粉組大鼠的血清Trp 含量最高，顯著高于普通配方奶粉組（P<0.05），而與空白對照組無顯著差異；普通配方奶粉組大鼠的血清Trp 含量顯著低于空白對照組（P<0.05）。綜上，升級配方奶粉對于提高大鼠血清5-HT 含量的效果優(yōu)于普通配方奶粉，更有利于大鼠的腸道蠕動。

圖2 大鼠臟器指數(shù)比較Fig.2 Comparison of organ index in rats

圖3 不同嬰兒配方奶粉對SD 大鼠血清5-HT、5-HIAA、Trp 含量的影響Fig.3 Effects of different infant formula on serum contents of 5-HT，5-HIAA and Trp in SD rats

2.4 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對SD大鼠間腦5-HT、5-HIAA、Trp 含量的影響

5-HT 在大腦中的濃度也很高，主要起到調(diào)節(jié)神經(jīng)活動的作用，5-HT4R 是5-HT 的受體之一，大腦皮層中的5-HT4R 受體與機(jī)體的學(xué)習(xí)能力和記憶能力有關(guān)，5-HT4R 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前膜、后膜中均有表達(dá)，具有強(qiáng)化學(xué)習(xí)記憶的功能。從各組大鼠間腦組織勻漿中5-HT、5-HIAA、Trp 含量來看，對于5-HT，升級配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HT 含量顯著高于空白對照組和普通配方奶粉組（P<0.05），約為普通配方奶粉組的2 倍，為空白對照組的1.5 倍；普通配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HT 含量顯著低于空白對照組（P<0.05）。升級配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HIAA 含量顯著高于空白對照組和普通配方奶粉組（P<0.05），普通配方奶粉組大鼠的間腦組織勻漿5-HIAA 含量顯著低于空白對照組（P<0.05）。各組間Trp 含量無顯著性差異（P>0.05）。由此可以說明升級配方奶粉對提高大鼠腦組織5-HT 含量的效果優(yōu)于普通配方奶粉，更有利于提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育。

2.5 不同蛋白質(zhì)和氨基酸配方嬰兒奶粉對SD大鼠腸道菌群的影響

2.5.1 Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)是可用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)。Shannon 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高；Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)可以用來代表菌群的豐度。Coverage 是指各樣本文庫的覆蓋率，數(shù)值越高，樣本中序列被測出的概率越高，該指數(shù)反映測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實情況。

圖4 不同嬰兒配方奶粉對SD 大鼠間腦組織5-HT、5-HIAA、Trp 含量影響Fig.4 Effects of different infant formula on the contents of 5-HT，5-HIAA and Trp in diencephalon tissue of SD rats

為研究各組大鼠腸道菌群的豐度及多樣性，對樣本進(jìn)行Alpha 多樣性分析，結(jié)果如表2所示，所有樣本的測序Coverage 指數(shù)均大于0.999，說明盲腸內(nèi)容物樣品中的序列基本都被測出，未被檢測到的概率較低，本次測序結(jié)果可以反映樣本的真實情況。其次，通過Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)可以看出，升級配方奶粉組的SD 大鼠腸道菌群多樣性顯著高于空白對照組與普通配方奶粉組。由ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)可以看出，空白對照組的SD 大鼠腸道菌群豐度最高，而普通配方奶粉組與升級配方奶粉組的SD 大鼠腸道菌群豐度水平接近。

表2 各組SD 大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of microorganism in cecal contents of SD rats in each group

2.5.2 Beta 多樣性分析 利用bry-curtis 的主坐標(biāo)分析法 （Principal coordinates analysis，PCoA）分析各組SD 大鼠腸道菌群β-多樣性。如圖5所示，各組SD 大鼠腸道菌群明顯存在獨(dú)立聚類，腸道群落具有顯著差異。第1 主成分為28.62%，第2主成分為18.01%。其中升級配方奶粉組沿PC1 與空白對照組的菌群組成更為接近。

圖5 不同組大鼠腸道菌群PCoA 分析Fig.5 PCoA analysis of intestinal flora of rats in different groups

2.5.3 微生物群落組成分析 為探究大鼠腸道菌群的群落組成，在門的水平上比較了各組微生物種群相對豐度，如圖6a所示，在門的水平上，優(yōu)勢菌群為厚壁菌門 （Firmicutes），放線菌門（Actinobacteriota），疣微菌門（Verrucomicrobiota）和擬桿菌門（Bacteroidota）。升級配方奶粉組的腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門豐度與空白對照組相比顯著降低（P<0.05）；升級配方奶粉組的腸道菌群中放線菌門豐度與普通配方奶粉組相比顯著升高（P<0.05）；升級配方奶粉組的腸道菌群中疣微菌門豐度雖較其它兩組高，但無顯著差異（P>0.05）。

如圖6b所示，在屬水平上比較了各組微生物種群相對豐度。在屬水平上，優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），庫特氏菌屬（Kurthia），阿克曼氏菌屬 （Akkermansia），葡萄球菌屬（Staphylococcus），氣球菌屬（Aerococcus），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。從圖6b 中可以看出，普通配方奶粉組的SD 大鼠腸道乳桿菌屬、氣球菌屬和棒狀桿菌屬與空白對照組相比顯著下降 （P<0.05），而飼喂升級配方奶粉可以一定程度上恢復(fù)其豐度。乳酸桿菌為人體有益菌，對人體身體健康有益；氣球菌屬和棒狀桿菌屬為條件性有害菌，通常情況下對人體有益，當(dāng)其豐度紊亂或轉(zhuǎn)移至其它器官時則會有害。圖6b 顯示，在兩種配方奶粉喂養(yǎng)后，其腸道中均出現(xiàn)了母乳喂養(yǎng)中含量極低的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）；升級配方奶粉組的阿克曼菌屬（AKK）顯著高于空白對照組和普通配方奶粉組。研究表明，AKK 在增加癌癥免疫治療效果、降脂和降血糖上有非常顯著的作用[16]。

圖6 各組大鼠腸道菌群群落組成Fig.6 Composition of intestinal flora community of rats in each group

不同配方奶粉喂養(yǎng)的SD 大鼠與母乳喂養(yǎng)的SD 大鼠腸道菌群組成相似，而在屬的水平上，不同屬的菌群豐度差異較大。相比于普通配方奶粉，升級配方奶粉更有利于SD 大鼠腸道菌群的穩(wěn)定以及腸道的生長發(fā)育。

3 討論

本文利用7日齡SD 大鼠模型來探討升級嬰幼兒配方奶粉對大鼠健康的影響。研究結(jié)果表明，飼喂升級嬰幼兒配方奶粉可以有效減輕由普通配方奶粉喂養(yǎng)導(dǎo)致的腸道菌群紊亂現(xiàn)象，提高有益菌AKK 的相對豐度，并顯著提高大鼠血清及腦組織5-HT 含量，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育及記憶認(rèn)知功能。

目前越來越多研究表明，腸道菌群對機(jī)體的神經(jīng)發(fā)育起著重要的作用[17]。在本研究中，通過16S rDNA 基因測序研究了升級配方奶粉與普通配方奶粉對幼鼠的腸道菌群影響。研究結(jié)果證明，升級配方奶粉的攝入可以調(diào)節(jié)腸道菌群菌落結(jié)構(gòu)至接近對照組水平，同時有益菌AKK 的豐度顯著增加。目前研究表明，腸道菌群與兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病息息相關(guān)，如注意缺陷多動障礙（Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）是兒童中較為常見的神經(jīng)和精神發(fā)育障礙性疾病，表現(xiàn)為活動過度、易沖動及注意力分散的行為[18]。患兒體內(nèi)與5-HT 代謝途徑存在異常，而5-HT 與ADHD兒童的攻擊、沖動等破壞性行為發(fā)生有關(guān)，腸道菌群組成與正常兒童具有顯著差異[19]。而腸道中的念珠菌、鏈球菌、腸球菌可產(chǎn)生5-羥色胺[11]，同時研究發(fā)現(xiàn)，孢子菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可增強(qiáng)腸道嗜鉻細(xì)胞內(nèi)5-HT 合成酶TPH1 的活性，促進(jìn)體內(nèi)5-HT 的合成[20]。本研究飼喂升級配方奶粉的大鼠在腸道菌群、血清5-HT 水平和腦組織5-HT 水平均與對照組更接近，而飼喂普通配方奶粉會引起紊亂，推測升級配方奶能通過介導(dǎo)腸道菌，恢復(fù)普通配方奶粉飼喂引起的5-HT 水平降低。升級配方奶粉雖對腸道菌群的調(diào)節(jié)具有積極的作用，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究中，升級嬰兒配方奶顯著改善了大鼠的腸道菌群、提高了血清及間腦組織中5-HT 及其代謝產(chǎn)物的含量，對生命早期的腸道和神經(jīng)發(fā)育有潛在的健康益處。本文為嬰幼兒配方奶粉的設(shè)計提供了新的思路，同時有必要進(jìn)一步確定升級配方中特定活性成分在調(diào)節(jié)腸道菌群、5-HT 代謝和炎癥相關(guān)信號通路中的作用，以探討其作用機(jī)制。

4 結(jié)論

添加α-乳白蛋白和色氨酸的升級嬰兒配方奶粉，能顯著增加新生大鼠腸道有益菌的豐度，增加血清和間腦組織中5-HT 及其代謝產(chǎn)物的含量，對腸道發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育有潛在的健康益處。